陸雯逸,王澤銘,左翔之,劉奕翔,武海濤,高彥征(南京農(nóng)業(yè)大學(xué),土壤有機污染控制與修復(fù)研究所,江蘇 南京 210095)

鄰苯二甲酸酯(PAEs),俗稱酞酸酯,是一類人工合成有機物,主要作為增塑劑被廣泛應(yīng)用于塑料?包裝?化妝品?潤滑劑和香料等商品的生產(chǎn)當中[1].目前,全球PAEs 的年產(chǎn)量約3 億t,預(yù)計2050 年將達到5億t[2],而中國已成為世界上最大的增塑劑消費國,僅2017 年消費額就占世界消費總量的42%[3].PAEs 與塑料制品間沒有穩(wěn)定的化學(xué)鍵結(jié)合,因此其會不斷的從塑料制品中滲透、蒸發(fā)而出,進入土壤?水?大氣等環(huán)境介質(zhì)中[4].殘留在土壤或水體等環(huán)境介質(zhì)中PAEs 可通過食物鏈、呼吸、皮膚接觸等途徑進入人體[5].研究表明,人體直接接觸大劑量的PAEs 或長期累積低劑量的PAEs 會對生殖系統(tǒng)?肝臟和腎臟等器官產(chǎn)生不良影響,遺傳物質(zhì)也可能受到損傷[6-8].

自然環(huán)境中的PAEs 難以被非生物降解,因此微生物降解被認為是降解PAEs 最經(jīng)濟有效的方法[9].為獲取高效降解PAEs 的微生物,很多研究者針對PAEs 污染環(huán)境中的微生物開展了篩選與分離工作.如Wu 等[10]從河床沉積物中分離出的一株蒼白桿菌(Ochrobactrum sp.),可在48h內(nèi)能將鄰苯二甲酸二丁酯(DBP)完全礦化,且對其他種類的PAEs 同樣具有高效的降解能力.Wang 等[11]尋找到一株紅球菌(Rhodococcus sp.),其可以在7d 內(nèi)降解96.4%的鄰苯二甲酸二(2-乙基)己酯(200 mg/L).從污染環(huán)境中提取PAEs 降解菌顯然是一種行之有效的方法.但是,目前已篩選出的降解菌株,大部分只能把PAEs 轉(zhuǎn)化為鄰苯二甲酸單酯(PMEs)或鄰苯二甲酸(PA),甚至有的菌株僅參與共代謝過程[12].研究發(fā)現(xiàn)很多細菌僅對單一組分的PAEs 具有較強的降解能力,面對實際環(huán)境中多種PAEs 共存的局面,使用單一菌株難以達到良好的修復(fù)效果.復(fù)合菌群作為一種多菌體共存的生物群體,菌株之間可以通過協(xié)同代謝作用有效降解環(huán)境中的多種有機污染物.馬永見等[13]從某污染場地中篩選分離出3株具有PAEs降解能力的菌株,將其按照一定的比例構(gòu)建成新的復(fù)合菌群,與單菌株相比,復(fù)合菌群能在更短的時間內(nèi)降解PAEs.此外,在協(xié)同代謝過程中,一些細菌對復(fù)雜有機物的生物降解產(chǎn)物可能會為群落中的其他細菌提供生物降解所需的簡單分子[14].Vega 等[15]從污染土中篩選出兩株降解菌,利用它們的特性構(gòu)建新的菌群,實現(xiàn)了對鄰苯二甲酸二甲酯(DMP)的完全礦化.Wu 等[16]從活性污泥中分離純化出戈登氏菌(Gordonia sp.strain JDC-2)和節(jié)桿菌(Arthrobacter sp. strain JDC-32)兩株降解菌,發(fā)現(xiàn)JDC-2 能迅速將DOP 轉(zhuǎn)化為PA,而菌株JDC-32 能將PA 進一步分解.由此可見,與單一功能菌株相比,菌群中不同細菌之間的協(xié)同代謝可提高環(huán)境中PAEs 的消減.但目前,仍缺少一組能同時降解多種PAEs 的復(fù)合菌群,以應(yīng)對實際環(huán)境中的多污染場景.

此外,為了提高微生物的環(huán)境適應(yīng)能力,增強對污染物的去除效果,微生物的固定化技術(shù)得到了越來越多的關(guān)注[17-18].在國內(nèi),固定化微生物技術(shù)已被應(yīng)用于修復(fù)農(nóng)藥、石油及多環(huán)芳烴等有機污染物污染土壤,在實際的污染修復(fù)工程應(yīng)用中表現(xiàn)出極大的優(yōu)勢[13,19].而載體材料始終是研究的重點之一.元妙新[20]、段淑偉等[21]研發(fā)的微生物包埋固定技術(shù)都能成功去除土壤中的有機污染物,且修復(fù)效果優(yōu)于游離菌.載體材料對環(huán)境的友好性有待進一步提高.生物炭既解決了農(nóng)林廢棄生物質(zhì)的處理工作,又可提高土壤的保水功能,提高土壤有機質(zhì)含量,有望成為更加理想的微生物固定化載體.

本研究嘗試將具有不同PAEs 降解能力的多個菌株進行復(fù)配,構(gòu)建具有PAEs 降解廣譜性的功能菌群.以生物炭為載體,采用吸附法研制固定化菌劑,研究固定化菌劑降解環(huán)境中PAEs 的效能及途徑.旨在為PAEs 污染環(huán)境的微生物修復(fù)提供參考.

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑 鄰苯二甲酸二甲酯(DMP)、鄰苯二甲酸二乙酯(DEP)、鄰苯二甲酸二丁酯(DBP)、鄰苯二甲酸丁基芐基酯(BBP)、鄰苯二甲酸二(2-乙基)己酯(DEHP)、鄰苯二甲酸正辛酯(DnOP)純度為99.0%,購于上海阿拉丁生化科技股份有限公司.6 種PAEs 的基本理化性狀見表1.甲醇為色譜純級別.

1.1.2 供試菌株 菌株為課題組已有的PAEs 高效降解菌:谷氨酸桿菌(Glutamicibacter sp. A4),保藏編號為 CCTCC M20221850;芽孢桿菌(Bacillus sp.W34)[22];紅球桿菌(Rhodococcus sp. 2G)[23],保藏編號為CCTCC M2015056.供試菌株的形貌見圖1,A4 的系統(tǒng)發(fā)育樹見圖2.

圖1 菌株的透射電鏡圖Fig.1 Transmission electron micrograph of the strain

圖2 A4 的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 Phylogenetic tree of A4

1.1.3 培養(yǎng)基 所用的培養(yǎng)基為LB 培養(yǎng)基和無機鹽培養(yǎng)基,具體配方如下:LB 培養(yǎng)基:NaCl 10.0g/L,進口蛋白胨10.0g/L,進口酵母粉5.0g/L.無機鹽培養(yǎng)基(MSM):(NH4)2SO41.50g/L, KH2PO40.50g/L,K2HPO4·3H2O 1.91g/L,NaCl 0.5g/L, MgSO4?7H2O 0.20g/L.所有培養(yǎng)基在使用前均在高壓滅菌鍋中121℃滅菌20min.

1.2 復(fù)合菌群的構(gòu)建

分別將菌株A4、2G、W34 接種到LB 液體培養(yǎng)基中,置于30℃,150r/min 搖床中振蕩培養(yǎng)24h.將菌液8000r/min、4℃離心5min,棄去上清液;用已滅菌的MSM 對菌體反復(fù)沖洗2～3 次,再次離心收集菌體.用MSM 將菌體制備成菌懸液,OD600調(diào)整到1.0.拮抗實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)A4、2G、W34 不存在拮抗反應(yīng),因此按照1:1:1 的比例進行復(fù)配,4℃冰箱備用.

1.3 固定化菌劑的制備

1.3.1 固定化載體生物炭的制備 前體材料清洗后置于烘箱內(nèi),105℃殺青30 min,然后在55℃條件下烘烤24h,干燥后用粉碎機打碎.在氮氣氣氛條件下,以5 ℃/min的升溫速率,達到600℃后恒溫2h 燒制為生物炭,冷卻后研磨過60 目篩.將獲得的炭材料先用0.1%的HCl 溶液進行清洗,除去熱解過程中產(chǎn)生的焦油和灰分,接著用超純水沖洗多次后烘干.

1.3.2 固定化菌劑的制備 稱取1.5g 生物炭于50mL 錐形瓶,滅菌后冷卻至常溫,加入15mL 復(fù)合菌群的菌懸液,置于30℃、150r/min 的恒溫震蕩培養(yǎng)箱內(nèi)固定24h,隨后5000r/min 離心5min,棄上清液.用滅菌的MSM 液體洗滌2～3 次,離心收集下層固體.置于25℃下干燥,即為本文所用固定化菌劑.

1.3.3 游離菌和固定化菌劑降解能力的驗證 向滅菌的錐形瓶中加入PAEs 混標,使得6 種PAEs 終濃度均為20mg/L,待甲醇揮發(fā)完全后,加入19mL 的MSM 液體培養(yǎng)基,加入1mL 復(fù)合菌群的菌懸液,并設(shè)置未投加菌液的空白對照,每個處理設(shè)置3 個重復(fù).在150r/min、30℃條件下避光培養(yǎng),分別于培養(yǎng)第1,3,5,7d 測定PAEs 殘留濃度.

固定化菌劑降解能力驗證實驗的處理組為20 mL 的MSM 液體培養(yǎng)基,加入0.1g 的固定化菌劑,其余與游離菌降解實驗過程相同.

1.4 固定化菌劑制備條件的優(yōu)化

1.4.1 固定化時間對固定化菌劑降解PAEs 的影響 在制備固定化菌劑的過程中,將樣品置于恒溫振蕩培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)不同的天數(shù):1,2,3d,將制備完成后的固定化菌劑投加于20mL無機鹽培養(yǎng)基中,加入PAEs,使6 種PAEs 終濃度均達到20mg/L,30°C、150r/min 條件下培養(yǎng)7d 后取出,用HPLC 測定培養(yǎng)基中PAEs 殘留量,確定最佳固定化時間.

1.4.2 菌料比對固定化菌劑降解PAEs 的影響 在確定最佳固定化天數(shù)的基礎(chǔ)上,在制備固定化菌劑的過程中向1g 生物炭中加入不同的菌液量:10,20,30mL,以制備固定化菌劑.剩余步驟同1.4.1 中所述,通過測定培養(yǎng)基中PAEs 殘留量確定最佳菌料比.

1.4.3 固定化溫度對固定化菌劑降解PAEs 的影響 在最佳固定化時間和菌液用量的制備條件下,分別在25,30,35℃條件下培養(yǎng)以制備固定化菌劑.剩余步驟同1.4.1 中所述方法,通過測定培養(yǎng)基中PAEs殘留量確定最佳固定化溫度.

1.5 PAEs 降解途徑分析

反應(yīng)體系設(shè)置:將PAEs混標加入到100mL滅菌的錐形瓶中,使總PAEs 濃度達到120mg/L,待有機溶劑揮發(fā)后加入47.5mL MSM 培養(yǎng)基和2.5mL 菌群菌懸液,置于30℃、150r/min 的恒溫震蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h,于3,6,12,24h 取樣.

HPLC-HRMS 分析樣品前處理:使用Cleanert polar-enhanced polymer(PEP)固相萃取柱(500 mg/6 mL,Bonna-Agela Technologies,中國天津)對降解產(chǎn)物進行凈化和濃縮.使用前,先用10mL 甲醇活化PEP 小柱,再用5mL 超純水清洗柱體.然后,將50mL 的降解液以1 mL/min的流速流經(jīng)PEP小柱,用5mL超純水清洗.用2mL 甲醇以2mL/min 的流速淋洗PEP 小柱,收集洗脫液,過0.22μm 有機相濾膜,?20℃靜置備用.使用HPLC-HRMS 聯(lián)用方法檢測降解產(chǎn)物分子量.

1.6 PAEs 的檢測方法

采用LC-20AT 高效液相色譜儀(配有SPD-2A紫外檢測器).檢測時間為40min,進樣系統(tǒng)的進樣量為20μL;分離系統(tǒng)以乙腈-水為流動相、初始流速為1.0mL/min,采用梯度洗脫的方式分離PAEs,色譜柱為Φ4.6×250mm Inertsil ODS-P 液相色譜柱,柱溫為40℃;檢測系統(tǒng)采用紫外檢測器檢測、開啟雙波長檢測模式,分別為205 和225nm.20mg/L 的6 種PAEs加標回收率范圍為80.03%～102.05%,相對標準偏差范圍為0.52%～4.36%,實驗方法符合要求.

1.7 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2016 進行數(shù)據(jù)處理,使用Origin 2018 進行圖表繪制.

計算方法為:

式中:CK為無菌對照處理PAEs 的殘留濃度;CB為含降解菌培養(yǎng)液或固定化菌劑中PAEs 的殘留濃度.

2 結(jié)果與討論

2.1 功能菌群對塑化劑的降解效能

構(gòu)建的復(fù)合菌群對6 種PAEs 具有較好的降解能力.如圖3(a)所示,復(fù)合菌群對6 種PAEs 總的降解率在第1d 時為60.35%,在第7d 時能達到80.04%.但該復(fù)合菌群對不同PAEs 的降解能力有所不同.復(fù)合菌群對短鏈PAEs 降解率在7d 時能高達98.19%,對長鏈PAEs 在第7d 時降解率僅61.93%.

圖3 復(fù)合菌群對PAEs 的降解率Fig.3 Degradation rate of PAEs by complex flora

如圖3(b)所示,復(fù)合菌群對DMP、DEP 和DBP的降解能力相對較高,在第1d 時降解率就能達到93.87%以上,對BBP 的降解能達到66.65%,但DEHP和DnOP 的降解率相對較低,在第1d 時幾乎不降解;到第7d 時,對DnOP 的降解能達到71.16%, DEHP的降解率為34.99%.6 種污染物中,DMP?DEP 和DBP 作為短鏈的PAEs 化合物,具有較好的親水性,更容易與功能微生物發(fā)生接觸,并且分子結(jié)構(gòu)更加簡單,所以更容易被微生物降解;而DEHP 和DnOP分子量較大,水溶性相對較差,則不易被微生物降解[24].但該復(fù)合菌群在廣譜性方面仍具有一定優(yōu)勢,目前已有的報道幾乎未見對6 種PAEs 均具有降解的菌群.例如Zhang 等[25]將Arthrobacter sp. SLG-4和Rhodococcus sp. SLG-6 復(fù)配構(gòu)建了一個新的菌群,其僅對DMP、DEP、DBP 和DnOP 具有較好的降解能力.Lu 等[26]用Microbacterium sp. PAE-1 和Pandoraea sp. PAE-2 組建的菌群僅能降解DBP.相較于前人研究,本文所構(gòu)建的PAEs 降解菌群具有更好的廣譜性.

2.2 固定化菌劑對塑化劑的降解效能

如圖4(a)所示,固定化菌劑對6 種PAEs 總的降解率在第1d 時就能達到70.58%,在第7d 時能達到90.21%,比游離菌群降解率提高了10.17%.固定化菌劑對短鏈PAEs 降解率在7d 時能高達98.39%,對長鏈PAEs 在第7d 時降解率能達到80.10%,比游離菌群降解率提高了18.17%.固定化提高了微生物的細胞密度和耐受性,因而提高了降解效率.根據(jù)趙暹等[27]的研究,將復(fù)合菌群DP3 通過包埋法制備而成的固體菌劑,降解同等濃度的污染物所需時間僅為游離菌的一半.SEM 掃描發(fā)現(xiàn)菌群被復(fù)合材料包埋吸附在凝膠球內(nèi)部,為微生物提供了生存空間,因而增強了物質(zhì)交換效率.本研究以生物炭作為載體,不僅能擴充微生物的生存空間,其中的有機質(zhì),以及氮?磷和鉀等元素還可為菌群的生長提供營養(yǎng)物質(zhì),進而提高微生物的密度[28].可見固定化可有效提高復(fù)合菌群的生存質(zhì)量,進而提高對污染物的降解效能.

圖4 固定化菌劑對PAEs 的降解率Fig.4 Degradation rate of PAEs by immobilized bacterial agent

如圖4(b)所示,固定化菌劑對6 種PAEs 的降解效率均有升高,其對DMP、DEP、DBP 的降解在第1d 時均能達到96.31%以上,對BBP 的降解率在第1d 時能達到74.61%,較游離菌提高了7.96%;對DEHP 和DnOP 在第1d 時就有降解能力.特別是對于游離菌無法利用的DEHP,固定化菌劑在7d 內(nèi)對DEHP 的降解率高達76.17%,比游離菌高了1.18 倍.這可能是由于生物炭自身的多孔結(jié)構(gòu)和豐富的官能團,使其能夠吸附污染物,增加了親水性差的污染物與微生物的接觸幾率,進而提高了功能菌群對DEHP 的降解[28].以上結(jié)果顯示,制備的生物炭固定化菌劑對PAEs 的降解具有廣譜性和高效性.

2.3 固定化菌劑制備條件優(yōu)化

固定時間的優(yōu)化結(jié)果如圖5 所示.固定溫度為30℃ ,菌料比為1:10,固定1～3d 后,固定化菌劑對總PAEs 的降解率在80.66%～84.99%,當固定時間為2d時,該固定化菌劑對總PAEs的降解效果最優(yōu).當固定時間為2d時,固定化菌劑對長鏈PAEs的降解率最高,達到70.44%,而固定時間為1,3d 時,其對長鏈PAEs的降解率僅63.98%?61.42%.這是因為,如果固定化時間短,載體對微生物的吸附效果不佳,吸附的微生物數(shù)量較少;固定化時間過長,微生物的生長可能處于衰亡期,活性好的微生物數(shù)量減少[29].因此選擇適宜的固定時間能夠綜合微生物的吸附效果與健康生長.固定化菌劑制備的最優(yōu)固定時間為2d.

圖5 固定時間對固定化菌劑降解PAEs 的影響Fig.5 Influence of fixed time on the degradation of PAEs by immobilized bacterial agent

在最佳固定化時間的基礎(chǔ)上,探究不同的菌料比對PAEs 降解效果的影響,結(jié)果如圖6 所示.向1g生物炭中加入30mL 菌液時,固定化菌劑對PAEs 的降解效果略高于菌液用量為10和20mL時的降解效果,對總PAEs 的降解率可達到94.18%.如圖6 所示,當菌料比為1:10、1:20(V/M)時,固定化菌劑對長鏈PAEs 的降解率僅76.76%?80.26%,而當菌料比為1:30(V/M)時,固定化菌劑對長鏈PAEs 的降解效果有所提升,降解率高達89.47%.與馬伶俐[30]研究結(jié)果一致.由于在降解過程中,數(shù)量過少的微生物難以應(yīng)對高濃度的污染物,但當微生物數(shù)量較多時會引發(fā)種群間對氧氣和營養(yǎng)物質(zhì)的競爭,阻礙負載在生物炭中微生物的生長,從而影響固定化菌劑的降解效能[31].固定化菌劑制備最優(yōu)菌料比為1:30(V/M).

圖6 菌料比固定化菌劑降解PAEs 的影響Fig.6 Influence of bacteria-material ratio on the degradation of PAEs by immobilized bacterial agent

當固定化時間為2d,菌料比為1:30 時,探究該固定化菌劑的最佳固定溫度,結(jié)果如圖7 所示.當溫度為30℃時,固定化菌劑對總PAEs 的降解率最高,可達到96.60%,當溫度過高或過低時,固定化菌劑對PAEs的降解能力有所下降.當溫度為30℃時,固定化菌劑對長鏈PAEs 的降解效果最好,降解率可達93.86%.根據(jù)張小紅等[32]的報道,這是因為微生物降解污染物是一種酶促反應(yīng),當溫度過高時,酶的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)受到了破壞,溫度過低時酶的活性不足,對PAEs 的降解率也會有所下降.固定化菌劑最優(yōu)固定溫度為30℃.

圖7 固定溫度對固定化菌劑降解PAEs 的影響Fig.7 Influence of temperature on the degradation of PAEs by immobilized bacterial agent

固定化菌劑的最優(yōu)制備條件為:固定化時間2d,固定溫度30℃,菌料比1:30(V/M).在該條件下,固定化菌劑對6 種PAEs 總的降解率能達到96.60%,對短鏈PAEs 的降解率能達到99%以上,對長鏈PAEs 的降解率也能達到93%以上,具有顯著的高效性和廣譜性.

2.4 PAEs 的降解途徑

DBP 和BBP 作為短鏈PAEs 和長鏈PAEs 的代表,解析了功能菌群代謝PAEs 的途徑.借助HPLCHRMS 分析檢測DBP 的降解產(chǎn)物.如圖8(a)所示,功能菌群降解DBP 過程中檢測到了5 種代謝產(chǎn)物-鄰苯二甲酸二乙酯(DEP)、鄰苯二甲酸單乙酯(MEP)、鄰苯二甲酸單甲酯(MMP)、鄰苯二甲酸(PA)和1,3-異苯并呋喃二酮(IBF).趙真真[33]在研究微生物降解DBP 時發(fā)現(xiàn),微生物可先將DBP 轉(zhuǎn)化成了DEP 繼而進一步將其轉(zhuǎn)化為PA,酯的水解是DBP 主要的生物降解過程.最終推測DBP 的降解路徑如下:首先經(jīng)微生物β-氧化作用形成DEP,然后去酯化形成MEP,再通過脫甲基反應(yīng)形成MMP,在酯酶作用下水解形成PA,然后芳香環(huán)開環(huán)后進入三羧酸循環(huán),最后礦化成CO2和H2O.

圖8 推測生物降解的途徑Fig.8 The proposed biodegradation pathways

如圖8(b)所示,功能菌群降解BBP 的過程中主要檢測出7 種代謝產(chǎn)物包括:鄰苯二甲酸單芐酯(MBzP)、鄰苯二甲酸單丁酯(MBuP)、鄰苯二甲酸(PA)、1,3-異苯并呋喃二酮(IBF)、鄰苯二甲酸二甲氧基乙酯(BMP)、苯甲醛(BzH)和γ-羧基粘康酸內(nèi)酯(γ-carboxy muconolactone).大部分產(chǎn)物在此前就有所報道.Chatterjee 等[34]分離獲得一株具有BBP 降解功能的革蘭氏陽性細菌MTCC 4818,該菌株降解BBP過程中產(chǎn)生中間產(chǎn)物主要為MBuP和MBzP.Xu等[35]在紅樹林沉積物中分離出一株熒光假單胞菌B-1,其在降解BBP 過程中主要降解產(chǎn)物為MbuP、MBzP、PA 和BzA.最終推測BBP 降解路徑為:在微生物的作用下, BBP 通過去酯化形成了MBzP 和MBuP,這兩種物質(zhì)經(jīng)過去酯化形成了PA.推測PA的分解共有4 條途徑,第1 條途徑是經(jīng)過脫水縮合反應(yīng)形成IBF, IBF 在微生物酯酶的作用下會與體系中的甲醇發(fā)生酯化反應(yīng)形成BMP,也可能轉(zhuǎn)化成BzH 進入三羧酸循環(huán);第2 條途徑是PA 直接轉(zhuǎn)化成BzH 進入三羧酸循環(huán);第3 條途徑是PA 直接進入三羧酸循環(huán);第4 條途徑是PA 轉(zhuǎn)化成γ-carboxy muconolactone 進入三羧酸循環(huán).

3 結(jié)論

3.1 通過單菌復(fù)配獲得一組具有PAEs 降解高效性和廣譜性的功能菌群,該菌群7d 內(nèi)對總濃度為120mg/L 的6 種PAEs 降解率為80.04%;以生物炭為載體,采用固定化技術(shù)制備了固定化菌劑,菌劑最優(yōu)制備條件為:溫度30℃、固定化時間2d、菌料比1:30(V/M),固定化菌劑對總PAEs 的降解率可達到96.60%,比游離菌提高了16.56%.

3.2 功能菌群通過β-氧化、去酯化和脫甲基反應(yīng)等過程將DBP 最終礦化成CO2和H2O;而BBP 在功能菌群的作用下先經(jīng)過去酯化形成MBzP 和MBuP兩種中間產(chǎn)物,然后再進一步通過酯化形成PA,最后進入三羧酸循環(huán).酯的水解作用是PAEs 重要的生物降解過程.