李驍瀚，王洪星，王璽龍，趙娜，劉治璞，張義

山東大學(xué)齊魯醫(yī)院檢驗科，濟(jì)南 250012

類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎（rheumatoid arthritis，RA）是一種常見的慢性炎癥性自身免疫性疾病，主要臨床特征為關(guān)節(jié)炎癥，可伴隨逐漸進(jìn)展的關(guān)節(jié)損傷[1］。成纖維樣滑膜細(xì)胞（fibroblast-like synoviocytes，F(xiàn)LS）是一種間充質(zhì)衍生細(xì)胞，可分泌滑液和關(guān)節(jié)軟骨的某些成分，參與滑膜的生理學(xué)功能。FLS是RA 滑膜炎癥和關(guān)節(jié)損傷的關(guān)鍵驅(qū)動因素[2］。與正?；ぶ蠪LS 相比，RA 滑膜中類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎成纖維樣滑膜細(xì)胞（RA-FLS）的遷移、侵襲功能異?；钴S[3］。在既往對于RA-FLS 的研究[4］常用人類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎成纖維細(xì)胞MH7A 替代RA-FLS 進(jìn)行后續(xù)實驗。研究[5］發(fā) 現(xiàn)，RA 組 織 中RA-FLS/MH7A 的COL1A1、fibronectin、α-SMA 等FMT相關(guān)基因mRNA 相對表達(dá)量均升高，說明RA-FLS 成纖維細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞 轉(zhuǎn) 化（fibroblast-to-myofibroblast transformation，F(xiàn)MT）可能在RA的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用。既往研究[6］發(fā)現(xiàn)，RA 患者滑膜組織中巨噬細(xì)胞的豐度與關(guān)節(jié)損傷程度以及局部關(guān)節(jié)高疾病活動性評分呈正相關(guān)。淋巴管內(nèi)皮受體-1（lymphatic vessel endothelial receptor-1，LYVE1）是透明質(zhì)酸結(jié)合蛋白超家族的一員，基因全長2 313 個堿基，可翻譯成由322 個殘基構(gòu)成的Ⅰ型完整跨膜糖蛋白，包含有212 個殘基構(gòu)成的糖基化胞外區(qū)、21 個殘基組成的跨膜錨定區(qū)和63 個殘基構(gòu)成的細(xì)胞質(zhì)尾3 個部分[10］。LYVE1主要在淋巴內(nèi)皮細(xì)胞[11］和巨噬細(xì)胞[12］中表達(dá)。最新[13］研究報道，相對于健康人及RA緩解期患者，RA患者滑膜組織中LYVE1+巨噬細(xì)胞，表達(dá)降低。既往研究僅發(fā)現(xiàn)LYVE1+巨噬細(xì)胞是一種傾向于M2表型的巨噬細(xì)胞，其在RA 發(fā)生發(fā)展中的具體作用機(jī)制目前尚未明確。為此，我們觀察了LYVE1+巨噬細(xì)胞在RA 患者關(guān)節(jié)滑膜組織中的表達(dá)變化及RA-FLS遷移、侵襲、FMT的抑制作用，探討LYVE1+巨噬細(xì)胞在RA 發(fā)生發(fā)展中的可能作用機(jī)制，旨在為RA 的治療提供新思路?，F(xiàn)將結(jié)果報告如下。

1 材料與方法

1.1 RA、OA 患者滑膜組織LYVE1+巨噬細(xì)胞檢測

1.1.1 臨床資料 RA 與OA 患者滑膜組織均來源于2022年10月—2023年10月期間于山東大學(xué)齊魯醫(yī)院關(guān)節(jié)外科手術(shù)中切除的病變組織。由于無法獲取健康人的滑膜組織，本研究根據(jù)以往的RA 滑膜研究經(jīng)驗，將OA 滑膜組織作為對照組[14］，并將受檢滑膜組織包埋于石蠟中保存。年齡（歲）：RA患者男14 例、女31 例，年齡（57.2 ± 4.31）歲，病程（6.00 ±2.74）年，C 反應(yīng)蛋白77.50（58.43，88.39）mg/L，血沉150.51（84.51，211.78）mm/h，疼痛評分NRS 為4.5（2，7）分，RF191.56（92.40，264.78）IU/mL。OA患者中男23例、女22例，年齡55（59，72）歲，病程7（5，9）年，C 反 應(yīng) 蛋 白4.87（2.73，8.01）mg/L，血 沉（6.43 ± 4.86）mm/h，疼痛評分NRS為3（2，4）分；RA與OA患者年齡性別比例等一般資料具有可比性。納入RA、OA 患者均簽署知情同意書，本研究獲得山東大學(xué)齊魯醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)（KYLL-202210-069-1）。

1.1.2 RA 與OA 患者滑膜組織LYVE1 與CD68 定位與定量檢測 采用免疫熒光（IF）染色法。觀察CD68 與LYVE1 標(biāo)記物的顏色分布分析標(biāo)記物在滑膜組織中的定位，通過收集、計算CD68 與LYVE1 標(biāo)記物的熒光表達(dá)量分析被標(biāo)記物在滑膜組織中的表達(dá)量。選擇兔源性抗人LYVE1 抗體與兔源性抗人CD68抗體對載玻片進(jìn)行定位標(biāo)記。使用Alexa Fluor 594結(jié)合的抗人抗體標(biāo)記兔源性抗人LYVE1抗體和Alexa Fluor 488 結(jié)合的抗人抗體標(biāo)記兔源性抗人CD68 抗體進(jìn)行定量染色。使用蔡司Axio 立式熒光顯微鏡來拍攝圖像，將滑膜組織中CD68 的表達(dá)視為滑膜組織中巨噬細(xì)胞的表達(dá)[8］，LYVE1與CD68表達(dá)重疊位置視為LYVE1+巨噬細(xì)胞表達(dá)。ImageJ 軟件分別收集、計算滑膜組織中LYVE1 與CD68 的熒光強(qiáng)度，將熒光強(qiáng)度視為LYVE1 與CD68 在滑膜組織中的表達(dá)量。重復(fù)測算3次，取平均值。

1.2 LYVE1+巨噬細(xì)胞對RA-FLS 遷移、侵襲、向肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化的抑制作用觀察

1.2.1 細(xì)胞、試劑及儀器 人單核細(xì)胞白血病細(xì)胞（THP-1 細(xì)胞，是一種單核細(xì)胞，能夠被佛波酯PMA誘導(dǎo)分化為巨噬細(xì)胞[9］）、人類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎成纖維細(xì)胞（MH7A 細(xì)胞）（ATCC，中國）；RPMI 1640 培養(yǎng)基、DMEM 高糖培養(yǎng)基、胎牛血清（FBS）、胰蛋白酶和PBS（Gibco 公司，美國）；PMA（MCE，美國）；兔源性抗人LYVE1抗體、兔源性抗人CD68抗體（Proteintech，美國）；LYVE1過表達(dá)慢病毒（吉凱基因醫(yī)學(xué)科技股份有限公司，上海）；TRIzol 試劑、Fast SYBRGreen?Master Mix（ThermoFisher，美國）；RT-qPCR引物（捷瑞生物工程有限公司，上海）；培養(yǎng)瓶、6 孔板、24 孔板和Transwell 小室等（賽維爾生物科技有限公司，武漢）。

1.2.2 構(gòu)建LYVE1+巨噬細(xì)胞 按照供應(yīng)商提供的說明書操作，取對數(shù)生長期THP-1細(xì)胞，在培養(yǎng)液中加入LYVE1 過表達(dá)慢病毒，同時加入2 ng/mL 濃度的嘌呤霉素進(jìn)行篩選，培養(yǎng)48 h，獲得表達(dá)LYVE1的THP-1 細(xì)胞。在表達(dá)LYVE1 的THP-1 細(xì)胞中加入100 ng/mL 的PMA 誘導(dǎo)培養(yǎng)48 h，即獲得LYVE1+巨噬細(xì)胞。由于THP-1 細(xì)胞本身不表達(dá)LYVE1，因此另取部分THP-1細(xì)胞，僅加入100 ng/mL的PMA 誘導(dǎo)培養(yǎng)48 h，獲得LYVE1-巨噬細(xì)胞。

1.2.3 LYVE1+巨噬細(xì)胞對MH7A 細(xì)胞遷移能力的影響觀察 采用劃痕實驗。取對數(shù)生長期MH7A細(xì)胞，用含10% FBS 的DMEM 高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)至細(xì)胞生長融合至80%。用無菌塑料移液管尖端對細(xì)胞單層進(jìn)行刮擦，PBS 洗滌2 次，將培養(yǎng)基更換為無血清的高糖DMEM 培養(yǎng)基。以3×104個LYVE1+/LYVE1-巨噬細(xì)胞（含有10% FBS的RPMI 1640完全培養(yǎng)基）分別加入不同的24 孔板Transwell 小室后分別插入劃痕操作后的MH7A細(xì)胞孔板中。在小室中分別加入LYVE1+巨噬細(xì)胞（LYVE1+巨噬細(xì)胞組）與LYVE1-巨噬細(xì)胞（LYVE1-巨噬細(xì)胞組），將僅含培養(yǎng)基的小室標(biāo)記為空白對照組。分別在培養(yǎng)0、24 和48 h 取出培養(yǎng)室，Olympus CKX53 倒置顯微鏡下對各組MH7A 細(xì)胞劃痕進(jìn)行觀察和拍照，ImageJ 軟件測算劃痕面積，計算各組細(xì)胞劃痕愈合比。劃痕愈合比=（初始劃痕面積-最終劃痕面積）/初始劃痕面積。重復(fù)測算3次，取平均值。

1.2.4 LYVE1+巨噬細(xì)胞對MH7A 細(xì)胞侵襲能力的影響觀察 采用Transwell 侵襲實驗。以3×104個LYVE1+/LYVE1-巨噬細(xì)胞（含有10% FBS 的RPMI 1640完全培養(yǎng)基）加入24孔板中。在小室中分別加入LYVE1+巨噬細(xì)胞（A 組）與LYVE1-巨噬細(xì)胞（B組），將僅含有的小室標(biāo)記為C 組。將MH7A 細(xì)胞進(jìn)行消化、收集，并使用不含血清的DMEM 高糖培養(yǎng)基進(jìn)行重懸，24孔板Transwell小室中每小室加入3×104個MH7A 細(xì)胞，分別插入上述不同巨噬細(xì)胞分組的24 孔板中。24 h 后去除上室細(xì)胞，下室的細(xì)胞則為穿過小室濾膜的侵襲成功細(xì)胞。多聚甲醛固定與結(jié)晶紫染色小室濾膜，Olympus CKX53 倒置顯微鏡觀察小室濾膜并隨機(jī)拍照5 個視野，ImageJ 軟件統(tǒng)計穿膜細(xì)胞數(shù)。重復(fù)測算3次，取平均值。

1.2.5 LYVE1+巨噬細(xì)胞對MH7A 細(xì)胞FMT 轉(zhuǎn)化的影響觀察 采用實時定量PCR（real time quantitative PCR，RT-qPCR）法。取對數(shù)生長期MH7A 細(xì)胞培養(yǎng)至細(xì)胞生長融合80%，分為一、二組，另選擇僅含有培養(yǎng)基小室為空白組。分別消化收集LYVE1+及LYVE1-巨噬細(xì)胞，使用含有10% FBS 的RPMI 1640 完全培養(yǎng)基重懸。一二組分別加入3×104個的LYVE1+巨噬細(xì)胞、LYVE1-巨噬細(xì)胞，培養(yǎng)48 h 移除Transwell 小室，吸棄24 孔板中培養(yǎng)基并用PBS 清洗MH7A 細(xì)胞3次，使用TRIzol試劑提取MH7A 細(xì)胞總mRNA，按照試劑商的指示在QuantStudio6 上使用Fast SYBR?Green Master Mix進(jìn)行RT-PCR，以檢測各組MH7A 細(xì)胞FMT 相關(guān)基因（COL1A1、fibronectin、α-SMA）mRNA，以GAPDH 作為參考基因。COL1A1的上游引物為5'-GAGGGCCAAGACGAAGACATC-3'，下游引物為5'-CAGATCACGTCATCGCACAAC-3'；fibronectin 上游 引物 為5'-CGGTGGCTGTCAGTCAAAG-3'，下游引物為5'-AAACCTCGGCTTCCTCCATAA-3'，α-SMA上游引物為5'-TCCATCGGAGCCGAAGAAATC-3'，下游引物為5'-CGGCTTCATCGTATTCCTGTT-3'；GADPH 上 游 引 物 為 5'-AACGGATTTGGTCGTATTG-3'，下游引物為5'-GGAAGATGGTGATGGGATT-3'。以2-ΔΔCT代表為COL1A1、fibronectin、α-SMA 的mRNA 相對表達(dá)量。FMT 相關(guān)基因mRNA 相對表達(dá)量越高，則該組MH7A 細(xì)胞FMT 過程越強(qiáng)，反之則該組MH7A 細(xì)胞FMT 過程越弱。重復(fù)測算3次，取平均值。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 使用GraphPad Prism 9 統(tǒng)計軟件。用 Shapiro-Wilk test 方法進(jìn)行正態(tài)分析，不符合正態(tài)分布的計量資料用中位數(shù)和四分位數(shù)M（P25，P75）表示，兩組間比較采用Mann-Whitney U 檢驗；符合正態(tài)分布的計量資料以±s表示，兩組間比較采用Student'st檢驗，多組間比較采用方差分析，進(jìn)一步兩兩比較使用Tukey多重比較檢驗法。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 RA 與OA 患者滑膜組織LYVE1、CD68 表達(dá)情況 RA 與OA 患者滑膜組織中LYVE1、CD68 表達(dá)位置基本重疊，說明LYVE1在RA與OA患者滑膜組織中主要表達(dá)在巨噬細(xì)胞上。RA 與OA 患者滑膜組織LYVE1 相對表達(dá)量分別為0.319 ± 0.033、1.000 ± 0.159（P＜0.05），CD68 相對表達(dá)量分別為1.044 ± 0.081、1.000 ± 0.099（P＞0.05）。

2.2 LYVE1+巨噬細(xì)胞對MH7A 細(xì)胞遷移侵襲與FMT過程的影響

2.2.1 各組細(xì)胞劃痕愈合比比較 培養(yǎng)24 h 時LYVE1+巨噬細(xì)胞組、LYVE1-巨噬細(xì)胞組與空白對照組 劃 痕 愈 合 比 分 別 為0.205 ± 0.006、0.362 ±0.015、0.462 ± 0.022，培養(yǎng)48 h 時LYVE1+巨噬細(xì)胞組、LYVE1-巨噬細(xì)胞組與空白對照組劃痕愈合比分別為0.508 ± 0.014、0.680 ± 0.025、0.810 ±0.119。與LYVE1-巨噬細(xì)胞組、空白對照組比較，培養(yǎng)24、48 h 時LYVE1+巨噬細(xì)胞組細(xì)胞劃痕愈合比低（P均＜0.05）。

2.2.2 各組細(xì)胞穿膜數(shù)比較 培養(yǎng)24 h 時A、B、C組穿膜細(xì)胞數(shù)分別為（157.67 ± 6.59）、（224.67 ±5.35）、（254.67 ± 9.25）個，與B 組、C 組比較，培養(yǎng)24 h時A組細(xì)胞穿膜細(xì)胞數(shù)少（P均＜0.05）。

2.2.3 各 組 細(xì) 胞 COL1A1 mRNA、fibronectin mRNA、α-SMA mRNA 相對表達(dá)量比較 培養(yǎng)48 h時各組細(xì)胞COL1A1 mRNA、fibronectin mRNA、α-SMA mRNA 相對表達(dá)量見表1。 與二組、空白組比較，培養(yǎng)48 h 時一組細(xì)胞COL1A1 mRNA、fibronectin mRNA、α-SMA mRNA 相對表達(dá)量少（P均＜0.05）。

表1 培養(yǎng)48 h時各組細(xì)胞COL1A1 mRNA、fibronectin mRNA、α-SMA mRNA相對表達(dá)量（± s）

表1 培養(yǎng)48 h時各組細(xì)胞COL1A1 mRNA、fibronectin mRNA、α-SMA mRNA相對表達(dá)量（± s）

組別一組二組空白組COL1A1 mRNA 0.506 ± 0.021 0.823 ± 0.025 1.000 ± 0.083 fibronectin mRNA 0.472 ± 0.028 0.755 ± 0.050 1.000 ± 0.077 α-SMA mRNA 0.487 ± 0.032 0.880 ± 0.021 1.000 ± 0.042

3 討論

RA滑膜關(guān)節(jié)中的巨噬細(xì)胞主要表現(xiàn)為M1型的促炎巨噬細(xì)胞與M2型的抗炎巨噬細(xì)胞。M1型巨噬細(xì)胞過度激活會破壞軟骨，M2型巨噬細(xì)胞則具有修補(bǔ)型特性。CHAKAROV等[15］研究表明，LYVE1+巨噬細(xì)胞被認(rèn)為是一種傾向于M2表型的巨噬細(xì)胞，并且在RA滑膜中，M2巨噬細(xì)胞具備修復(fù)特性[16］。因此，我們猜測LYVE1+巨噬細(xì)胞與M2 型巨噬細(xì)胞修復(fù)RA關(guān)節(jié)的作用相似。在本研究中，通過對RA與OA患者滑膜組織中CD68與LYVE1進(jìn)行IF染色證實了LYVE1 在滑膜組織中主要表達(dá)在巨噬細(xì)胞中，且LYVE1+巨噬細(xì)胞在RA患者滑膜組織中表達(dá)減少，這與先前的研究[13］一致，而調(diào)控巨噬細(xì)胞中LYVE1 表達(dá)下調(diào)的機(jī)制尚未明確，仍需深入研究。本研究認(rèn)為LYVE1與RA的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，在后續(xù)的研究中，將對于RA患者血清中的胞外域脫落LYVE1[17］的表達(dá)量進(jìn)行檢測以及與RA 進(jìn)展相關(guān)的指標(biāo)如RF、抗CCP 抗體、das28 等進(jìn)行相關(guān)性分析，評估LYVE1作為一種新型的血清學(xué)指標(biāo)用于RA診斷的可行性。

FLS 在RA 關(guān)節(jié)損傷的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用。RA-FLS 表現(xiàn)出異?；钴S的遷移和侵襲功能[3］。為了探究LYVE1+巨噬細(xì)胞對于RA-FLS細(xì)胞遷移和侵襲功能的影響，本研究通過通過劃痕實驗與Transwell 侵襲實驗觀察LYVE1+巨噬細(xì)胞對MH7A細(xì)胞遷移與侵襲功能的影響。在劃痕實驗中，LYVE1+巨噬細(xì)胞顯著抑制MH7A 細(xì)胞的遷移功能，并且在Transwell侵襲實驗中，LYVE1+巨噬細(xì)胞顯著抑制MH7A 細(xì)胞的侵襲功能。這表明LYVE1+巨噬細(xì)胞可以抑制MH7A 細(xì)胞的遷移與侵襲功能，其機(jī)制可能與LYVE1+巨噬細(xì)胞的抗炎特性尤其是TNF-α的下降有關(guān)[18］?？寡篆h(huán)境可以抑制RA-FLS 細(xì)胞的侵襲性改變，炎癥環(huán)境中TNF-α 是影響RA-FLS 遷移與侵襲能力的關(guān)鍵因子，然而LYVE1+巨噬細(xì)胞是否通過影響TNF-α 影響RA-FLS 細(xì)胞的遷移與侵襲功能還需進(jìn)一步研究。

RA 的進(jìn)展與FLS 的FMT 過程有關(guān)，RA 患者關(guān)節(jié)整張損傷程度與RA-FLS的FMT過程呈正相關(guān)[5］，其具體表現(xiàn)為RA-FLS 中的COL1A1、fibronectin、α-SMA等相關(guān)基因mRNA的表達(dá)增高。本研究通過RT-qPCR 探究LYVE1+巨噬細(xì)胞對MH7A 細(xì)胞FMT相關(guān)基因mRNA 表達(dá)的影響。結(jié)果顯示，LYVE1+巨噬細(xì)胞明顯抑制MH7A 細(xì)胞FMT 相關(guān)基因mRNA的表達(dá)，這表明LYVE1+巨噬細(xì)胞可以抑制MH7A 細(xì)胞的FMT 過程。TGF-β 有明確促進(jìn)FMT 過程的功能，在我們前期研究中發(fā)現(xiàn)，相較于LYVE1 高表達(dá)的巨噬細(xì)胞，LYVE1低表達(dá)的巨噬細(xì)胞分泌更TGFβ 的能力明顯增強(qiáng)。因此，LYVE1+巨噬細(xì)胞TGF-β能力下降的原因或許是影響RA-FLS 的FMT 過程的具體機(jī)制。

綜上所述，相比于OA 患者，RA 患者滑膜組織LYVE1+巨噬細(xì)胞少。LYVE1+巨噬細(xì)胞可抑制RA-FLS 的遷移、侵襲及FMT。LYVE1+巨噬細(xì)胞可能在RA的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用。