張 帥,王 建,馬俊超,高彥征,左翔之,凌婉婷(南京農(nóng)業(yè)大學(xué)土壤有機(jī)污染控制與修復(fù)研究所,江蘇 南京 210095)

鄰苯二甲酸酯(PAEs)被廣泛應(yīng)用于塑料、化妝品、油漆等行業(yè)[1-3],全球年產(chǎn)量高達(dá)3 億t[4].作為增塑劑,PAEs 與塑料產(chǎn)品之間以氫鍵或范德華力連接,隨著時(shí)間的推移,很容易通過(guò)各種途徑向環(huán)境中釋放.同時(shí)作為一種持久性和疏水性有機(jī)污染物,PAEs極易在土壤中積累[5],并通過(guò)各種途徑暴露于人體從而引發(fā)癌癥、內(nèi)分泌干擾性、生殖和神經(jīng)毒性等危害,嚴(yán)重威脅人體健康[6].當(dāng)前,美國(guó)和歐盟已將鄰苯二甲酸二甲酯(DMP)、鄰苯二甲酸二乙酯(DEP)、鄰苯二甲酸二丁酯(DBP)、鄰苯二甲酸丁基芐基酯(BBP)、鄰苯二甲酸二(2-乙基)己酯(DEHP)和鄰苯二甲酸二辛酯(DnOP)6 種PAEs 列為優(yōu)先控制污染物[7],我國(guó)也將DMP、DBP、DnOP 定為環(huán)境優(yōu)控污染物[8].

土壤中的PAEs 可被作物根系吸收并向地上部轉(zhuǎn)移,造成農(nóng)作物可食部位PAEs污染.長(zhǎng)江三角洲和珠江三角洲地區(qū)的調(diào)查結(jié)果顯示,我國(guó)蔬菜等農(nóng)作物中普遍檢出 PAEs,平均含量分別為 0.536,2.84mg/kg,主要以DBP、DEHP 和DnOP 為主,其中,珠三角地區(qū)葉菜類蔬菜中DEHP 的含量遠(yuǎn)超美國(guó)和歐盟建議的標(biāo)準(zhǔn),嚴(yán)重威脅了人體健康[9-10].

植物內(nèi)生細(xì)菌是棲息在植物組織內(nèi)部,能夠促進(jìn)植物生長(zhǎng),提高植物抗病和抗逆能力并與其互利共生的一類細(xì)菌.許多內(nèi)生細(xì)菌具備有效降解有機(jī)污染物的能力[11-12].近年來(lái),一些PAEs 降解的內(nèi)生細(xì)菌如芽孢桿菌屬(Bacillus)、戈登式菌屬(Gordonia)、假單胞菌屬(Pseudomonas)等已經(jīng)被分離出來(lái)[13-14].將分離獲得的功能菌株重新定殖回作物體內(nèi),可有效減低作物體內(nèi)有機(jī)污染物的積累[15].然而,實(shí)際污染區(qū)往往是多種PAEs共存,單一菌株降解PAEs 的能力有限,而不同來(lái)源的PAEs 降解菌株間的復(fù)配往往會(huì)存在拮抗作用,最終影響功能內(nèi)生細(xì)菌的原位定殖效能.實(shí)際污染區(qū)作物體內(nèi)存在經(jīng)自然馴化且功能穩(wěn)定的菌群,能否將其富集馴化并通過(guò)定殖的方式實(shí)現(xiàn)作物體內(nèi)PAEs 的直接消減,對(duì)此,國(guó)內(nèi)外相關(guān)研究較少.

本研究從PAEs 污染區(qū)生長(zhǎng)的蔬菜中富集馴化具有PAEs 降解能力的功能內(nèi)生菌群,解析菌群群落組成;驗(yàn)證菌群降解效能;優(yōu)化菌群降解PAEs的條件;借助水培體系驗(yàn)證菌群對(duì)作物體內(nèi)PAEs的消減效能及促生效應(yīng),旨在為消減作物體內(nèi)PAEs 污染、保障污染區(qū)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)安全和人群健康提供參考.

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 供試植株 空心菜(Ipomoea aquatica Forsk.)采自被PAEs 污染的土壤中.

1.1.2 主要試劑 DMP、DEP、DBP 和BBP 購(gòu)自上海阿拉丁生化科技股份有限公司,純度均為99.0%.霍格蘭營(yíng)養(yǎng)液(HNS).丙酮、正己烷、甲醇、乙腈均為色譜級(jí).

培養(yǎng)基配制:LB 液體培養(yǎng)基(1.0L):10.0g 進(jìn)口蛋白胨、5.0g 進(jìn)口酵母提取物、10.0g NaCl. 無(wú)機(jī)鹽液體培養(yǎng)基(1.0L):1.50g(NH4)2SO4、0.50g KH2PO4、0.50g NaCl 、 1.91g K2HPO4·3H2O 、 0.20g MgSO4·7H2O.涉及到的所有培養(yǎng)基均在高壓滅菌鍋中121℃條件下滅菌20min.

30%甘油:超純水與丙三醇按7:3的體積比混合,滅菌后置于4℃冰箱保存.

1.2 內(nèi)生菌群的篩選

空心菜經(jīng)過(guò)表面消毒后,將其移入無(wú)菌研缽,剪碎,加入無(wú)菌水充分研磨.靜置5min 后,移取適量上清液至添加PAEs(5mg/L)的無(wú)機(jī)鹽液體培養(yǎng)基中,30℃ ,150r/min 避光振蕩培養(yǎng).5d后,轉(zhuǎn)接上層培養(yǎng)液至新配制的添加PAEs(10mg/L)的無(wú)機(jī)鹽液體培養(yǎng)基中,富集馴化培養(yǎng)5d,之后梯度增加PAEs 的濃度并重復(fù)以上步驟.如此共富集馴化培養(yǎng)20d,以獲得穩(wěn)定的具有高效降解PAEs 能力的功能內(nèi)生菌群.最后,將獲得的菌液與30%甘油按照體積比1:1 的比例均勻混合,于-80℃冰箱保存?zhèn)溆?

1.3 菌群生長(zhǎng)曲線測(cè)定

于超凈臺(tái)內(nèi)挑取-80℃條件下保存的菌種于LB液體培養(yǎng)基中,30℃、150r/min 避光振蕩培養(yǎng),定時(shí)取樣測(cè)定菌液的OD600值.

1.4 菌群的降解效能測(cè)定

1.4.1 功能內(nèi)生菌群菌懸液制備 于超凈臺(tái)內(nèi)挑取-80℃條件下保存的菌種至5% LB 液體培養(yǎng)基中,30℃、150r/min 避光振蕩培養(yǎng)8h,離心收集菌體,用無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)液洗滌菌體2 次,再次離心后棄去上清液,收集菌體,用無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)液調(diào)整菌懸液OD600為1.0,于4℃冰箱中保存?zhèn)溆?

1.4.2 功能內(nèi)生菌群降解效能測(cè)定 將制備好的菌懸液按照5%的比例接種到添加PAEs(5mg/L)的無(wú)機(jī)鹽液體培養(yǎng)基中,30℃,150r/min 避光振蕩培養(yǎng),定時(shí)取樣測(cè)定剩余PAEs 含量.

1.5 菌群群落結(jié)構(gòu)分析

1.5.1 樣品收集 取一定量經(jīng)LB 液體培養(yǎng)基活化后的菌群,離心,棄去上清液,收集菌體后交由美吉生物公司進(jìn)行檢測(cè).

1.5.2 DNA 抽提和PCR 擴(kuò)增 采用E.Z.N.A.?soil DNA kit(Omega Bio-tek,Norcross,GA,U.S.)試劑盒進(jìn)行微生物群落總 DNA 抽提.使用通用引物338F(5’-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3’) 以及806R(5’-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3’)對(duì)16SrRNA 基因V3-V4 可變區(qū)進(jìn)行PCR 擴(kuò)增.擴(kuò)增程序如下:95℃預(yù)變3min,27個(gè)循環(huán)(95℃變性30s,55℃退火30s,72℃延伸30s)后72℃穩(wěn)定延伸10min.

1.5.3 Illumina Miseq 測(cè)序 將同一樣本的PCR 產(chǎn)物混合后使用2%瓊脂糖凝膠回收PCR 產(chǎn)物,利用AxyPrep DNA Gel Extraction Kit(Axygen Biosciences,Union City, CA, USA)進(jìn)行回收產(chǎn)物純化,2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè),并用Quantus? Fluorometer(Promega,USA)對(duì)回收產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)定量.

1.6 環(huán)境因子對(duì)降解的影響

取配制好的無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基,分別設(shè)置不同pH值、鹽度、底物濃度的試驗(yàn)組,按照5%的接菌量接種菌液,30℃,150r/min 避光振蕩培養(yǎng),同時(shí)設(shè)置不同溫度的試驗(yàn)組,7d 后取樣測(cè)定培養(yǎng)液中PAEs 含量.

1.7 菌群定殖及水培試驗(yàn)

選取水稻為接種對(duì)象,本研究設(shè)置浸根定殖(ZR)和接種滅活菌群對(duì)照組(ZK),各接種處理的水稻暴露于含10mg/L PAEs 的Hoagland 培養(yǎng)液中.

接種方法如下:水稻種子經(jīng)表面消毒,催苗育種7d后,選取10株長(zhǎng)勢(shì)一致的植株,菌懸液浸泡水稻根部8h,無(wú)菌水沖洗后,將植株移入添加PAEs(10mg/L)的Hoagland 培養(yǎng)液中,置于晝夜溫度25℃ /20 ℃的光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng),15d 后采集植物樣品進(jìn)行PAEs 含量和生物量等指標(biāo)的測(cè)定.

1.8 植物PAEs 含量分析

稱取0.2g 制備好的植物樣品于25mL 玻璃離心管中,添加15mL 丙酮-正己烷溶液(V/V, 1:1),渦旋混勻0.5～1min,水浴超聲45min.隨后以2000r/min 離心10min.取上清液倒入活化后(10mL 正己烷分兩次淋洗)的層析柱中(層析柱上層為2g 無(wú)水硫酸鈉,下層為2g 硅膠),再次添加丙酮-正己烷溶液(V/V, 1:1),同上,重復(fù)2 次.洗脫之后分3 次添加15mL 丙酮-正己烷溶液(V/V,1:9).收集混合液并借助旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(40℃、100r/min 條件下)濃縮至干,移取2mL 甲醇潤(rùn)洗定容,隨即倒入帶有0.22μm 有機(jī)相濾頭的玻璃注射器,過(guò)濾進(jìn)2mL 棕色液相小瓶,使用HPLC 分析.

HPLC 條件:色譜柱為Ф4.6mm×250mm Inertsil ODS-P 液相色譜柱;流動(dòng)相乙腈:水為60:40,初始流速為1mL/min,柱溫為40 ℃;檢測(cè)時(shí)間為40min,進(jìn)樣量為20μL;檢測(cè)系統(tǒng)采用紫外檢測(cè)器,開(kāi)啟波長(zhǎng)切換模式,波長(zhǎng)分別為205 和290nm.

1.9 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)分析

采用Excel 2021 進(jìn)行數(shù)據(jù)處理,使用Origin 2021 繪圖與降解動(dòng)力學(xué)數(shù)據(jù)擬合.各組之間的數(shù)據(jù)差異采用ANOVA 分析比較(SPSS 23.0 軟件).

2 結(jié)果與討論

2.1 菌群生長(zhǎng)曲線

如圖1(a)所示,根據(jù)細(xì)菌生長(zhǎng)周期規(guī)律來(lái)劃分,菌群接種到LB 培養(yǎng)基中后,在培養(yǎng)前期生長(zhǎng)緩慢,處于延滯期,菌量增幅較小.大概經(jīng)過(guò)4h 后菌群進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期,菌體數(shù)量開(kāi)始快速增加,10h 時(shí)菌群達(dá)到生長(zhǎng)高峰,之后進(jìn)入穩(wěn)定期,此時(shí)細(xì)菌的增殖數(shù)與死亡數(shù)基本持平.處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的菌群生長(zhǎng)繁殖速度最快,代謝能力強(qiáng),擁有最好的降解能力[16].同時(shí),該菌群相比某些菌群繁殖速度較快[17].

圖1 菌群的生長(zhǎng)和降解曲線Fig.1 Growth and degradation curves of bacterial consortium

2.2 菌群對(duì)PAEs 的降解效能

純培養(yǎng)體系下該菌群可以有效降解 4 種USEPA 優(yōu)先控制PAEs.如圖1(b)所示,菌群在添加PAEs(5mg/L)的無(wú)機(jī)鹽液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)1d 時(shí),對(duì)4種 PAEs 的降解率都比較低,分別為 44.41%、10.27%、17.65%和11.23%.第3d 時(shí),菌群對(duì)DMP、DEP、DBP、BBP 的降解率相比第1d 有了較大提高,分別達(dá)到了95.86%、93.89%、88.37%和38.61%.隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng),PAEs的降解率維持平穩(wěn),第5d時(shí)對(duì)DMP、DEP、DBP、BBP 的降解率分別為96.33%、94.41%、93.20%和41.96%,第7d 時(shí)對(duì)4種PAEs 的降解率分別為97.08%、94.47%、98.02%和44.82%.

利用一級(jí)動(dòng)力學(xué)方程對(duì)PAEs 降解曲線進(jìn)行擬合,如圖2 和表1 所示,菌群對(duì)4 種PAEs 的降解均符合一級(jí)反應(yīng)動(dòng)力學(xué).

表1 PAEs 的降解動(dòng)力學(xué)方程Table 1 Degradation kinetic equation of PAEs

圖2 菌群降解PAEs 的準(zhǔn)一級(jí)動(dòng)力學(xué)擬合曲線Fig.2 Pseudo-first-order kinetic fitting curves for the degradation of PAEs by bacterial consortium

由于DMP、DEP、DBP 結(jié)構(gòu)較簡(jiǎn)單,具有更高的生物利用率,在降解過(guò)程中更趨于被優(yōu)先利用,在降解起始的第7d,3 種PAEs 基本上被完全降解.相比之下,分子量較大的BBP 降解進(jìn)展比較緩慢,降解半衰期遠(yuǎn)大于其余3 種PAEs.可能是因?yàn)樵摼涸赑AEs 的代謝途徑上不能互補(bǔ),造成某些中間產(chǎn)物無(wú)法繼續(xù)代謝,從而產(chǎn)生對(duì)菌群的抑制作用[18].

與單一菌株相比,菌群內(nèi)部的各個(gè)菌株為降解過(guò)程提供了更多的降解基因和代謝途徑,使得菌群具有更高的污染物礦化能力[19].近年來(lái),也有許多研究者從環(huán)境中富集馴化出具有PAEs 降解能力的菌群.呂律[20]從活性污泥中富集培養(yǎng)得到一組菌群LV-1,該菌群對(duì)DBP 的降解率可達(dá)到95%以上;李靜[21]從污泥中富集馴化的具有PAEs 降解能力的菌群SD-1 對(duì)DMP、DEP 和DBP 均具備降解能力,在72h 內(nèi)的降解率分別為68.71%、68.46%和80%.相比之下本研究篩選出的菌群對(duì)PAEs 具備較高的降解廣譜性和高效性,在降解環(huán)境中多種共存的PAEs時(shí)具備一定優(yōu)勢(shì),應(yīng)用潛力較大.

2.3 菌群的群落結(jié)構(gòu)

借助16SrRNA 高通量測(cè)序技術(shù)分析了菌群的群落組成.結(jié)果(圖3)顯示,從門(mén)分類水平看,菌群中的最優(yōu)勢(shì)菌門(mén)為變形菌門(mén)(Proteobacteria,76.57%),其次為擬桿菌門(mén)(Bacteroidetes,21.04%)、放線菌門(mén)(Actinobacteria,2.37%).從屬分類水平看,菌群主要由鞘氨醇桿菌屬(Sphingobacterium,33.03%)、代爾夫特菌屬(Delftia,40.61%)、假單胞菌屬(Pseudomonas,11.70%)、無(wú)色桿菌屬(Achromobacter,3.04%)和根瘤菌屬(Rhizobium)(6.90%)組成.其中,鞘氨醇桿菌屬(Sphingobacterium)和代爾夫特菌屬(Delftia)占比較高,此兩種菌屬已被多次報(bào)道具備PAEs 降解的能力.Neelakanteshwar 等[22]分離出一株 Delftia sp.TBKNP-05,該菌株在培養(yǎng)基中經(jīng)過(guò)5d 的培養(yǎng)后對(duì)DBP(10mmol/L)的降解率可達(dá)到100%;馬永見(jiàn)[23]從土壤中分離出一株Sphingobacterium sp. MJ1,該菌株在 780mg/L PAEs(DMP、DBP、DEHP 各為260mg/L)的無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基中培養(yǎng)3d 后對(duì)DBP 和DMP 的去除率均可達(dá)到91%以上,對(duì)DEHP 的去除率也可達(dá)到82%以上.其余幾種菌屬同樣具有PAEs降解能力,如Feng 等[24]篩選出的一株P(guān)seudomonas sp. YJB6 經(jīng)過(guò)3d 的培養(yǎng)可完全降解200mg/L 的DBP;Wang 等[25]篩選出一株Achromobacter sp. RX,經(jīng)過(guò)96h的培養(yǎng),對(duì)DEHP的降解率可達(dá)97.9%;Tang等[26]篩選出一株Rhizobium sp. LMB-1,45h 內(nèi)可完全降解100mg/L 的DMP.本研究富集馴化獲得的菌群中的各占比較高菌屬均具備PAEs 降解能力,且各個(gè)菌屬之間可能存在協(xié)同代謝作用,從而增強(qiáng)菌群的降解廣譜性和高效性[27].值得注意的是,鞘氨醇桿菌屬(Sphingobacterium)和代爾夫特菌屬(Delftia)在菌群中的占比高達(dá)73.64%,推測(cè)PAEs的降解過(guò)程可能由這2 種優(yōu)勢(shì)菌屬主導(dǎo).

圖3 菌群的群落結(jié)構(gòu)Fig.3 Bacterial community structure of the bacterial consortium

2.4 環(huán)境條件對(duì)菌群降解PAEs 的影響

2.4.1 pH值 pH值是影響微生物降解能力的重要環(huán)境因素之一.過(guò)高或者過(guò)低的pH 值均會(huì)影響微生物及其相關(guān)降解酶的活性.由圖4(a)可以看出,菌群對(duì)PAEs 的最大降解率主要集中在pH 7～8 的范圍內(nèi),降解率分別達(dá)78.30%和76.60%,在此pH 值范圍內(nèi),菌群對(duì)PAEs 的降解率無(wú)明顯差異.過(guò)酸或過(guò)堿條件會(huì)改變生物細(xì)胞膜的選擇透過(guò)性從而影響其對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收或改變相關(guān)降解酶活性.柴陽(yáng)陽(yáng)等[28]篩選出了具有DBP 降解能力的內(nèi)生菌株HBT4,發(fā)現(xiàn)適合菌株培養(yǎng)的pH 值為6～8,pH 值為4 時(shí)菌株對(duì)DBP 的降解率不足10%.盡管本研究篩選的菌群在不同pH 值條件下對(duì)PAEs 的降解率存在一定差異,但整體來(lái)看菌群在pH 5～9 的范圍內(nèi)對(duì)PAEs 均具備良好的降解效果,相比于一些單菌來(lái)講,該菌群降解譜較廣的同時(shí)還具備一定的耐酸堿性.

圖4 環(huán)境條件對(duì)菌群降解PAEs 的影響Fig.4 Effect of environmental conditions on the degradation by the bacterial consortium

2.4.2 溫度 溫度會(huì)影響微生物相關(guān)降解酶的活性從而影響菌體對(duì)污染物的降解能力.由圖4(b)可以看出,菌群對(duì)PAEs 的最大降解率主要集中在溫度 25～30℃的范圍內(nèi),降解率分別達(dá) 85.14%和77.91%.此溫度范圍內(nèi),菌群對(duì)PAEs 的降解率無(wú)明顯差異.當(dāng)溫度在20℃和35～ 40℃范圍內(nèi)時(shí),PAEs降解率與25℃時(shí)相比顯著降低.李方方等[29]發(fā)現(xiàn)當(dāng)培養(yǎng)體系溫度為20℃時(shí),菌群LV-1 對(duì)DBP 的降解率僅在40%左右,在25～35℃范圍內(nèi)時(shí),菌群對(duì)PAEs的降解率較高,可達(dá)到80%以上.可見(jiàn)溫度過(guò)高或者過(guò)低均會(huì)對(duì)菌群的降解能力產(chǎn)生影響.較低的溫度會(huì)使細(xì)胞膜的流動(dòng)性變差,PAEs 的溶解度變低,阻礙微生物對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和養(yǎng)分的吸收;較高的溫度則會(huì)使細(xì)胞內(nèi)相關(guān)酶的活性降低和核酸變性,使PAEs 降解率變低[30].相比之下,本研究篩選的菌群在較高或較低的溫度條件下對(duì)PAEs 的降解率仍可以達(dá)到60%以上,在不同溫度環(huán)境下降解PAEs 具備一定的優(yōu)勢(shì).

2.4.3 鹽度 鹽度是影響菌群降解PAEs 的關(guān)鍵因素之一.由圖4(c)可見(jiàn),不同鹽度條件下菌群降解PAEs 的能力差異較明顯.隨著鹽度的增加,菌群對(duì)PAEs的降解率逐漸降低,在1%～2%范圍內(nèi)降解效果較好.當(dāng)鹽度在8%時(shí),PAEs 降解率僅28.59%.周婷等[31]在研究鹽度條件對(duì)菌群ZM 降解DMP 的影響時(shí)發(fā)現(xiàn),當(dāng)鹽度增加到4%時(shí),菌群對(duì)DMP 的降解率幾乎為0.可能的原因是高鹽度會(huì)使蛋白質(zhì)發(fā)生變性,致使酶的活性受到抑制[32],同時(shí)高鹽度會(huì)使微生物耗氧速率變低,導(dǎo)致PAEs 降解率下降[33].對(duì)比之前的研究,本研究篩選的菌群在鹽度為4%時(shí)仍具備比較好的PAEs 降解能力,說(shuō)明其對(duì)PAEs 降解具備較高的耐鹽性和廣泛的鹽度范圍.

2.4.4 底物濃度 底物濃度對(duì)菌群降解PAEs 的影響如圖4(d)所示.菌群對(duì)PAEs 的最大降解率主要集中在 5～10mg/L,降解率最大可達(dá) 76.73%(5mg/L).當(dāng)濃度在2mg/L 和15～20mg/L 時(shí),菌群對(duì)PAEs 的降解率顯著降低.徐瑩[34]在研究菌株FA1對(duì)芘的降解特性時(shí)發(fā)現(xiàn)了類似的現(xiàn)象.可見(jiàn)底物濃度過(guò)高或者過(guò)低均會(huì)影響菌群的降解活性.這可能是由于底物濃度過(guò)低不容易引起菌群相關(guān)降解基因的表達(dá),使其不能將底物充分利用;濃度過(guò)高則會(huì)對(duì)微生物產(chǎn)生毒性,影響微生物的生長(zhǎng)和降解活性[35].

2.5 功能內(nèi)生菌群定殖效能

功能內(nèi)生細(xì)菌相較于其他菌株,能夠更好地適應(yīng)植物體內(nèi)的環(huán)境,與宿主植物形成良好的共生體系,發(fā)揮良好的降解效能.本研究中富集馴化的功能內(nèi)生菌群定殖后可以顯著降低水稻體內(nèi)的PAEs 含量(表2).相同培養(yǎng)周期內(nèi),ZR 組水稻體內(nèi)DMP、DEP、DBP 和∑PAEs 的含量與ZK 組相比分別降低了41.09%、45.33%、63.06%和32.30%,BBP 含量無(wú)明顯變化.Xu 等[36]將內(nèi)生菌株Bacillus subtilis strain HB-T2 定殖到卷心菜體內(nèi),發(fā)現(xiàn)定殖HB-T2 的卷心菜根、莖中DBP 的殘留濃度分別為未接種HB-T2卷心菜相應(yīng)組織的29.3%和52.4%.

表2 水培15d 后水稻體內(nèi)PAEs 的含量Table 2 Contents of PAEs in rice after 15 days of hydroponic culture

功能內(nèi)生細(xì)菌定殖到植物體內(nèi)后,一方面會(huì)使植物體內(nèi)相關(guān)降解酶系活性發(fā)生變化進(jìn)而促進(jìn)植物體內(nèi)有機(jī)污染物的去除.陳學(xué)斌等[37]研究發(fā)現(xiàn),玉米接種菌株XB 能顯著提高玉米體內(nèi)超氧化物歧化酶、過(guò)氧化氫酶及多酚氧化酶活性,緩解土壤DEHP對(duì)玉米生長(zhǎng)的脅迫,降低玉米吸收積累DEHP;另一方面,功能內(nèi)生細(xì)菌可以增加植物體內(nèi)降解基因豐度.Zhang 等[38]將功能內(nèi)生菌群CEB 定殖到植物體內(nèi),增加了植物體內(nèi)PAHs 代謝相關(guān)功能基因的拷貝數(shù),促進(jìn)了植物體內(nèi)PAHs 的去除.此外,有研究指出功能內(nèi)生細(xì)菌可以以植物體內(nèi)的氨基酸、葡萄糖等內(nèi)源性有機(jī)物為碳源和能源物質(zhì),提高自身的共代謝能力以促進(jìn)植物體內(nèi)污染物的去除[39].因此,定殖功能內(nèi)生細(xì)菌有望降低作物體內(nèi)PAEs 的積累.對(duì)比以往針對(duì)單一PAEs 的研究,本研究篩選獲得的菌群定殖植物后能夠有效去除植物體內(nèi)3 種PAEs,在實(shí)現(xiàn)實(shí)際污染區(qū)作物體內(nèi)PAEs 的消減方面具備一定優(yōu)勢(shì),在保障PAEs 污染區(qū)農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全和人體健康方面具有較廣闊的應(yīng)用前景.

此外,菌群的定殖促進(jìn)了水稻的生長(zhǎng),提高了植株生物量(表3).定殖的促生效應(yīng)在根長(zhǎng)、株高、鮮重、干重上均比較顯著.定殖后根長(zhǎng)和株高分別提高了13.01%和28.63%,鮮重和干重分別提高了14.91%和20.83%.功能內(nèi)生菌群主要通過(guò)以下兩個(gè)途徑促進(jìn)植物生長(zhǎng):一方面,內(nèi)生細(xì)菌可以通過(guò)固氮、磷酸鹽溶解和鐵螯合等作用,促進(jìn)植物對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收[40];另一方面,部分內(nèi)生細(xì)菌還可以通過(guò)調(diào)節(jié)激素水平來(lái)促進(jìn)植物生長(zhǎng)[41].

表3 水培15d 后水稻的生物量Table 3 Biomass of rice after 15days of hydroponic incubation

3 結(jié)論

3.1 本研究富集馴化了一組具有降解4 種USEPA優(yōu)控PAEs 能力的功能內(nèi)生菌群,純培養(yǎng)體系中,7d內(nèi)該菌群對(duì)DMP、DEP、DBP、BBP 的降解率分別達(dá)到97.08%、94.47%、98.02%和44.82%.

3.2 菌群在門(mén)分類水平上主要由變形菌門(mén)(Proteobacteria,76.57%)、擬桿菌門(mén)(Bacteroidetes,21.04%)和放線菌門(mén)(Actinobacteria,2.37%)組成;在屬分類水平上主要由鞘氨醇桿菌屬(Sphingobacterium, 33.03%)、代爾夫特菌屬(Delftia,40.61%)、假單胞菌屬(Pseudomonas, 11.70%)、無(wú)色桿菌屬(Achromobacter,3.04%) 和根瘤菌屬(Rhizobium, 6.90%)組成.

3.3 菌群的最佳降解條件為:pH 7、25℃、鹽度1%、底物濃度5mg/L.

3.4 水培條件下,以浸根的方式將菌群定殖到水稻體內(nèi)可以有效降低植物中PAEs 的含量,15d 內(nèi)DMP、DEP、DBP 和∑PAEs 的去除率分別達(dá)到41.09%、45.33%、63.06%和32.3%,同時(shí)該菌群還能夠促進(jìn)作物的生長(zhǎng),提高作物產(chǎn)量.