徐銳，李燕燕，徐紅

1 新疆維吾爾自治區(qū)人民醫(yī)院老年醫(yī)學(xué)中心，烏魯木齊 830000；2 新疆維吾爾自治區(qū)人民醫(yī)院心臟外科

隨年齡增加人類(lèi)逐漸出現(xiàn)骨骼肌質(zhì)量、肌力及功能的下降，這種在老年人群中普遍存在而又極易被忽視的臨床病征被稱(chēng)為老年肌肉衰減綜合征，簡(jiǎn)稱(chēng)肌少癥。肌少癥患者常出現(xiàn)平衡能力下降、跌倒及骨折等，嚴(yán)重影響老年人的生活質(zhì)量，同時(shí)給社會(huì)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。數(shù)據(jù)[1］顯示，2050年全世界肌少癥患者將超過(guò)5億。既往研究[2］認(rèn)為，肌少癥的發(fā)生發(fā)展可能與運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元退化或丟失、蛋白質(zhì)合成下降或異常、性激素水平降低、炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激、肥胖、腸道菌群、胰島素抵抗、心力衰竭、及糖尿病等慢性消耗性疾病有關(guān)。最新研究發(fā)[3］現(xiàn)，肌少癥的發(fā)生與線(xiàn)粒體自噬相關(guān)。線(xiàn)粒體自噬是指線(xiàn)粒體通過(guò)自噬溶酶體系統(tǒng)降將功能障礙的線(xiàn)粒體進(jìn)行降解，從而達(dá)到對(duì)線(xiàn)粒體的質(zhì)量控制，避免機(jī)體受到線(xiàn)粒體損傷所帶來(lái)的不良后果[4］。線(xiàn)粒體自噬減弱后，受損的線(xiàn)粒體在細(xì)胞內(nèi)囤積，產(chǎn)生大量的活性氧簇（ROS），激活泛素—蛋白酶體系統(tǒng)，最終影響骨骼肌的蛋白代謝，故線(xiàn)粒體自噬在骨骼肌的穩(wěn)態(tài)平衡調(diào)控中發(fā)揮重要作用[5-6］。我們前期研究[7］發(fā)現(xiàn)，肌少癥大鼠的骨骼肌線(xiàn)粒體自噬信號(hào)通路 AMPK/ULK1 表達(dá)下調(diào)，線(xiàn)粒體自噬水平降低。但線(xiàn)粒體自噬在老年肌少癥發(fā)病中的確切病理生理機(jī)制仍不明確。因此，識(shí)別更多的與肌少癥發(fā)病相關(guān)的線(xiàn)粒體自噬靶點(diǎn)基因，有助于研究老年肌少癥發(fā)病的具體作用機(jī)制，從而對(duì)肌少癥進(jìn)行早期診斷，進(jìn)一步制訂個(gè)體化的診療方案。為此，2023年1—11月，我們基于數(shù)據(jù)庫(kù)數(shù)據(jù)篩選與肌少癥發(fā)病相關(guān)的線(xiàn)粒體自噬靶點(diǎn)基因，并觀(guān)察其在骨骼肌組織中的表達(dá)變化，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 與肌少癥發(fā)病相關(guān)的線(xiàn)粒體自噬差異表達(dá)基因篩選

1.1.1 肌少癥發(fā)病的差異表達(dá)基因篩選 在基因表達(dá)數(shù)據(jù)庫(kù)（Gene expression omnibus，GEO）搜索“肌少癥”，篩選得到GSE1428 和GSE136344 基因表達(dá)圖譜，GSE1428 基因表達(dá)圖譜（實(shí)驗(yàn)平臺(tái)為 GPL96）包含10 例正常青年的骨骼肌組織和12 例肌少癥患者的骨骼肌組織轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)。GSE136344基因表達(dá)圖譜（實(shí)驗(yàn)平臺(tái)為 GPL5175）包含11 例正常青年的骨骼肌組織和19 例肌少癥患者的骨骼肌組織的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)。使用GEO2R 軟件匯總兩個(gè)GSE1428 和GSE136344基因表達(dá)圖譜中所有肌少癥發(fā)病的差異表達(dá)基因，使用R 軟件limma 包篩選肌少癥發(fā)病的差異表達(dá)基因（PValue＜0.05，∣logFC∣＞1）。

1.1.2 線(xiàn)粒體自噬相關(guān)基因篩選 以“線(xiàn)粒體自噬”為關(guān)鍵詞，從GeneCard 數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行檢索，篩選相關(guān)性評(píng)分＞1分的線(xiàn)粒體自噬相關(guān)基因。

1.1.3 與肌少癥發(fā)病相關(guān)的線(xiàn)粒體自噬差異表達(dá)基因篩選 使用“VennDiagram”包將肌少癥發(fā)病的差異表達(dá)基因與線(xiàn)粒體自噬相關(guān)基因取交集，最終得到與肌少癥發(fā)病相關(guān)的線(xiàn)粒體自噬差異表達(dá)基因。

1.2 與肌少癥發(fā)病相關(guān)的線(xiàn)粒體自噬差異表達(dá)基因的生物學(xué)功能分析 使用R 軟件“clusterProfiler”包運(yùn)用基因本體論（Gene ontology，GO）和京都基因與基因百科全書(shū)（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）通路富集分與肌少癥發(fā)病相關(guān)的線(xiàn)粒體自噬差異表達(dá)基因的生物學(xué)功能。 富集閾值設(shè)置為 FDR ＜ 0.05，并將富集結(jié)果進(jìn)行可視化。GO 分析分別從生物過(guò)程 （Biological process，BP）、細(xì)胞成分（Cellular component，CC）和分子功能（Molecular function，MF）對(duì)差異基因進(jìn)行富集。

1.3 與肌少癥發(fā)病相關(guān)的線(xiàn)粒體自噬靶點(diǎn)基因篩選 將與肌少癥發(fā)病相關(guān)的線(xiàn)粒體自噬差異表達(dá)基因?qū)隨TRING 網(wǎng)站（https：//www. string-db. org），繪制差異表達(dá)基因的蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)（Protein-Protein Interaction Networks，PPI），置信度為 0.4（Confidence=0.4），去除離散的蛋白。

通過(guò)Cytoscape 軟件中的MCODE 插件對(duì)PPI 互作用網(wǎng)絡(luò)中的蛋白進(jìn)行功能模塊分析。利用Cytoscape中的cytoHubba插件采用Degree算法對(duì)與肌少癥發(fā)病相關(guān)的線(xiàn)粒體自噬差異表達(dá)基因進(jìn)行賦分，選出排名前10 的基因即為與肌少癥發(fā)病相關(guān)的線(xiàn)粒體自噬靶點(diǎn)基因。

1.4 與肌少癥發(fā)病相關(guān)的線(xiàn)粒體自噬靶點(diǎn)基因驗(yàn)證 用GSE136344基因表達(dá)圖譜為驗(yàn)證數(shù)據(jù)集，收集與肌少癥發(fā)病相關(guān)的線(xiàn)粒體自噬靶點(diǎn)基因在肌少癥、健康查體者骨骼肌組織中的表達(dá)資料，采用ggplot2 包并繪制靶點(diǎn)基因功能相似的箱型圖驗(yàn)證與肌少癥發(fā)病相關(guān)的線(xiàn)粒體自噬靶點(diǎn)基因，P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 與肌少癥發(fā)病相關(guān)的線(xiàn)粒體自噬差異表達(dá)基因篩選結(jié)果 從GEO2R 軟件中篩選肌少癥發(fā)病的差異表達(dá)基因2 242個(gè)，其中表達(dá)上調(diào)的基因30個(gè)、表達(dá)下調(diào)的基因2 212 個(gè)。從GeneCards 軟件中得到線(xiàn)粒體自噬相關(guān)基因845 個(gè)。二者取交集后最終得到與肌少癥發(fā)病相關(guān)的線(xiàn)粒體自噬差異表達(dá)基因99 個(gè)，包括線(xiàn)粒體內(nèi)膜蛋白基因（Inner membrane protein， IMMT）、動(dòng)態(tài)蛋白1 樣蛋白基因（Dynamin 1 Like，DNM1L）、ATP 合酶F1 亞基α 基因（ATP Synthase F1 Subunit Alpha，ATP5A1）等。

2.2 與肌少癥發(fā)病相關(guān)的線(xiàn)粒體自噬差異表達(dá)基因的生物學(xué)功能 KEGG 分析結(jié)果顯示，與肌少癥發(fā)病相關(guān)的線(xiàn)粒體自噬差異表達(dá)基因主要富集于神經(jīng)變性途徑—多種疾?。╬athways of neurodegeneration-multiple diseases）信號(hào)通路、帕金森疾?。≒arkinson disease）信號(hào)通路、朊毒體?。╬rion disease）信號(hào)通路等。GO分析結(jié)果顯示，與肌少癥發(fā)病相關(guān)的線(xiàn)粒體自噬差異表達(dá)基因主要富集在能量代謝、細(xì)胞呼吸、氧化磷酸化調(diào)節(jié)等生物學(xué)過(guò)程，主要定位于線(xiàn)粒體內(nèi)膜、線(xiàn)粒體內(nèi)部的大分子蛋白質(zhì)復(fù)合物等，參與調(diào)節(jié)跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)活性等分子功能。

2.3 與肌少癥發(fā)病相關(guān)的線(xiàn)粒體自噬靶點(diǎn)基因篩選的結(jié)果及驗(yàn)證 成功構(gòu)建一個(gè)共有58 個(gè)節(jié)點(diǎn)、124 條相互作用線(xiàn)的與肌少癥發(fā)病相關(guān)的線(xiàn)粒體自噬靶點(diǎn)基因蛋白質(zhì)的PPI 網(wǎng)絡(luò)圖（見(jiàn)圖1）。與肌少癥發(fā)病相關(guān)的線(xiàn)粒體自噬靶點(diǎn)基因?yàn)椋壕€(xiàn)粒體內(nèi)膜蛋白基因（Inner membrane protein，IMMT）、動(dòng)態(tài)蛋白1 樣蛋白基因（Dynamin 1 Like，DNM1L）、ATP 合酶F1 亞 基α 基 因（ATP Synthase F1 Subunit Alpha，ATP5A1）、 ATP 合酶 F1 亞基β 基因（ATP synthase F1 β subunit，ATP5B）、細(xì) 胞 色 素C1 基 因（Cytochrome c-1，CYC1）、 泛醌氧化還原酶核心亞基 S1基因（Ubiquinone oxidoreductase core subunit S1，NDUFS1）、泛醌氧化還原酶亞基A9 基因（Ubiquinone oxidoreductase subunit A9，NDUFA9）、蘋(píng)果酸脫氫 酶1 基 因（Cytosolic Malate dehydrogenase 1，MDH1）、異檸檬酸脫氫酶3α 基因（Subunit of isocitrate dehydrogenase 3，IDH3A）、泛醌細(xì)胞色素c 還原酶復(fù)合物核心蛋白1基因（Ubiquinol-cytochromecreductase core protein 1，UQCRC1）。與正常骨骼肌組織相比，肌少癥患者骨骼肌組織中IMMT、DNM1L表達(dá)降低（P均＜0.05）。

圖1 與肌少癥發(fā)病相關(guān)的線(xiàn)粒體自噬靶點(diǎn)基因蛋白質(zhì)的PPI圖

3 討論

我國(guó)已進(jìn)入老齡化社會(huì)，老年肌少癥不僅嚴(yán)重影響患者生活質(zhì)量，還成為當(dāng)今社會(huì)的嚴(yán)重的社會(huì)問(wèn)題。肌少癥發(fā)病機(jī)制尚不明確，有研究[3］顯示線(xiàn)粒體自噬參與肌少癥的發(fā)病。線(xiàn)粒體自噬功能紊亂是各種骨骼肌肉疾患的潛在病因之一，通過(guò)調(diào)節(jié)線(xiàn)粒體自噬能維持骨骼肌穩(wěn)態(tài)，但線(xiàn)粒體自噬相關(guān)通路在骨骼肌中發(fā)病機(jī)制中的作用尚有爭(zhēng)議[9］。雖然許多研究在細(xì)胞或動(dòng)物模型中顯示線(xiàn)粒體自噬對(duì)骨骼肌有保護(hù)作用，但大型臨床試驗(yàn)[10］尚未能證明改善線(xiàn)粒體自噬治療在肌少癥中的效果。肌少癥的發(fā)病機(jī)制非常復(fù)雜，單一的機(jī)制無(wú)法解釋其生理病理學(xué)改變，因此尋找肌少癥患者線(xiàn)粒體自噬的相關(guān)生物學(xué)標(biāo)志物，在進(jìn)一步了解肌少癥組的發(fā)病機(jī)制及尋找治療方案中意義重大。

本研究采用生物信息學(xué)分析方法對(duì)GEO 數(shù)據(jù)庫(kù)GSE1428 數(shù)據(jù)集基因表達(dá)圖譜進(jìn)行分析，篩選出99 個(gè)與肌少癥發(fā)病相關(guān)的線(xiàn)粒體自噬差異表達(dá)基因。GO 富集結(jié)果顯示這些基因主要參與能量代謝、細(xì)胞呼吸、氧化磷酸化能量代謝等過(guò)程。KEGG富集分析結(jié)果顯示，目標(biāo)蛋白主要參與神經(jīng)變性途徑-多種疾病信號(hào)通路、帕金森疾病通路等，上述通路均涉及神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病。肌少癥與神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病均為老年人常見(jiàn)疾病，肌少癥與帕金森病的發(fā)病具有相關(guān)性，且相互影響。帕金森病合并肌少癥患者較不合并肌少癥者更易出現(xiàn)運(yùn)動(dòng)量減少、步態(tài)減慢、日常生活能力下降，這嚴(yán)重影響此類(lèi)患者生活質(zhì)量[11］。肌少癥與神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病常伴隨發(fā)生，提示兩種疾病可能存在有共同的發(fā)病機(jī)制，但尚不明確。有研究[12］顯示運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的減少可能參與了兩種疾病的共同發(fā)病。本研究發(fā)現(xiàn)線(xiàn)粒體自噬有可能參與了肌少癥與神經(jīng)變性疾病的共同發(fā)病，這為探索兩種疾病的共同發(fā)病機(jī)制提供一定的參考。本研究利用Cytoscape軟件對(duì)蛋白互作結(jié)果進(jìn)行分析，利用插件 CytoHubba鑒定了10 個(gè)與肌少癥發(fā)病相關(guān)的線(xiàn)粒體自噬靶點(diǎn)基因。最終經(jīng)過(guò)GSE136344 數(shù)據(jù)集驗(yàn)證最終確定IMMT、DNM1L可能參與肌少癥的發(fā)病。

IMMT是是一種關(guān)鍵的跨膜蛋白編碼基因，在線(xiàn)粒體功能、蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)、線(xiàn)粒體DNA 轉(zhuǎn)錄、三磷酸腺苷生成和細(xì)胞凋亡中起關(guān)鍵作用。IMMT下調(diào)、修飾或破壞將導(dǎo)致線(xiàn)粒體功能障礙和細(xì)胞死亡。IMMT與腫瘤、糖尿病心肌病、缺血再灌注等疾病的發(fā)生發(fā)展有關(guān)，目前尚無(wú)IMMT與肌少癥發(fā)病有關(guān)的相關(guān)報(bào)道[13-14］。本研究發(fā)現(xiàn)IMMT 為肌少癥發(fā)病的關(guān)鍵基因，這可能是因?yàn)镮MMT 與線(xiàn)粒體功能障礙有關(guān)。DNM1L為GTP 酶動(dòng)力蛋白超家族的一個(gè)成員，主要功能為編碼動(dòng)力蛋白相關(guān)蛋白1（Dynamin-related protein 1，Drp1）。Drp1 是鳥(niǎo)苷三磷酸水解酶動(dòng)力蛋白超家族的成員，能夠介導(dǎo)線(xiàn)粒體外膜分裂。此外，DNM1L還在很大程度上參與了線(xiàn)粒體自噬、運(yùn)動(dòng)、過(guò)氧化物酶體斷裂和細(xì)胞死亡[15-17］。有研究[18］顯示慢性腎功能不全患者常合并肌少癥，而慢性腎功能不全患者DNM1L含量明顯增高，這證實(shí)了DNM1L可能通過(guò)調(diào)節(jié)線(xiàn)粒體自噬參與了慢性腎功能不全患者肌少癥的發(fā)病。本研究顯示IMMT、DNM1L為肌少癥發(fā)病的關(guān)鍵基因，這可能是因?yàn)閮煞N基因均與線(xiàn)粒體功能密切相關(guān)，通過(guò)影響線(xiàn)粒體穩(wěn)態(tài)參與肌少癥發(fā)病。

綜上所述，與肌少癥發(fā)病相關(guān)的線(xiàn)粒體自噬差異表達(dá)基因共99個(gè)，與肌少癥發(fā)病相關(guān)的線(xiàn)粒體自噬差異表達(dá)基因可通過(guò)影響神經(jīng)變性途徑—多種疾病信號(hào)通路、帕金森疾病信號(hào)通路、朊毒體病信號(hào)通路等，調(diào)控能量代謝、細(xì)胞呼吸、氧化磷酸化調(diào)節(jié)等過(guò)程，參與調(diào)節(jié)跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)活性等分子功能。肌少癥患者骨骼肌組織中ATP5A1、 ATP5B低表達(dá)。ATP5A1、 ATP5B可能為與肌少癥發(fā)病相關(guān)的線(xiàn)粒體自噬靶點(diǎn)基因。