劉亞楠，陳文燕，賈小慧

1 臨汾市人民醫(yī)院兒科，山西臨汾 041000；2 臨汾市人民醫(yī)院檢驗科

新生兒肺炎（neonatal pneumonia，NP）是新生兒時期常見的呼吸系統(tǒng)疾病，近年NP患病率呈上升趨勢，病死率為5%～20%，已成為目前新生兒死亡的重要病因之一[1-2］。早期診斷和治療可有效降低NP患者的病死率。因此，尋找新的檢測指標(biāo)來預(yù)測預(yù)后，對改善NP 患者的生活質(zhì)量具有重要意義。研究[3］發(fā)現(xiàn)，炎癥反應(yīng)在NP 的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用[3］。環(huán)狀核糖核酸（circular ribonucleic acid，circRNA）作為一類不具備5＇和3＇末端的新型非編碼RNA，以共價鍵形成閉合環(huán)狀結(jié)構(gòu)，參與調(diào)控炎癥 反 應(yīng)[4］。circ_0038467 是 新 近 發(fā) 現(xiàn) 的 一 種circRNA。最新研究[5］發(fā)現(xiàn)，有實驗報道抑制circ_0038467 能減弱肺炎鏈球菌誘導(dǎo)的人肺細胞炎癥反應(yīng)。腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子（tumor necrosis factor receptor-associated factor，TRAF）1 是一種細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)因子，能通過激活多條信號通路促進機體的炎癥反應(yīng)[6］。動物實驗發(fā)現(xiàn)，重癥肺炎模型小鼠血清TRAF1 水平升高[7］。目前，血清circ_0038467、TRAF1 對NP 預(yù)后的預(yù)測效能相關(guān)研究報道較少。為此，我們觀察了NP 患者血清circ_0038467、TRAF1 的水平變化，進一步分析血清circ_0038467、TRAF1 對NP 預(yù)后不良的預(yù)測效能?，F(xiàn)將結(jié)果博報告如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2020 年1 月—2022 年1 月本院收治的80 例NP 患者（NP 組）。NP 組納入標(biāo)準(zhǔn)：①患者家屬或監(jiān)護人簽署同意書；②符合第五版《實用新生兒學(xué)》[7］NP 診斷標(biāo)準(zhǔn)：①有宮內(nèi)感染（如胎膜早破＞24 小時、母親發(fā)熱、母親絨毛膜羊膜炎、母親陰道B 族鏈球菌感染及定植等）、分娩過程感染（胎兒分娩過程吸入陰道內(nèi)被病原體污染的分泌物、斷臍不潔）、生后感染（接觸呼吸道感染患者）史；（②臨床表現(xiàn)：生后有氣促、呻吟、呼吸費力、呼吸暫停、發(fā)紺等；③肺部呼吸音粗糙或減低，約半數(shù)可聞及濕啰音；④X 線：雙肺可見點狀、片狀或大小不一、不對稱浸潤影。⑤日齡1～28 d。排除標(biāo)準(zhǔn)：①早產(chǎn)兒；②存在新生兒呼吸窘迫綜合征、新生兒濕肺、新生兒胎糞吸入綜合癥；③合并其他感染性疾??；⑧氣道、肺、膈肌、心臟先天畸形；⑤醫(yī)院感染。NP 組中女30例、男50 例；胎齡37～42 周（39.50 ± 0.90）周；出生體 質(zhì)量2.46～4.53 （3.47 ± 0.37）kg；日 齡1～28（11.65 ± 5.28）d；確診后根據(jù)病情嚴(yán)重程度[7］分為病情較輕（不需要呼吸支持或僅需鼻導(dǎo)管吸氧）50例和病情較重（需要無創(chuàng)或有創(chuàng)呼吸支持）30 例。另選取同期80 名健康新生兒為對照組，女32 例、男48 例；胎齡37～42（38.31 ± 1.04）周；出生體質(zhì)量2.55～4.32（3.46 ± 0.38）kg；日齡1～28（12.10 ±4.63）d。兩組性別、胎齡、出生體重和日齡具有可比性。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2 兩組血清circ_0038467、TRAF1 檢測 收集NP 患者確診時和對照組體檢時3 mL 股靜脈血，3 000 r/min 離心15 min 后留取上層血清，部分血清使用TRIzol 試劑盒提取總RNA，經(jīng)紫外分光光度儀器鑒定純度和完整性合格后，使用TaKaRa逆轉(zhuǎn)錄試劑盒逆轉(zhuǎn)錄為cRNA。然后使用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴增儀（按照實時熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)試劑盒說明書，以β-actin為內(nèi)參，以2-ΔΔCT代表circ_0038467相對表達量。circ_0038467上游引物5'-TCTGTTTAATGTGACCGCAACAA-3'、下游引物5'-CGAAATTCTGGTGCTGTGGTG-3'；β-actin 上 游 引 物5'-CTTCGCGGGCGACGAT-3'、下 游 引 物 5'-CCACATAGGAATCCTTCTGACC-3'；反應(yīng)總體積：cDNA 1μL、上下游引物各2.5 μL、2×Hieff? Robust PCR Master Mix 10 μL、ddH2O 加至總體積25 μL；循環(huán)參數(shù)：94 ℃ 3 min 1 次，94℃ 10 s、55 ℃ 20 s、72 ℃ 30 s 35次。剩余部分血清使用酶聯(lián)免疫吸附試劑盒檢測血清TRAF1。實驗均重復(fù)測算3次，取平均值。

1.3 資料收集方法 收集NP患者性別、胎齡、分娩方式、出生體重、日齡、病程、病情嚴(yán)重程度、超敏C反應(yīng)蛋白（hypersensitive C-reactive protein，hs-CRP）和降鈣素原（procalcitonin，PCT）等資料。并參考第五版《實用新生兒學(xué)》接受治療，包括抗感染治療、呼吸支持、營養(yǎng)療法、液體療法和并發(fā)癥治療。治療7～10 d時根據(jù)是否出現(xiàn)氣胸、膿胸、肺不張、胸腔積液、心力衰竭、中毒性腦病、化膿性腦膜炎、敗血癥等并發(fā)癥或死亡判定預(yù)后。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 選用SPSS28.0 統(tǒng)計學(xué)軟件進行數(shù)據(jù)處理。正態(tài)性分析采用K-S 檢驗，呈正態(tài)分布的計量資料以±s表示，兩組比較用t檢驗；采用Pearson 相關(guān)性分析法分析NP 患者血清circ_0038467 與TRAF1 水平的相關(guān)性；以病情嚴(yán)重程度（重 癥/輕 癥=1/0）、hs-CRP、PCT、circ_0038467、TRAF1（連續(xù)變量均原值錄入）為自變量，預(yù)后（不良/良好=1/0）為因變量，采用多因素Logistic回歸分析法分析NP預(yù)后不良的影響；繪制受試者工作特征曲線（receiver operating characteristic，ROC）分析血清circ_0038467、TRAF1 水平對NP 預(yù)后不良預(yù)測效能。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組血清circ_0038467、TRAF1水平比較 NP組、對照組血清circ_0038467 分別為4.19 ± 1.14、1.50 ± 0.43，TRAF1 分 別 為（34.96 ± 11.80）、（12.56 ± 4.06）pg/mL。與對照組相比，NP 組血清circ_0038467、TRAF1 水 平 高（t分 別 為19.800、16.051，P均＜0.05）。病情較輕、病情較重NP患者血清circ_0038467分別為3.60 ± 0.83、5.18 ± 0.86，TRAF1分別為（28.79 ± 9.07）、（45.23 ± 8.10）pg/mL。與病情較輕者相比，病情較重的NP患者血清circ_0038467、TRAF1水平高（t分別為8.099、8.165，P均＜0.05）。

2.2 NP 患者血清circ_0038467 與TRAF1 水平的相關(guān)性 NP 患者血清circ_0038467 與TRAF1 水平呈正相關(guān)（r=0.713，P＜0.001）。

2.3 NP 患者預(yù)后不良的單因素分析 80 例NP 患者分為預(yù)后不良21 例和預(yù)后良好59 例。預(yù)后不良患者中，男12 例，女9 例；胎齡（38.48 ± 0.81）周；順產(chǎn)14 例，剖腹產(chǎn)7 例；出生體質(zhì)量（3.39 ± 0.25）kg；日齡（11.48 ± 5.90）d；病程（4.19 ± 1.44）d；病情嚴(yán)重程度：輕癥6 例，重癥15 例；血清hs-CRP（17.68 ±2.91）mg/L；血清PCT（0.58 ± 0.19）ng/mL；血清circ_0038467 為5.10 ± 1.12；血清TRAF1（43.80 ±8.70）pg/mL。預(yù)后良好患者中男38 例，女21 例；胎齡（38.51 ± 0.94）周；順產(chǎn)36 例，剖腹產(chǎn)23 例；出生體質(zhì)量（3.50 ± 0.40）kg；日齡（11.71 ± 5.10）d；病程（4.02 ± 1.51）d；病情嚴(yán)重程度：輕癥44 例，重癥15 例；血清hs-CRP（15.35 ± 2.84）mg/L；血清PCT（0.44 ± 0.17）ng/mL；血清circ_0038467 為3.87 ±0.96；血清TRAF1（31.81 ± 11.19）pg/mL。預(yù)后不良 的NP 患 者 重 癥 比 例 和hs-CRP、PCT、circ_0038467、TRAF1 水 平 高 于 預(yù) 后 良 好 者（P均＜0.05）， NP患者預(yù)后不良的多因素Logistic回歸分析結(jié)果見表1。由表1可見， 病情較重和血清超敏C反應(yīng)蛋白水平升高、血清降鈣素原水平升高、血清circ_0038467 水平升高及血清TRAF1 水平升高為NP患者預(yù)后不良的獨立危險因素（P均＜0.05）。

表1 NP患者預(yù)后不良的多因素Logistic回歸分析結(jié)果

2.4 血清circ_0038467、TRAF1 水平及二者聯(lián)合對NP 預(yù)后不良的預(yù)測效能評估價值 血清circ_0038467、TRAF1 水平及二者聯(lián)合對NP 預(yù)后不良的ROC 結(jié)果見表2。血清circ_0038467、TRAF1水平單獨和聯(lián)合評估NP 患者不良的曲線下面積 （area under the curve，AUC）為0.796、0.788、0.865。

表2 血清circ_0038467、TRAF1水平及二者聯(lián)合對NP預(yù)后不良的診斷效能

3 討論

NP 是指胎兒出生后短期內(nèi)出現(xiàn)的肺部感染性疾病，通常因為產(chǎn)前、產(chǎn)時或出生后支原體、病毒、真菌和細菌等病原體感染引起，以發(fā)熱、氣促、咳嗽、發(fā)紺、肺部濕啰音等為主要臨床表現(xiàn)[9］。NP 主要因病原體侵入肺部后，通過直接損傷和宿主異常免疫應(yīng)答反應(yīng)引起肺部結(jié)構(gòu)和功能損害所致，由于新生兒呼吸器官和功能不成熟，肺炎持續(xù)加重極易引起肺內(nèi)肺外組織免疫損傷，導(dǎo)致氣胸、膿胸、肺不張、胸腔積液、心力衰竭、中毒性腦病、化膿性腦膜炎、敗血癥等甚至死亡[10-11］。盡管近年來抗生素治療和呼吸、營養(yǎng)和液體等支持治療取得一定進展，但重癥NP患者往往已出現(xiàn)肺內(nèi)和肺外臟器嚴(yán)重?fù)p害，預(yù)后仍然較差[12］。因此及時評估NP 患者病情嚴(yán)重程度和預(yù)后對促進其預(yù)后改善具有重要意義。

炎癥反應(yīng)失控是NP發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵機制，支氣管、肺泡、肺間質(zhì)受到病原體侵入后能激活先天免疫系統(tǒng)，通過產(chǎn)生免疫效應(yīng)因子維持肺臟免疫微環(huán)境穩(wěn)態(tài)，但隨著炎癥反應(yīng)增強可導(dǎo)致肺部免疫穩(wěn)態(tài)失控，并加劇肺內(nèi)和肺外組織損害[3］。circRNA 是一類分布廣泛具有環(huán)狀結(jié)構(gòu)和高穩(wěn)定性的非編碼，能通過與微小RNA（microRNA，miRNA）相互作用或競爭，調(diào)控mRNA 表達和功能，進而參與NP 等多種疾病過程[13-14］。circ_0038467 是一種具有促炎作用的circRNA，LIU 等[15］首次報道，circ_0038467 在脂多糖誘導(dǎo)人支氣管上皮樣細胞炎癥模型中升高，敲除circ_0038467能抑制Janus激酶/信號傳導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子3途徑抑制其炎癥反應(yīng)。后續(xù)敲除circ_0038467能靶向miR-495-3p/髓樣分化初級應(yīng)答基因88 和miR-195-5p/Toll樣受體4/核因子-κB（nuclear factor-κB，NF-κB）途徑，抑制支氣管上皮樣細胞炎癥反應(yīng)和凋亡[16-17］。上述研究提示，circ_0038467 在肺部炎癥中發(fā)揮重要作用。然而關(guān)于血清circ_0038467 與NP患者病情和預(yù)后的關(guān)系尚未可知。

TRAF 是一類多功能細胞內(nèi)信號接頭分子家族，其家族成員能與下游分子相互作用激活炎癥信號通路，誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)[18］。TRAF1 是TRAF 家族中唯一不含TRAF 結(jié)構(gòu)的N-末端鋅指結(jié)構(gòu)域成員，在所有組織中均有表達，能與腫瘤壞死因子受體2 形成異二聚體復(fù)合物，激活NF-κB、絲裂原活化蛋白激酶8/Janus 激酶等信號通路，促進炎癥發(fā)生發(fā)展[19］。實驗研究指出，敲除TRAF1 基因能通過抑制Janus激酶、NF-κB信號通路改善緩解骨關(guān)節(jié)炎、類固醇抵抗型哮喘等炎癥疾病進展[20］。上述研究表明，TRAF1 具有促炎作用。TRAF1 在腫瘤壞死因子- α誘導(dǎo)的小鼠肺部炎癥中升高。敲除TRAF1 能通過抑制NF-κB 信號通路，減少脂多糖誘導(dǎo)的小鼠肺部炎癥反應(yīng)[7］。因此我們推測，TRAF1可能與NP 患者病情和預(yù)后有關(guān)。

本研究結(jié)果顯示，NP 患者血清circ_0038467、TRAF1 水平升高，重癥NP 患者血清circ_0038467、TRAF1 水平進一步升高，是預(yù)后不良的獨立危險因素。說明血清circ_0038467、TRAF1 水平升高與病情加重有關(guān)，并且會增加NP患者預(yù)后不良風(fēng)險。其原因可能是血清circ_0038467 水平升高能激活Janus激酶/信號傳導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子3、髓樣分化初級應(yīng)答基因88、Toll 樣受體4/NF-κB 等炎癥信號通路[15-17］，TRAF1水平升高也能激活Janus激酶、NF-κB等炎癥信號通路[7］，增強炎癥反應(yīng)，加劇肺內(nèi)、肺外組織炎癥損傷并誘導(dǎo)其凋亡，進而導(dǎo)致病情加重和預(yù)后不良。本研究結(jié)果還發(fā)現(xiàn)，NP 患者血清circ_0038467 與TRAF1 水平呈正相關(guān)，這提示血清circ_0038467、TRAF1 水平可能共同影響NP 患者病情嚴(yán)重程度和預(yù)后。最近XIA 等[21］實驗也指出，敲除circ_0038467 能靶向miR-545-3p 下調(diào)TRAF1 表達，進而抑制體外NP 細胞模型炎癥和細胞凋亡。進一步佐證了本研究結(jié)果。最后本研究通過繪制ROC曲線發(fā)現(xiàn)，血清circ_0038467、TRAF1 水平為4.08、33.67 pg/ml 時，評估NP 患者預(yù)后不良的AUC 為0.796、0.788，血清circ_0038467、TRAF1 水平聯(lián)合評估的AUC 為0.865，大于circ_0038467、TRAF1 水平單獨評估。這說明血清circ_0038467、TRAF1 水平可能成為NP患者預(yù)后輔助評估指標(biāo)，且聯(lián)合檢測血清circ_0038467、TRAF1水平能提升評估價值。

綜上所述，NP 患者血清circ_0038467、TRAF1水平升高，并與病情嚴(yán)重程度有關(guān)，血清circ_0038467、TRAF1 可能協(xié)同促進NP 的發(fā)生發(fā)展。血清circ_0038467、TRAF1 水平是預(yù)后不良的獨立危險因素，血清circ_0038467、TRAF1 水平聯(lián)合預(yù)測NP 預(yù)后不良的價值較高，可能成為NP 患者預(yù)后的輔助評估指標(biāo)。