張紅玉，李會(huì)珍*，張志軍，李河，侯天宇，王丹，李孟昊，葉童妹

（1.中北大學(xué)化學(xué)工程與技術(shù)學(xué)院，山西 太原 030051；2.中北大學(xué) 晉中產(chǎn)業(yè)技術(shù)創(chuàng)新研究院，山西 晉中 030600）

紫蘇（PerillafrutescensL.）是唇形科一年生草本植物，主要分布在中國(guó)、日本、韓國(guó)、緬甸、印度尼西亞和俄羅斯[1]。紫蘇可藥食兩用，在中國(guó)被當(dāng)作油料作物種植，廣泛用于烹飪和傳統(tǒng)醫(yī)藥[2]。紫蘇籽油中不飽和脂肪酸含量高達(dá)90%以上，其中ω-3 系列多不飽和脂肪酸是紫蘇油中的主要不飽和脂肪酸[3]，具有抗炎、改善認(rèn)知、降低膽固醇、降低結(jié)腸癌發(fā)病率、預(yù)防心腦血管疾病的功效[4-7]。紫蘇粕是紫蘇籽榨油后的副產(chǎn)物，富含多種有效成分，其中蛋白質(zhì)含量占40%左右，脫脂紫蘇粕的蛋白富集率可提升至57.90%[8]，是一種極具開發(fā)潛力的蛋白資源。

活性肽是具有多種生物活性的多肽，如抗氧化、抑菌、抗炎、抗癌、抗疲勞、免疫調(diào)節(jié)、降血壓等[9-10]。然而活性肽在母體蛋白質(zhì)內(nèi)并沒有活性，需要通過化學(xué)法、微生物發(fā)酵法或酶解法將其釋放[11]?；瘜W(xué)法和微生物法存在環(huán)境污染、產(chǎn)品質(zhì)量不穩(wěn)定、生產(chǎn)周期長(zhǎng)等問題。酶解法反應(yīng)條件溫和，便于操作，產(chǎn)品安全性較高。酶解產(chǎn)物氨基酸組成因不同蛋白酶的酶切位點(diǎn)不同而產(chǎn)生變化，通過改變蛋白酶種類，控制酶解條件可獲得具有不同生物活性的活性肽[12]。本文以水解度為指標(biāo)，采用堿性蛋白酶酶解脫脂紫蘇粕制備紫蘇粕多肽，通過單因素試驗(yàn)、響應(yīng)面法優(yōu)化脫脂紫蘇粕的酶解工藝，高效液相色譜分析測(cè)定紫蘇多肽氨基酸組成，并通過添加不同食品配料檢測(cè)其抗氧化穩(wěn)定性，以期為紫蘇粕精深加工和高值化利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

脫脂紫蘇粕（粗蛋白含量約為57.90%，粗脂肪含量約為0.51%）：中北大學(xué)晉中產(chǎn)業(yè)技術(shù)創(chuàng)新研究院實(shí)驗(yàn)室自制；堿性蛋白酶（30 000 U/mL）：南寧東恒華道生物科技有限責(zé)任公司；茚三酮、過硫酸鉀：上海阿拉丁生化科技股份有限公司；十二水磷酸氫二鈉、21 種氨基酸標(biāo)品：上海麥克林生化科技有限公司；2，2-聯(lián)氨-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸[2，2'-azino-bis（3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid），ABTS]：索萊寶生物科技有限公司；1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）：上?；晒I(yè)發(fā)展有限公司；4-氯-3，5-二硝基三氟甲苯（4-chloro-3，5-dinitrobenzotrifluoride，CNBF）：上海凜恩科技發(fā)展有限公司；果糖、無(wú)水乙酸鈉、冰乙酸、葡萄糖、檸檬酸、NaOH、濃鹽酸、NaCl：天津市恒興化學(xué)試劑制造有限公司。所用試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

數(shù)顯恒溫水浴鍋（HH-4）、數(shù)顯集熱式磁力攪拌器（DF-Ⅱ）：金壇市杰瑞爾電器有限公司；可見分光光度計(jì)（V-1200）：上海美譜達(dá)儀器有限公司；臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)（TGL-16.5M）：上海盧湘儀離心機(jī)儀器有限公司；酸度計(jì)（PB-10）：賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司；高效液相色譜（UltiMate 3000）：美國(guó)Thermo 有限公司；分析型天平（HZK-FA210）：華志（福建）電子科技有限公司；電子天平（JM-B5003）：余姚記銘稱重校驗(yàn)設(shè)備有限公司；干式氮吹儀（LC-DCY-12G）邦西儀器科技（上海）有限公司；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（RE-2000A）：上海亞榮生化儀器廠。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 紫蘇粕多肽的制備

將紫蘇粕粉碎，過40 目篩，稱取定量紫蘇粕，加入適量水，攪拌均勻，用NaOH 或HCl 調(diào)節(jié)pH 值，加入堿性蛋白酶，于恒溫水浴鍋中酶解一定時(shí)間。然后置于沸水浴中10 min 滅酶，在10 000 r/min、4 ℃條件下離心10 min，取上清液測(cè)定水解度，上清液冷凍干燥即得紫蘇粕多肽粉。

1.3.2 水解度的測(cè)定

紫蘇粕完全水解液制備：取0.05 g 紫蘇粕于水解管中，加入10 mL 6 mol/L HCl，氮吹后密封，110 ℃反應(yīng)24 h，然后用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀去除鹽酸，蒸餾水定容至100 mL。

游離-NH2采用茚三酮顯色法[13]測(cè)定。

水解度為被水解的肽鍵數(shù)占原料總肽鍵數(shù)的比值，參考余勃等[14]的方法測(cè)定脫脂紫蘇粕酶解液水解度（X，%），計(jì)算公式如下。

式中：A為酶解液中總游離-NH2摩爾數(shù)，mmol；A0為紫蘇粕中固有游離-NH2摩爾數(shù)，mmol；A總為紫蘇粕完全水解液中總游離-NH2摩爾數(shù)，mmol。

1.3.3 單因素試驗(yàn)

在一定條件下，分別考察酶解時(shí)間、初始pH 值、酶解溫度、底物濃度、加酶量對(duì)酶解液水解度的影響。參數(shù)考察范圍分別為酶解時(shí)間2、4、6、8、10 h，初始pH9、10、11、12、13，酶解溫度45、50、55、60、65 ℃，底物濃度3%、6%、9%、12%、15%，加酶量3 000、5 000、7 000、9 000、11 000 U/g。

1.3.4 響應(yīng)面試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，選擇底物濃度、酶解溫度、初始pH 值為優(yōu)化因素，利用Design Expert 軟件進(jìn)行三因素三水平的響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)，以水解度為響應(yīng)值，優(yōu)化堿性蛋白酶酶解脫脂紫蘇粕制備紫蘇粕多肽的工藝條件?；趩我蛩卦囼?yàn)及響應(yīng)面法優(yōu)化分析結(jié)果，得到最佳酶解工藝條件，并對(duì)最佳酶解參數(shù)進(jìn)行驗(yàn)證。因素水平見表1。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)因素水平Table 1 Factors and levels in response surface design

1.3.5 氨基酸組成分析

參考張可可[15]的方法，采用Hypersil GOLD C18Selectivity HPLC Columns（250 mm×4.6 mm，5μm）測(cè)定紫蘇粕多肽氨基酸組成。稱取10 mg 紫蘇粕多肽于消解管中，加入6 mol/L HCl 5 mL，滴加3～4 滴苯酚，充氮封口，于110 ℃油浴水解24 h，結(jié)束后旋干，0.1 mol/L pH9.0 硼酸緩沖液定容至5 mL。取100μL 21 種氨基酸混合對(duì)照品溶液或樣品水解液于2 mL 離心管中，加入200μL 0.1 mol/L CNBF 衍生劑（溶于乙腈）、700μL硼酸緩沖液，60 ℃水浴衍生化30 min 后經(jīng)0.2μm 過濾膜過濾后進(jìn)樣。

流動(dòng)相A 相：乙腈，B 相：0.05 mol/L pH5.65～5.70 乙酸鈉緩沖液，梯度洗脫：0 min，20%A；0～15 min，20%～38%A；15～35 min，38%～48%A；35～38 min，48%～49%A；38～42 min，49%～75%A；42～50 min，75%A；50～55 min，75%～20%A；55～78 min，20%A；流速為0.28 mL/min；進(jìn)樣體積：20μL；檢測(cè)波長(zhǎng)：240 nm；柱溫：25 ℃。

1.3.6 抗氧化活性測(cè)定

DPPH 自由基清除率和ABTS+自由基清除率參照GB/T 39100—2020《多肽抗氧化性測(cè)定DPPH 和ABTS法》測(cè)定，以VC為陽(yáng)性對(duì)照。在DPPH 自由基清除率的測(cè)定中，樣品濃度梯度為0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0 mg/mL，VC濃度梯度為0.005、0.010、0.015、0.020、0.025、0.030、0.035、0.040、0.045、0.050、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0 mg/mL；在ABTS+自由基清除率的測(cè)定中，樣品濃度梯度為0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6 mg/mL，VC濃度梯度為0.005、0.010、0.015、0.020、0.025、0.030、0.035、0.040、0.045、0.050、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6 mg/mL。

1.3.7 抗氧化穩(wěn)定性測(cè)定

1.3.7.1 溫度對(duì)紫蘇粕多肽抗氧化活性的影響

配制質(zhì)量濃度為0.6 mg/mL 紫蘇粕多肽溶液，分別在20、40、60、80、100、120 ℃條件下保溫1 h 后取出，冰水浴5 min，測(cè)定DPPH 自由基清除率和ABTS+自由基清除率。

1.3.7.2 pH 值對(duì)紫蘇粕多肽抗氧化活性的影響

配制質(zhì)量濃度為0.6 mg/mL 紫蘇粕多肽溶液，用1 mol/L HCl 或NaOH 調(diào)節(jié)pH 值至2、4、6、8、10，室溫放置1 h 后調(diào)節(jié)pH 值至7.0，測(cè)定DPPH 自由基清除率和ABTS+自由基清除率。

1.3.7.3 食品配料對(duì)紫蘇粕多肽抗氧化活性的影響

配制質(zhì)量濃度為0.6 mg/mL 紫蘇粕多肽溶液，分別添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)2%、4%、6%、8%、10% 的NaCl、檸檬酸和葡萄糖，室溫放置1 h，測(cè)定DPPH 自由基清除率和ABTS+自由基清除率。

1.4 數(shù)據(jù)處理

每次試驗(yàn)至少3 次重復(fù)，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，數(shù)據(jù)采用IBM SPSS Statistics 25、Origin 2018 和Design Expert 8.06 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 酶解時(shí)間對(duì)水解度的影響

酶解時(shí)間對(duì)水解度的影響見圖1。

圖1 酶解時(shí)間對(duì)水解度的影響Fig.1 Effect of hydrolysis time on the degree of hydrolysis

由圖1 可知，水解度隨酶解時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸增大隨后趨于穩(wěn)定。在2～4 h 內(nèi)，酶解液水解度緩慢提升，在4～8 h 內(nèi)，酶解液水解度急劇增加，在8 h 時(shí)達(dá)到峰值，為（10.954±0.397）%。此后，由于底物分子濃度降低，酶解反應(yīng)趨于平衡[16]，水解度不再增加，考慮到成本，選擇8 h 為最適酶解時(shí)間。

2.1.2 初始pH 值對(duì)水解度的影響

初始pH 值對(duì)水解度的影響見圖2。

圖2 初始pH 值對(duì)水解度的影響Fig.2 Effect of initial pH on the degree of hydrolysis

如圖2 所示，初始pH 值從9 增加到12 時(shí)，水解度呈現(xiàn)出上升趨勢(shì)，在初始pH 值為12 時(shí)達(dá)到峰值，為（16.952±0.471）%。初始pH 值進(jìn)一步增加至13，強(qiáng)堿條件使堿性蛋白酶構(gòu)象發(fā)生變化，酶活性受到抑制[12]，水解度急劇下降，下降幅度達(dá)到71.85%。因此選擇初始pH 值11、12、13 進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

2.1.3 酶解溫度對(duì)水解度的影響

酶解溫度對(duì)水解度的影響見圖3。

圖3 酶解溫度對(duì)水解度的影響Fig.3 Effect of hydrolysis temperature on the degree of hydrolysis

如圖3 所示，在酶解溫度為45～60 ℃時(shí)，水解度隨酶解溫度的升高有所增加，可能是由于酶解溫度升高，分子運(yùn)動(dòng)加快，酶與底物在單位時(shí)間內(nèi)的有效碰撞次數(shù)增多，酶的催化效率提高[17]。當(dāng)酶解溫度由60 ℃升高到65 ℃時(shí)，水解度急劇下降，由最高值（17.410±0.193）%降至（10.003±0.511）%，降低幅度達(dá)42.545%?？赡苁怯捎诿附鉁囟冗^高導(dǎo)致堿性蛋白酶變性，活性下降[18]。因此，選擇酶解溫度55、60、65 ℃進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

2.1.4 底物濃度對(duì)水解度的影響

底物濃度對(duì)水解度的影響見圖4。

圖4 底物濃度對(duì)水解度的影響Fig.4 Effect of substrate concentration on the degree of hydrolysis

如圖4 所示，在底物濃度為3%～6%時(shí)，隨著底物濃度增加，脫脂紫蘇粕中蛋白質(zhì)在溶液體系中的溶解量增加，酶與底物結(jié)合的概率增大，酶解速率提升，水解度升高，在底物濃度為6% 時(shí)，水解度達(dá)到峰值，為（20.646±0.077）%。底物濃度繼續(xù)增加，則表現(xiàn)出底物抑制作用，底物分子與蛋白酶非活性部位結(jié)合，催化效率降低[19]，從而導(dǎo)致水解度降低。因此，選擇底物濃度3%、6%、9%進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

2.1.5 加酶量對(duì)水解度的影響

加酶量對(duì)水解度的影響見圖5。

圖5 加酶量對(duì)水解度的影響Fig.5 Effect of the protease dosage on the degree of hydrolysis

如圖5 所示，隨加酶量的增加，水解度呈現(xiàn)出先增大后趨于穩(wěn)定的趨勢(shì)。在加酶量為3 000～7 000 U/g時(shí)，隨蛋白酶用量的增加，單位時(shí)間內(nèi)蛋白酶與底物的結(jié)合概率增加，水解度逐漸增高。當(dāng)加酶量超過7 000 U/g 時(shí)，水解度開始降低，這可能是由于在酶過量的情況下，酶解產(chǎn)物和酶形成復(fù)合物，阻止底物與酶的結(jié)合，降低酶活性，表現(xiàn)出底物抑制作用[20]。因此，選擇7 000 U/g 為最佳加酶量。

2.2 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果與分析

2.2.1 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

單因素試驗(yàn)結(jié)果顯示，底物濃度、酶解溫度及初始pH 值對(duì)水解度影響較大。因此，使用Design Expert 8.06對(duì)3 個(gè)因素進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化，共17 個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)，包括12個(gè)分析因點(diǎn)和5 個(gè)零點(diǎn)。表2 為響應(yīng)面的設(shè)計(jì)及結(jié)果。

表2 響應(yīng)面法試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table 2 Design and results of respond surface experiments

對(duì)表2 水解度的數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合，得到脫脂紫蘇粕堿性蛋白酶酶解液水解度對(duì)底物濃度（A）、溫度（B）及初始pH 值（C）的多元二次回歸方程：水解度=20.604 2+1.485 5A-0.732 25B-5.876 75C+1.983 25AB-1.485 75AC+0.748 75BC-2.209 575A2-2.023 57B2-6.289 075C2。

2.2.2 響應(yīng)面回歸模型的建立與分析

回歸方程的方差分析結(jié)果如表3 所示。

表3 模型回歸方程方差分析Table 3 ANOVA of the regression equation

由表3 可知，所得模型極顯著（p=0.000 4＜0.01），失擬項(xiàng)不顯著（p=0.057 3＞0.05），說明此方程對(duì)試驗(yàn)擬合度較好。模型確定系數(shù)R2=0.961，表明影響水解度的因素與所擇取的3 個(gè)變量相關(guān)度為96.1%，說明應(yīng)用該回歸模型能夠有效預(yù)測(cè)脫脂紫蘇粕的水解度。

由Design-Expert V8.0.6 軟件分析得到堿性蛋白酶酶解脫脂紫蘇粕的最佳酶解工藝為底物濃度7.45%、酶解溫度59.83 ℃、初始pH11.47。在此條件下，水解度預(yù)測(cè)值為22.538%。按照試驗(yàn)可操作性，將條件調(diào)整為底物濃度7.5%、酶解溫度60 ℃、初始pH11.5，在此條件下的實(shí)際水解度為（23.462±0.237）%，與預(yù)測(cè)值相對(duì)誤差為4.1%（＜5%），表明由響應(yīng)面法優(yōu)化得到的最佳條件可信。

2.2.3 響應(yīng)面交互作用分析

各因素交互作用響應(yīng)面及等高線圖見圖6～圖8。

圖6 底物濃度與酶解溫度對(duì)水解度影響的響應(yīng)面及等高線圖Fig.6 Response surface and contour map of the effect of the interaction between substrate concentration and hydrolysis temperature on the degree of hydrolysis

由圖6～圖8 可知，3 個(gè)因素的響應(yīng)面三維立體圖均開口向下，有最大值，等高線圖呈橢圓形，說明各因素間存在交互作用。對(duì)模型的方差分析表明，3 個(gè)因素的交互作用對(duì)水解度的影響均不顯著（p＞0.05）。

由圖6 可知，當(dāng)初始pH 值（C）固定在中心值12時(shí)，隨酶解溫度（A）和底物濃度（B）的增加，水解度均呈現(xiàn)先增高后降低的現(xiàn)象，且趨勢(shì)均較為緩慢。由圖7 可知，當(dāng)酶解溫度（B）固定在中心值60 ℃時(shí)，隨底物濃度（A）和初始pH 值（C）的增加，水解度均呈現(xiàn)先增高后降低的現(xiàn)象；水解度隨初始pH 值變化的趨勢(shì)較明顯，而隨底物濃度變化較緩慢。由圖8 可知，當(dāng)?shù)孜餄舛龋ˋ）固定在中心值6% 時(shí)，隨酶解溫度（B）和初始pH 值（C）的增加，水解度均呈現(xiàn)先增高后降低的現(xiàn)象；水解度隨初始pH 值變化的趨勢(shì)較明顯，而隨酶解溫度變化較緩慢。由表3 可知，因素項(xiàng)C、C2為極顯著水平，A2為顯著水平。綜合響應(yīng)面、等高線圖及方差分析可知，各因素對(duì)酶解液水解度的影響順序?yàn)镃＞A＞B，即初始pH 值＞底物濃度＞溫度。

圖7 底物濃度與初始pH 值對(duì)水解度影響的響應(yīng)面及等高線圖Fig.7 Response surface and contour map of the effect of the interaction between substrate concentration and initial pH on the degree of hydrolysis

圖8 酶解溫度與初始pH 值對(duì)水解度影響的響應(yīng)面及等高線圖Fig.8 Response surface and contour map of the effect of the interaction between hydrolysis temperature and initial pH on the degree of hydrolysis

2.3 紫蘇粕多肽氨基酸組成分析

紫蘇粕多肽的氨基酸組成分析檢測(cè)結(jié)果如表4 所示。

表4 紫蘇粕多肽氨基酸組成Table 4 Amino acid composition in the polypeptides prepared from perilla meal

如表4 所示，紫蘇粕多肽共有17 種氨基酸，包括7 種必需氨基酸和10 種非必需氨基酸，未檢測(cè)出天冬酰胺、谷氨酰胺和亮氨酸。紫蘇粕多肽總氨基酸含量達(dá)90.09%，必需氨基酸占總氨基酸含量的56.48%，接近聯(lián)合國(guó)糧食和農(nóng)業(yè)組織/聯(lián)合國(guó)世界衛(wèi)生組織（Food and Agricultural Organization of the United Nations/The World Health Organization，F(xiàn)AO/WHO）推薦值60%。疏水性氨基酸、正電荷氨基酸、負(fù)電荷氨基酸含量均較高，分別為36.19%、36.74%和19.51%。這可能是紫蘇粕多肽抗氧化活性較強(qiáng)的原因之一。所有氨基酸種類中，精氨酸含量最高，達(dá)到（286.635±0.357）mg/g。精氨酸參與蛋白質(zhì)的生物合成、宿主免疫反應(yīng)、尿素循環(huán)和一氧化氮的產(chǎn)生等生物過程[21]。富含精氨酸的飲食源蛋白質(zhì)已被報(bào)道了多種生物活性，如抑菌、降壓、促血管生成、治療神經(jīng)退行性疾病等[22-23]。因此紫蘇粕多肽作為功能食品開發(fā)潛力較大。

2.4 紫蘇粕多肽抗氧化活性分析

紫蘇粕多肽抗氧化活性見圖9。

圖9 紫蘇粕多肽抗氧化活性Fig.9 Antioxidant activity of perilla meal polypeptides

如圖9 所示，紫蘇粕多肽的抗氧化活性具有明顯的劑量效應(yīng)，其DPPH 自由基清除率和ABTS+自由基清除率均表現(xiàn)出隨濃度增加而提高，隨后趨于穩(wěn)定的趨勢(shì)?？傮w上，紫蘇粕多肽的抗氧化活性不及陽(yáng)性對(duì)照VC，兩者的DPPH 自由基清除率分別穩(wěn)定在68%和95%左右，但ABTS+自由基清除率均能達(dá)到100%。紫蘇粕多肽DPPH 自由基清除率曲線在濃度為0.6 mg/mL 時(shí)到達(dá)拐點(diǎn)，因此選擇在該濃度下進(jìn)行紫蘇粕多肽的抗氧化穩(wěn)定性分析試驗(yàn)。

2.4.1 溫度對(duì)紫蘇粕多肽抗氧化活性的影響

溫度對(duì)紫蘇粕多肽抗氧化活性的影響見圖10。

圖10 溫度對(duì)紫蘇粕多肽抗氧化活性的影響Fig.10 Effect of temperature on the antioxidant activity of perilla meal polypeptides

如圖10 所示，紫蘇粕多肽的抗氧化活性在較寬的溫度范圍內(nèi)保持穩(wěn)定。在20～100 ℃間，紫蘇粕多肽的DPPH 自由基清除率維持在67% 左右，進(jìn)一步提高溫度至120 ℃，其DPPH 自由基清除率降低至（61.558±1.692）%，降低幅度僅為8.122%。在40～80 ℃間，紫蘇粕多肽的ABTS+自由基清除率維持在66%左右，當(dāng)溫度超過80 ℃，其ABTS+自由基清除率有上升的趨勢(shì)。溫度為100 ℃時(shí)，紫蘇粕多肽ABTS+自由基清除率為（69.161±1.629）%，提高幅度為4.79%；溫度為120 ℃時(shí)，紫蘇粕多肽ABTS+自由基清除率為（71.848±2.148）%，提高幅度進(jìn)一步增加至8.861%。紫蘇粕多肽的DPPH 自由基清除率和ABTS+自由基清除率在高溫條件下呈現(xiàn)出相反的變化趨勢(shì)，可能是因?yàn)楦邷夭]有引起多肽的不可逆變性，僅改變了二級(jí)結(jié)構(gòu)，從而影響了其抗氧化活性[24-25]。綜上所述，紫蘇粕多肽在20～100 ℃以內(nèi)均可進(jìn)行加工和保存。

2.4.2 pH 值對(duì)紫蘇粕多肽抗氧化活性的影響

pH 值對(duì)紫蘇粕多肽抗氧化活性的影響見圖11。

圖11 pH 值對(duì)紫蘇粕多肽抗氧化活性的影響Fig.11 Effect of pH on the antioxidant activity of perilla meal polypeptides

如圖11 所示，pH 值對(duì)紫蘇粕多肽DPPH 自由基清除率的影響顯著（p＜0.05），在pH 值為6 時(shí)最高，為（67.394±0.285）%。增加或降低pH 值均會(huì)引起DPPH自由基清除率的下降。當(dāng)pH 值為2 及pH 值為10時(shí)，紫蘇粕多肽的DPPH 自由基清除率分別為（62.107±0.092）%、（35.249±3.666）%，較pH 值為6 時(shí)的降低幅度分別為7.845% 和47.697%。研究表明，pH 值的變化可改變帶電氨基酸之間的靜電相互作用，影響多肽分子的形狀，導(dǎo)致化學(xué)性質(zhì)的改變[26]。酸性條件下，多肽的溶解度降低，羥基的有效性減弱，從而降低了其DPPH 自由基清除活性[27]，這種變化可能是可逆的，因此紫蘇粕多肽在強(qiáng)酸條件下，經(jīng)過1 h 的反應(yīng)回到中性條件后，DPPH 自由基清除活性降低并不明顯。而堿性條件下，降低活性肽的DPPH 自由基清除率的因素更多，包括外消旋作用、脫酰胺作用[28]以及供氫體上的氫的消耗[29]，這些變化可能是不可逆的，因此紫蘇粕多肽在強(qiáng)堿條件下，經(jīng)過1 h 的反應(yīng)回到中性條件后，DPPH 自由基清除活性顯著降低。而pH 值對(duì)紫蘇粕多肽的ABTS+自由基清除活性沒有顯著影響（p＞0.05），其ABTS+自由基清除率穩(wěn)定在68% 左右。ABTS+自由基可通過抗氧化劑轉(zhuǎn)移電子或氫質(zhì)子清除，而DPPH 自由基則主要依靠抗氧化劑轉(zhuǎn)移氫質(zhì)子消除。因此堿性條件下氫質(zhì)子減少，紫蘇粕多肽的DPPH 自由基清除率降低，而ABTS+自由基依然可以靠電子轉(zhuǎn)移得到清除，從而將ABTS+自由基清除率維持在一定水平[30]。綜上所述，紫蘇粕多肽可在中性、弱酸性環(huán)境中進(jìn)行加工和保存。

2.4.3 食品配料對(duì)紫蘇粕多肽抗氧化活性的影響

食品配料對(duì)紫蘇粕多肽抗氧化活性的影響見圖12。

圖12 食品配料對(duì)紫蘇粕多肽抗氧化活性的影響Fig.12 Effects of food ingredients on the antioxidant activity of perilla meal polypeptides

如圖12a 所示，隨NaCl 質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加，紫蘇粕多肽的抗氧化活性稍有升高，但無(wú)顯著差異（p＞0.05），其DPPH 自由基清除率和ABTS+自由基清除率分別上升1.79% 和8.85%。這與鄭志強(qiáng)等[31]、胡曉等[32]的研究結(jié)果一致，NaCl 在水溶液中電離的Na+和Cl-能中和紫蘇粕多肽表面的電荷，從而破壞水化膜，暴露其氫供體以增強(qiáng)抗氧化活性。因此，在紫蘇粕多肽的加工與應(yīng)用中可適量添加NaCl。

如圖12b 所示，檸檬酸對(duì)ABTS+自由基清除活性有明顯抑制作用。檸檬酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)由0% 增加到2%時(shí)，紫蘇粕多肽的ABTS+自由基清除率降低了51.14%，質(zhì)量分?jǐn)?shù)繼續(xù)增加，ABTS+自由基清除率維持在32%左右，這可能是由于檸檬酸的加入降低了體系的pH 值，影響了紫蘇粕多肽的供電子能力，導(dǎo)致ABTS+自由基清除活性下降。而玉米抗氧化肽Leu-Pro-Phe 和抗氧化硒肽SeMet-Pro-Ser 在加入2% 檸檬酸后，完全喪失ABTS+自由基清除活性，這可能是由于紫蘇粕多肽富含多種抗氧化氨基酸，對(duì)檸檬酸的抗性強(qiáng)于只含有幾種氨基酸的單肽[33-34]。DPPH 自由基清除率隨檸檬酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)增加呈現(xiàn)出先降低后升高并保持穩(wěn)定的趨勢(shì)，變化具有顯著性（p＜0.05），但變化幅度較?。ǎ?.5%）。因此，在紫蘇粕多肽的加工與應(yīng)用中應(yīng)盡量避免添加檸檬酸。

如圖12c 所示，葡萄糖對(duì)紫蘇粕多肽的DPPH 自由基清除活性與ABTS+自由基清除活性的影響完全相反。紫蘇粕多肽的DPPH 自由基清除率與葡萄糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)呈正相關(guān)（p＜0.05），ABTS+自由基清除率與葡萄糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)呈負(fù)相關(guān)，但作用不顯著（p＞0.05），這與欒曉旭等[27]的研究結(jié)果一致。多肽與還原糖可發(fā)生美拉德反應(yīng)，生成的醛、酮類還原性化合物可增加多肽的抗氧化活性[35]。因此，在紫蘇粕多肽的加工與應(yīng)用中可少量添加葡萄糖。

3 結(jié)論

本文以脫脂紫蘇粕為原料，采用堿性蛋白酶酶解法制備紫蘇粕多肽。在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，采用響應(yīng)面法優(yōu)化脫脂紫蘇粕酶解工藝。結(jié)果表明，最佳酶解工藝條件為酶解時(shí)間8 h、初始pH11.5、底物濃度7.5%、酶解溫度60 ℃、加酶量7 000 U/g，在此條件下，酶解液水解度為（23.462±0.237）%。在最優(yōu)工藝條件下獲得的紫蘇粕多肽具有良好的氨基酸組成和抗氧化穩(wěn)定性。紫蘇粕多肽由7 種必需氨基酸和10 種非必需氨基酸組成，EAA/NEAA 為56.48%，接近FAO/WHO推薦值，其中正電荷氨基酸精氨酸含量達(dá)（286.635±0.357）mg/g。紫蘇粕多肽的DPPH 自由基清除率和ABTS+自由基清除率在一定濃度條件下能達(dá)到68%和100%。紫蘇粕多肽對(duì)溫度的敏感性不高，在20～100 ℃的溫度范圍內(nèi)保持良好的抗氧化活性。強(qiáng)堿條件下（pH10）紫蘇粕多肽的DPPH 自由基清除率降低了47.697%。食品原料對(duì)紫蘇粕多肽抗氧化活性的影響各不相同，NaCl 增強(qiáng)紫蘇粕多肽的DPPH 自由基和ABTS+自由基清除率（p＞0.05），檸檬酸顯著降低紫蘇粕多肽的ABTS+自由基清除率（p＜0.05），葡萄糖增強(qiáng)紫蘇粕多肽的DPPH 自由基清除率。綜上，該工藝制備的紫蘇粕多肽具有良好氨基酸組成和抗氧化穩(wěn)定性，在其加工和應(yīng)用中應(yīng)盡量避免高溫和強(qiáng)堿，可適量添加NaCl 和葡萄糖。研究結(jié)果可為紫蘇粕多肽的生產(chǎn)和應(yīng)用提供技術(shù)支撐，對(duì)促進(jìn)紫蘇資源綜合開發(fā)利用具有重要的實(shí)踐指導(dǎo)意義。