曹浩然，梁懿婷，黃金晨，張希成，施嘉怡，黃奕，何金波，李曼，余滋中，李國義

［1.湖北醫(yī)藥學(xué)院，湖北 十堰 442000；2.十堰市太和醫(yī)院（湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬醫(yī)院） 麻醉科，湖北 十堰 442000；3.十堰市太和醫(yī)院（湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬醫(yī)院） 耳鼻咽喉科，湖北 十堰 442000］

COVID-19 的出現(xiàn)導(dǎo)致全球范圍內(nèi)持續(xù)性腫瘤患者照護減少從而不可避免的出現(xiàn)患者死亡率增高。但是，我們可以采取更具創(chuàng)新性的解決辦法來加強公共衛(wèi)生和預(yù)防措施，輔助治療的手段可以從傳統(tǒng)的方法邁向基因靶向治療與預(yù)測的階段，因此對目標腫瘤診斷標志物的篩選與分析相關(guān)腫瘤患者的預(yù)后情況有著重要的研究目的。

CPEB4 是CPEB 家族的成員之一，定位于人染色體5q21，相對分子質(zhì)量為80021，長度為7 769 bp，編碼一段含729 個氨基酸殘基的多肽[1]。有研究證明CPEB4通過正向調(diào)節(jié)t-纖溶酶原激活劑/PLAT的翻譯，可作為促進腫瘤生長和進展的癌基因發(fā)揮作用[2]。CPEB4既可激活蛋白質(zhì)翻譯也可以抑制一些靶基因的翻譯，CPEB4 蛋白具有促進mRNA 的翻譯，影響細胞周期蛋白、細胞分裂、腫瘤細胞遷移和侵襲能力[3-4]。CPEB4結(jié)合的mRNA主要包括Ras信號通路中的相關(guān)分子、染色質(zhì)重塑相關(guān)蛋白、細胞周期蛋白、凋亡相關(guān)分子、壓力和炎癥相關(guān)因子、代謝酶及侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)基因等[5]。在如今越來越多的研究證明CPEB4與腫瘤的發(fā)生有著顯著的相關(guān)性，CPEB4的過表達存在于許多種類的腫瘤中，例如膠質(zhì)母細胞瘤（GBM）、胰腺癌（PAAD）、皮膚黑色素瘤(SKCM)、結(jié)直腸癌（CRC）、腎透明細胞癌(KIRC)、子宮內(nèi)膜癌(UCEC)等均存在過表達現(xiàn)象[6]。研究發(fā)現(xiàn)GBM 中CPEB4 表達與晚期和較短的總生存期相關(guān)且CPEB4表達上調(diào)與世界健康組織(WHO)分級、卡氏功能狀態(tài)評分標準（KPS）顯著相關(guān)，CPEB4 過表達促進了GBM 的進展，其高表達可促進GBM 細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移，而低表達可抑制細胞的轉(zhuǎn)移，故CPEB4 可能是一種更具侵襲性的GBM 表型的生物標志物[7-9]。研究發(fā)現(xiàn)胃腺癌（STAD）中CPEB4 低表達患者預(yù)后差于高表達患者，CPEB4還可以通過激活zeb1 介導(dǎo)的EMT 促進STAD 細胞的生長、侵襲和轉(zhuǎn)移，從而可能為癌癥患者的臨床新靶點的開發(fā)提供依據(jù)[10-11]。萬仁輝等[12]研究發(fā)現(xiàn)CPEB4 蛋白在多數(shù)CRC組織中呈陽性表達，其陽性表達可能與CRC的發(fā)生發(fā)展有一定相關(guān)性且陽性表達的CRC 患者預(yù)后較差。CPEB4在多種腫瘤中異常高表達，作為致癌因子在腫瘤生長、侵襲及血管生成中發(fā)揮作用，然而在肝癌和非小細胞肺癌中則相反[13-15]。因此需要整合33種腫瘤的突變數(shù)據(jù)和臨床數(shù)據(jù)等，對其一一進行精細分析并觀察CPEB4 蛋白在哪些腫瘤中有相關(guān)性亦或起正負反饋的作用。

筆者基于各領(lǐng)域腫瘤研究的基礎(chǔ)上，探究CPEB4 在各個腫瘤中的臨床病理特征與臨床預(yù)后價值，使用Meta分析共納入5類癌癥（1種GBM、1種STAD、2 種非小細胞肺癌（NSCLC）、2 種CRC、1 種KIRC癌）分別對其臨床數(shù)據(jù)進行整合，根據(jù)差異性摘選出有意義的結(jié)果并判斷結(jié)局指標是否具有參考價值；在泛癌差異分析中，拓展出更多的腫瘤中CPEB4 表達含量與其之間的深層關(guān)系并判斷在哪些腫瘤中與正常組織表達具有顯著差異，在哪些癌癥患者中具有較高的預(yù)后價值并探究是否可發(fā)展為臨床腫瘤病理分級診斷指標。

1 CPEB4 關(guān)于臨床腫瘤患者Meta 分析

1.1 Meta 分析資料與方法

1.1.1 文獻檢索途徑 綜合檢索在PubMed、知網(wǎng)、萬方、維普等數(shù)據(jù)庫中的文獻，選擇”CPEB4”AND “cancer”O(jiān)R “tumor”O(jiān)R“neoplasm”O(jiān)R“phyma”遵循《系統(tǒng)綜述和薈萃分析優(yōu)先報告條目》（PRISMA）［2］系統(tǒng)回顧，并手動查閱了相關(guān)的參考文獻以便精確化納入研究。

1.1.2 納入與排除標準 納入CPEB4 與癌癥相關(guān)的研究，根據(jù)文章是否有足夠的臨床患者病理情況的數(shù)據(jù)并遵循隨機對照試驗作為標準，導(dǎo)入文獻管理器篩選并刪除各數(shù)據(jù)庫的重復(fù)與缺失臨床相關(guān)數(shù)據(jù)的文獻。

1.1.3 數(shù)據(jù)提取與質(zhì)量評價 由兩人對16 篇文章提取出文章第一作者、國籍、發(fā)表年限、腫瘤類型、患者性別、患者數(shù)量、腫瘤分化程度、腫瘤情況、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移程度以及具體的TNM 分期進行篩選統(tǒng)計，如果出現(xiàn)分歧由第三方仲裁決定。為實現(xiàn)Meta 生存分析，對生存資料提取，獲取95%CI 的上下限和LogHR 值，計算出SE 標準值匯入表中。使用Engauge Digitizer10.8 軟件匯總相關(guān)腫瘤患者的生存（KM）曲線，直觀檢測出CPEB4 是否為一個良好的預(yù)后因素。采用Cochrane 評估工具從以下六個維度評估每個RCT的偏倚風(fēng)險：隨機序列的產(chǎn)生、分布隱藏、盲性、結(jié)果數(shù)據(jù)不完整、選擇性報告和其他偏倚［16］。

1.1.4 文獻篩選流程及納入結(jié)果 在數(shù)據(jù)庫中搜索出194 篇與CPEB4 和腫瘤相關(guān)的文獻，篩重后共排除132 篇重復(fù)文獻，對摘要、文章內(nèi)容、臨床數(shù)據(jù)進行審查后通過定性定量合成最后獲得16 篇文章納入Meta分析（圖1），包括1 949例腫瘤患者進行薈萃分析，研究的癌癥類型包括：KIRC、NSCLC、肺鱗狀細胞癌(LUSC)、GBM、CRC、結(jié)腸腺癌（COAD）、STAD。

圖1 文獻納入流程圖

1.2 Meta 分析研究結(jié)果

1.2.1 統(tǒng)計學(xué)分析 采用干預(yù)性系統(tǒng)評價中二分類變量對患者的腫瘤分化程度（圖2A）、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況（圖2B）、腫瘤直徑（圖2C）、TNM 分期（圖2D）與CPEB4 表達的關(guān)系進行定量合成，四組分析中控制組與對照組差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），均以（比值比）作為效應(yīng)量。用Review Manager 5.4 對數(shù)據(jù)進行薈萃分析，結(jié)果以森林圖進行展現(xiàn)，使用I2統(tǒng)計量和卡方檢驗［5］評估異質(zhì)性作為異質(zhì)性評價標準，采用固定效應(yīng)模型對單項研究合并效應(yīng)量及其相應(yīng)可信區(qū)間，若存在明顯異質(zhì)性（I2＞50%且P＜0.05），則采用隨機效應(yīng)模型。結(jié)果以P-value＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。為了評判是否具有發(fā)表偏倚，對納入10 篇文獻以上的研究［6］采用Begg's 和Egger's 檢驗對漏斗圖的對稱性進行定量分析。

圖2 CPEB4 與腫瘤分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤大小、TMN 分期的Meta 分析

1.2.2 CPEB4 表達與預(yù)后的關(guān)系 結(jié)果顯示CPEB4 在腫瘤高分化和中分化、同側(cè)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤最大徑＞5 并侵襲任一器官、TNM 分期為Ⅲ或Ⅳ分期表達含量較高，且結(jié)果屬于低異質(zhì)性（I2＜30%）具有較強可靠性。研究結(jié)果均為總體生存期（OS），利用Engauge Digitizer10.8 軟件從圖形中提取出七篇原始數(shù)據(jù)并繪制出KM 總生存曲線，以風(fēng)險比值（）作為時間事件結(jié)局指標，可觀測120 月內(nèi)CPEB4 高表達患者較低表達患者生存人數(shù)較少（圖3），CPEB4 為不良預(yù)后因素，但相關(guān)的研究臨床指標較少、文獻數(shù)量有限，結(jié)果還有待驗證。

圖3 CPEB4 表達與患者總生存的Meta 分析（HR）與生存曲線（OS）

1.3 腫瘤的單個差異分析驗證

提取癌癥基因組圖譜（TCGA）數(shù)據(jù)庫中的KIRC、CRC、GBM、STAD、NSCLC的臨床樣本，觀察CPEB4 表達含量在正常組樣本和腫瘤組樣本中的差異情況，驗證Meta分析的結(jié)果，5類數(shù)據(jù)皆顯示在正常樣本中基因表達含量呈上調(diào)趨勢（含量高）且差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）（圖4）。

圖4 CPEB4 在腫瘤組與相應(yīng)癌旁組中差異對比情況

1.4 小結(jié)

綜上所述，薈萃分析結(jié)果顯示CPEB4 呈高表達是不利于晚期的KIRC、CRC、GBM、STAD、NSCLC 患者預(yù)后的因素（=3.35；95%CI：2.69～4.18；P＜0.0001）；提取出文章中五個腫瘤信息，進行單個腫瘤差異分析（圖4），結(jié)果顯示在所有正常樣本中CPEB4 都呈高表達而腫瘤樣本中表達含量較少，但是對CPEB4于患者不同臨床分級和與免疫相關(guān)的表達尚且未知。為更深入的研究，我們從TCGA 數(shù)據(jù)庫中提取33 種癌癥的樣本對CPEB4 進行泛癌分析，對CPEB4 在不同腫瘤中的微觀分析與相關(guān)性比較。

2 TCGA 數(shù)據(jù)對CPEB4 泛癌分析

2.1 材料與方法

2.1.1 對數(shù)據(jù)庫信息進行提取與整理 以33 種類型癌癥為實驗對象，提取TCGA 數(shù)據(jù)庫與UCSC Xena 數(shù)據(jù)庫中臨床生存數(shù)據(jù)、腫瘤樣本中轉(zhuǎn)錄組基因表達數(shù)據(jù)和突變的數(shù)據(jù)，篩選掉不符合規(guī)定和缺失的數(shù)據(jù)，匯總出33 種腫瘤樣本與正常樣本的對照數(shù)據(jù)，接著從各腫瘤表達中將目標基因表達含量提取出，為后期分析做準備。

2.2 泛癌分析研究結(jié)果

2.2.1 CPEB4 泛癌差異分析 通過提取的基因表達數(shù)據(jù)對33 個腫瘤樣本與正常樣本中CPEB4 表達量繪制出差異圖（圖5）。其中膀胱移行細胞癌（BLCA）、乳腺浸潤性癌（BRCA）、膽管癌（CHOL）、COAD、食管癌（ESCA）、GBM、頭頸部鱗狀細胞癌（HNSC）、KIRC、腎乳頭狀細胞癌（KIRP）、肝細胞癌（LIHC）、LUAD、LUSC、前列腺腺癌（PRAD）、直腸腺癌（READ）、STAD、甲狀腺癌（THCA）、UCEC組織中CPEB4 呈下調(diào)趨勢，表達低于正常組織；此外與正常組織相比，腎嫌色細胞癌（KICH）中CPEB4 在腫瘤組織中呈上調(diào)趨勢，表達含量較高。以上結(jié)果表明，CPEB4在腫瘤組織與正常組織中表達含量差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。初步證實CPEB4 既可成為部分腫瘤的抑癌因子也可成為部分腫瘤的癌因子。

圖5 CPEB4 在泛癌中表達狀況與生存曲線

2.2.2 泛癌中CPEB4 表達與生存分析 對33 類癌癥臨床生存數(shù)據(jù)進行篩選，剔除掉生存數(shù)據(jù)信息缺失的患者，以中位基因表達為界限將患者劃分為高表達、低表達兩組，根據(jù)已有的隨訪總生存數(shù)據(jù)進行生存分析，篩選出高低表達差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）的癌癥患者數(shù)據(jù)。如圖5，在KIRC、肉瘤（SARC）、皮膚黑色素瘤（SKCM）中CPEB4 低表達的患者較低生存率較短；而葡萄膜黑素瘤（UVM）中CPEB4 高表達患者有著較低的生存率。

為確定數(shù)據(jù)的準確性，在Kaplan-Meier Plotter數(shù)據(jù)庫中，對泛癌進行生存數(shù)據(jù)繪圖。挑選出CPEB4高低表達差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）的癌癥患者的生存曲線（圖6）。BLCA、LUSC、ESCA、THCA中CPEB4 高表達不利于患者生存；卵巢癌（OV）、KIRC中CPEB4低表達不利于患者生存。

圖6 Kaplan-Meier Plotter 數(shù)據(jù)庫中生存曲線

為進一步驗證基因表達與患者生存相關(guān)的準確性，用Cox 分析觀測CPEB4 與患者生存狀態(tài)、較低生存率的相關(guān)性，森林圖對值可視化。CPEB4 在UVM、LUSC 中為高風(fēng)險基因（＞1）；SKCM、SARC、KIRC、腎上腺皮質(zhì)癌（ACC）為低風(fēng)險基因（＜1）。綜上所述，在UVM、BLCA、LUSC、ESCA、THCA的患者中CPEB4高表達為一不利預(yù)后因素；CPEB4高表達于OV、KIRC、SARC、SKCM患者為一良好的預(yù)后因素（圖7）。

圖7 Cox 分析（OS）

2.2.3 泛癌中CPEB4 表達與臨床相關(guān)性分析 從TCGA 數(shù)據(jù)庫提取納入研究的臨床數(shù)據(jù)，包括患者的年齡、性別、臨床分期、腫瘤大小、淋巴管浸潤程度，進行臨床相關(guān)性分析，設(shè)定P＜0.05 為有意義的觀測數(shù)據(jù)?？砂l(fā)現(xiàn)女性的CPEB4 表達量在HNSC、胸腺瘤（THYM）顯著比男性高（圖8A）；BLCA、BRCA、HNSC、KIRC、THCA 中的StageⅠ患者的基因表達量大多高于其他分期且差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），CPEB4 大量存在于早期患者腫瘤細胞中（圖8B）。

圖8 CPEB4 表達與臨床相關(guān)性分析

2.2.4 泛癌中CPEB4 表達與腫瘤突變負荷（TMB）的關(guān)系 TMB定義為腫瘤基因組編碼區(qū)體細胞突變的總數(shù)，從幾個到成千上萬[17]。近年來發(fā)現(xiàn)TMB 可用于預(yù)測免疫治療療效的獨立生物標記物，在免疫治療中的預(yù)測能力不僅限于NSCLC、SKCM 等“熱點腫瘤”，還能作為其它癌癥的生物標志物[18]。本研究旨在泛癌中分析CPEB4 表達與腫瘤突變的關(guān)系，結(jié)果以雷達圖顯示（圖9A）。其中以BLCA、BRCA、HNSC、LUAD、LUSC、胰腺癌（PAAD）、STAD、THYM 腫瘤中堿基數(shù)顯著突變，僅THYM 中基因表達與腫瘤突變負荷呈正相關(guān)，對免疫檢查點抑制的應(yīng)答反應(yīng)較好，可更好的預(yù)測免疫治療的療效。

圖9 腫瘤突變負荷與腫瘤MSI 微衛(wèi)星不穩(wěn)定分析

2.2.5 泛癌中CPEB4 表達與微衛(wèi)星不穩(wěn)定性（MSI）相關(guān)性分析 MSI 在大多實體瘤中為一個重要的分子生物標志物，有研究表明MSI 腫瘤微環(huán)境中淋巴細胞的浸潤增多，MSI 腫瘤患者能夠獲得更好的臨床緩解，延長較低生存率[19-20]。MSI腫瘤因存在高度突變的潛質(zhì)，突變基因編碼翻譯的蛋白可以成為有潛力的腫瘤抗原而被免疫系統(tǒng)識別并清除[21]，故推測MSI 可能與腫瘤微環(huán)境中免疫細胞相關(guān)并可預(yù)測免疫治療療效。如圖9B，在ACC、COAD、READ 中CPEB4 表達與MSI 呈正相關(guān)，說明在這些實體瘤中CPEB4 表達量越高腫瘤基因越有利于突變成腫瘤抗原基因；在BLCA、BRCA、DLBC、HNSC、LUSC、PRAD、SARC、STAD 中CPEB4 呈高表達不利于腫瘤的抗原突變。

2.2.6 泛癌中CPEB4 表達與腫瘤微環(huán)境的相關(guān)性分析 腫瘤微環(huán)境在腫瘤細胞生長中具有促進的作用但腫瘤微環(huán)境中也存在免疫細胞影響著癌細胞的增殖與擴散［22］。腫瘤細胞可以調(diào)控免疫細胞的代謝，進一步影響免疫細胞發(fā)育、分化與功能發(fā)揮，使其往促腫瘤型轉(zhuǎn)化，極大限制了抗腫瘤免疫活性。因此對腫瘤微環(huán)境的探究顯得十分重要。通過分析免疫細胞和基質(zhì)細胞的含量可預(yù)測非腫瘤細胞的浸潤。驗證腫瘤微衛(wèi)星不穩(wěn)定是否易被免疫系統(tǒng)識別，對22 種免疫細胞與基因表達關(guān)系進行分析，篩選出與基因表達相關(guān)的免疫細胞（圖10）。

圖10 免疫細胞相關(guān)性分析

因此驗證出CPEB4 在腫瘤中與免疫細胞相關(guān)性，BRCA、COAD、LIHC、LUAD、STAD、THCA、THYM、GBM等在CPEB4高表達時易被免疫系統(tǒng)識別，證明CPEB4在上述腫瘤中對腫瘤生長擴散有抑制作用；UVM、SKCM、TGCT、PRAD、ACC、BLCA、CHOL、CESC、LUSC、KIRC、HNSC 等在CPEB4 低表達時易被免疫細胞識別并抑制腫瘤生長擴散。

2.2.7 泛癌中CPEB4 與免疫和腫瘤基因的共表達分析 為更確切的說明CPEB4 在腫瘤中的表達量與免疫相關(guān)，篩選出47 個免疫相關(guān)基因，對其共表達分析（如圖11）。在UVM、THYM、UCEC、TGCT、SKCM、READ、PRAD、LUSC、LUAD、LAML、DLBC、COAD 中CPEB4 與免疫基因表達量呈正向調(diào)控；THCA、STAD、THCA、STAD、SARC、PCPG、PAAD、LIHC、LGG、KIRC、KICH、HNSC、GBM、BRCA、BLCA中CPEB4與免疫基因呈負向調(diào)控關(guān)系，不利于機體對腫瘤的免疫。進一步證明CPEB4 參與腫瘤免疫系統(tǒng)的調(diào)控。

2.2.8 GSEA 富集分析結(jié)果 運用R 語言包提取GSEA 數(shù)據(jù)庫中對于GO 富集的數(shù)據(jù)，篩選出GO 富集功能相近的前5 個通路，對差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）的通路進行可視化且校正FDP（P＜0.25），因此CPEB4 通過五個通路功能調(diào)節(jié)每個腫瘤的發(fā)生。在STAD、OV、SKCM、LUAD、COAD、BRCA中與CPEB4 表達正相關(guān)的基因較活躍，通路峰值向上，說明基因表達越高功能越活越；GBM、LGG、ACC 中與基因表達負相關(guān)的差異基因富集在通路上，故CPEB4高表達時功能通路越沉默（圖12）。

圖12 CPEB4 泛癌GSEA 富集通路

3 CPEB4 蛋白表達于正常細胞的位置

通過HPA 數(shù)據(jù)庫中特異性抗體與細胞中CPEB4 蛋白的免疫熒光染色，檢測到CPEB4 蛋白主要定位于核質(zhì)體、高爾基體，其次定位于囊泡中（圖13），故猜測CPEB4 在正常組織的細胞中可能參與細胞基因表達、蛋白質(zhì)的加工運輸，調(diào)控細胞內(nèi)蛋白正常表達。

圖13 對抗體、細胞核、微管、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)進行免疫熒光染色并觀察

4 結(jié)論

通過以上對CPEB4相關(guān)臨床、基因突變等數(shù)據(jù)的整理與Meta 泛癌聯(lián)合分析。Meta 分析中發(fā)現(xiàn)CPEB4上調(diào)表達在KIRC、NSCLC、GBM、CRC、STAD的患者中，并且成為一個不利的預(yù)后因素。由于CPEB4在癌癥中扮演矛盾的角色，例如胰腺導(dǎo)管腺癌（PDAC）和GBM 中的致癌啟動子，但HCC 中的腫瘤抑制因子[23]。為驗證CPEB4 表達在早期樣本上調(diào)，但在晚期癌癥中降低的結(jié)論，筆者采用單個腫瘤差異分析強化薈萃分析的結(jié)果，都顯示在早期樣本CPEB4 蛋白含量高于晚期腫瘤樣本。為了更進一步探究CPEB4在腫瘤中的臨床價值，筆者實施泛癌腫瘤突變負荷與免疫相關(guān)的分析并與免疫相關(guān)基因共表達分析，結(jié)果統(tǒng)計僅在ACC、READ、THYM、BRCA、COAD、LIHC、LUAD、STAD、THCA、GBM、UVM、UCEC、睪丸生殖細胞腫瘤（TGCT）、SKCM、PRAD、LUSC、急性髓性白血?。ˋML）、彌漫性細胞淋巴瘤（DLBCL）中CPEB4 蛋白高表達有助于增高免疫細胞的數(shù)量（尤在THYM、COAD、LUAD、READ 中最為顯著）。在腫瘤分級系統(tǒng)中顯示CPEB4低表達會伴隨著腫瘤分級越高，意味著患者的危險因素隨之上升。綜上所述CPEB4 可作為上述腫瘤患者良好的預(yù)后因素。