袁珊 楊玉瑩 許梅梅 胡廣澤 高蕊

摘要： 目的 皮層是響應(yīng)腦缺血缺氧最為敏感的組織之一，基于前期深度測(cè)序技術(shù)，我們篩選獲得響應(yīng)腦缺血缺氧應(yīng)激的皮層區(qū)目標(biāo)基因miR-181a及Bcl-2。本研究旨在SH-SY5Y細(xì)胞株氧糖剝奪/復(fù)糖復(fù)氧模型驗(yàn)證二者靶向調(diào)控關(guān)系及功能，明確miR-181a—Bcl-2調(diào)控網(wǎng)絡(luò)在OGD/R誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞凋亡中的作用。方法 采用線栓法構(gòu)建大鼠缺血缺氧再灌注損傷模型，腦切片TTC染色及行為學(xué)評(píng)分法評(píng)估模型。應(yīng)用qRT-PCR及Western Blot驗(yàn)證目標(biāo)基因的表達(dá)。生物信息學(xué)分析miR-181a與Bcl-2的靶向結(jié)合位點(diǎn)并比對(duì)結(jié)合位點(diǎn)的保守性，雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)驗(yàn)證miR-181a與Bcl-2靶向結(jié)合的特異性。采用OGD/R細(xì)胞模型體外模擬腦缺血再灌注損傷，檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)及Hoechst熒光染色評(píng)估細(xì)胞凋亡。結(jié)果 大鼠大腦中動(dòng)脈阻塞后miR-181a、Bcl-2表達(dá)變化趨勢(shì)相反。RNA hybird軟件預(yù)測(cè)miR-181a可結(jié)合Bcl-2的3′-UTR區(qū)，且結(jié)合區(qū)域高度保守。雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)發(fā)現(xiàn)，相對(duì)于Bcl-2 3′UTR-WT與mimic-NC共轉(zhuǎn)染組，Bcl-2 3′UTR-WT與miR-181a mimic共轉(zhuǎn)染后的熒光活性更低（P＜0.001），而Bcl-2-Mut與miR-181a mimic共轉(zhuǎn)染組，熒光活性無(wú)顯著差異（P＞0.05）。分別用miR-181a的模擬物及抑制物轉(zhuǎn)染OGD/R誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞，miR-181a可以抑制Bcl-2 mRNA及其蛋白的表達(dá)水平（P＜0.001）。過表達(dá) miR-181a顯著增加了SH-SY5Y細(xì)胞的凋亡（P＜0.001），而抑制 miR-181a 表達(dá)可使 SH-SY5Y細(xì)胞凋亡顯著降低（P＜0.001）。結(jié)論 miR-181a 可靶向結(jié)合Bcl-2，下調(diào)miR-181a可通過促進(jìn)Bcl-2的表達(dá)進(jìn)而抑制SH-SY5Y神經(jīng)細(xì)胞OGD/R損傷誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。

關(guān)鍵詞：miR-181a；Bcl-2；SH-SY5Y；OGD/R；凋亡

中圖分類號(hào)： R34文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼

MiR-181a regulates the apoptosis of SH-SY5Y cells induced by OGD/R model by targeting Bcl-2

YUAN? Shan，YANG? Yuying，XU? Meimei，HU? Guangze，GAO? Rui*

（Department of Biochemistry， School of Medicine/The Key Laboratory of Ministry of Education for Xinjiang Endemic & Ethnic Disease， Shihezi University， Shihezi，Xinjiang 832000， China）

Abstract：? Objective

The cortex is one of the most sensitive tissues in response to cerebral hypoxia-ischemia. Based on the previous deep sequencing technology， we screened and obtained cortical target genes miR-181a and Bcl-2 that closely respond to cerebral hypoxia ischemia stress. The aim of this study is to verify the above targeted relationships and functions in SH-SY5Y cell line induced by the oxygen-glucose deprivation/reperfusion （OGD/R）， and to clarify the role of miR-181a-Bcl-2 regulatory network in OGD/R induced nerve cell apoptosis. Methods The model of hypoxic-ischemic and reperfusion injury in rats was established by suture method， and the model was evaluated by TTC staining and behavioral score. Target gene expression was verified by qRT-PCR and Western Blot. Bioinformatics was used to analyze the target binding sites of miR-181a and Bcl-2 and compare the conservation of the binding sites. The specificity of targeted binding between miR-181a and Bcl-2 was confirmed through dual-luciferase reporter gene experiments. The OGD/R model was used to simulate cerebral ischemia-reperfusion injury in vitro. Cell apoptosis was detected by apoptosis-related protein expression and Hoechst fluorescence staining. Results The expression of miR-181a and Bcl-2 was reversed after middle cerebral artery occlusion in rats. RNA hybird software predicted that miR-181a could bind to the 3′-UTR region of Bcl-2 mRNA， and the nucleotides in the binding region were highly conserved. Dual luciferase reporter gene assay showed that compared with the Bcl-2 3′UTR-WT and mimic-NC co-transfection group， the fluorescence activity of Bcl-2 3′-UTR and miR-181a mimic co-transfection group was lower （P<0.001）. There was no significant difference in the fluorescence activity of Bcl-2-Mut co-transfected with miR-181a mimic group （P>0.05）. After the OGD/R model was constructed， SH-SY5Y cells were transfected with miR-181a mimics and inhibitors， respectively. It was found that miR-181a could inhibit the expression levels of Bcl-2 mRNA and protein （P<0.001）. Overexpression of miR-181a significantly increased the apoptosis of SH-SY5Y cells （P<0.001）， while inhibition of miR-181a expression significantly decreased the apoptosis of SH-SY5Y cells （P<0.001）. Conclusion miR-181a can target Bcl-2 and down-regulation of miR-181a can inhibit the OGD/R injury induced apoptosis of SH-SY5Y nerve cells by up-regulating the expression of Bcl-2.

Key words： miR-181a;Bcl-2;SH-SY5Y;OGD/R;apoptosis

0 前言

腦卒中通常分為兩大類：缺血性腦卒中和出血性腦卒中，其中缺血性腦卒中病例占所有腦卒中病例的87%，它是全球第二大死亡原因，同時(shí)也是導(dǎo)致嚴(yán)重殘疾的主要因素［1］。與細(xì)胞主要通過壞死死亡的缺血核心不同，細(xì)胞凋亡在半影區(qū)普遍存在［2-3］卒中缺血核心區(qū)神經(jīng)細(xì)胞迅速壞死，而半影區(qū)受損細(xì)胞普遍發(fā)生凋亡［2-3］，半暗帶中較弱的損傷主要引起細(xì)胞凋亡［4-5］。神經(jīng)細(xì)胞特別是神經(jīng)元對(duì)缺血缺氧刺激敏感且再生能力有限，挽救這類處于可逆狀態(tài)的神經(jīng)細(xì)胞凋亡進(jìn)程是目前主要的干預(yù)方法，因此深入了解缺血性卒中腦損傷的潛在分子及調(diào)控機(jī)制迫在眉睫。

微小 RNA（microRNA，miRNA）是一類不具有編碼能力的單鏈RNA［6］，一般長(zhǎng)度為21～25 nt，它在多種生物體內(nèi)廣泛分布。miRNA 在不同生物中高度保守，且在組織中具有高度的特異性［7］。研究表明，miRNA主要是在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因表達(dá)［8-10］，即負(fù)向調(diào)控mRNA的翻譯，在疾病發(fā)生發(fā)展的進(jìn)程中調(diào)節(jié)靶基因的蛋白表達(dá)水平。近年來(lái)，miRNA在神經(jīng)系統(tǒng)的作用開始被學(xué)者所認(rèn)識(shí)，且被證實(shí)miRNA在急性缺血性腦卒中等神經(jīng)系統(tǒng)疾病中發(fā)揮著重要的調(diào)控作用。例如，miR-26a可以激活A(yù)KT和ERK信號(hào)通路上調(diào)HIF-1α的表達(dá)，并通過調(diào)控VEGF轉(zhuǎn)錄活性，促進(jìn)MCAO模型中血管的生成［11］；miR-190在I/R大鼠中表達(dá)顯著降低，而過表達(dá)miR-190后下調(diào)Rho/Rho激酶mRNA和蛋白表達(dá)，同時(shí)降低了細(xì)胞的凋亡率［12］。Bcl-2基因（B細(xì)胞淋巴瘤/白血病-2基因B-cell lymphoma 2， Bcl-2）是一種癌基因，亦是最重要的抗細(xì)胞凋亡基因，常作為內(nèi)源性神經(jīng)保護(hù)物質(zhì)，當(dāng)Bcl-2表達(dá)量升高時(shí)，能發(fā)揮抑制缺血所致的神經(jīng)元凋亡的功能［13］，因此它在腦缺血再灌注損傷中發(fā)揮了重要保護(hù)作用。

目前已有文獻(xiàn)報(bào)道m(xù)iR-181a通過靶向Bcl-2在疾病中發(fā)揮重要作用，例如miR-181a通過靶向Bcl-2在低侵襲性乳腺癌細(xì)胞中對(duì)阿霉素化療敏感性的功能作用［14］；miR-181a通過靶向Bcl-2使人惡性膠質(zhì)瘤U87MG細(xì)胞對(duì)輻射敏感［15］；miR-181a通過靶向Bcl-2使多重耐藥白血病細(xì)胞系K562/A02對(duì)柔紅霉素敏感［16］。此外，miR-181a在細(xì)胞凋亡中發(fā)揮的調(diào)控作用也有文獻(xiàn)報(bào)道，例如miR-181a通過誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡使耐藥白血病HL-60/Ara-C細(xì)胞對(duì)Ara-C敏感［17］；miR-181a有助于蟾蜍靈誘導(dǎo)PC-3前列腺癌細(xì)胞凋亡［18］。但是在OGD/R誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞損傷模型中是否存在miR-181a與Bcl-2的靶向關(guān)系，以及miR-181a—Bcl-2軸在OGD/R誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞凋亡中發(fā)揮的功能仍需進(jìn)一步探究。

本研究旨在體外實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證miR-181a與Bcl-2的調(diào)控關(guān)系，并探討miR-181a—Bcl-2軸對(duì)OGD/R模型誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞凋亡的影響，為miR-181a調(diào)控腦缺血再灌注神經(jīng)細(xì)胞凋亡的機(jī)制提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要材料

本研究使用的SH-SY5Y細(xì)胞株（人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞）購(gòu)自武漢大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心（細(xì)胞庫(kù)）。293T細(xì)胞（人腎上皮細(xì)胞）由石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院生化教研室提供。miR-181a模擬物及其陰性對(duì)照（miR-181amimic/mimic-NC）、miR-181a抑制物及其陰性對(duì)照（miR-181ainhibitor/inhibitor-NC）、Bcl-2 3′UTR野生型和突變型質(zhì)粒購(gòu)自上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司。LipofectamineTM 3000試劑購(gòu)自ThermoFisher公司。

1.2 方法

1.2.1 MCAO模型構(gòu)建

大鼠用戊巴比妥鈉（40mg·kg-1）麻醉并固定在仰臥位。常規(guī)皮膚消毒和準(zhǔn)備后，在頸部中線左側(cè)做一個(gè)小切口（～25mm），鈍性分離頸動(dòng)脈肌肉，暴露頸內(nèi)動(dòng)脈、頸外動(dòng)脈以及頸動(dòng)脈分叉處。在頸外動(dòng)脈切開一個(gè)小切口，將硅膠涂層的MCAO栓塞（中國(guó)廣東廣州嘉靈生物科技有限公司）小心地經(jīng)頸內(nèi)動(dòng)脈插入大腦中動(dòng)脈，直至出現(xiàn)輕微阻力。栓塞2小時(shí)后，移除栓子以進(jìn)行再灌注。假手術(shù)組手術(shù)操作與MCAO組相同，只是不進(jìn)行栓塞處理。

1.2.2 神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分

MCAO模型大鼠撤栓血液再灌注24 h之后開始評(píng)分，聯(lián)合采用longa評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行評(píng)分，以最大程度保證模型的有效性（表1）。所有評(píng)分操作均由對(duì)實(shí)驗(yàn)不知情的研究人員進(jìn)行，以避免主觀因素對(duì)結(jié)果的影響。

1.2.3 TTC染色及梗死密度掃描

在冰上將大鼠鼠腦取出后，立即將鼠腦放于干凈培養(yǎng)皿中于-20℃冰箱下冷凍20 min固形，將組織連續(xù)切成2 mm厚的冠狀切片，在2%的TTC染色溶液中37℃培養(yǎng)箱內(nèi)避光孵育，每隔5 min將切片翻面，注意需染色均勻。15～20 min后取出腦片，使用4%多聚甲醛固定液固定，觀察并拍照，應(yīng)用Image J圖像分析軟件掃描梗死密度，并計(jì)算梗死密度百分比。

1.2.4 miR-181a 與 Bcl-2 基因 3′-UTR 區(qū)結(jié)合位點(diǎn)預(yù)測(cè)及保守性分析

使用 miRanda 和 targetscan 進(jìn)行 miR-181a 的靶基因預(yù)測(cè)，發(fā)現(xiàn) Bcl-2 為其靶基因，通過 RNA hybird 軟件預(yù)測(cè) miR-181a 成熟體序列與 Bcl-2 基因的 3′ -UTR 區(qū)存在保守的結(jié)合位點(diǎn)。在 miRBase 數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//www.mirbase. org/）下載人、大鼠、小鼠、大猩猩、獼猴、豚尾獼猴、原雞、斑馬魚、綿羊和鴨嘴獸等10個(gè)物種的 miR-181a 成熟序列進(jìn)行保守性分析。

1.2.5 雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)

使用 293T 細(xì)胞用于雙熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)檢測(cè)，按照 Lipofectamine 3000 試劑說明書，將 miR-181amimic、mimic NC 分別與 Bcl-2 3′UTR-WT、Bcl-2 3′UTR-Mut 兩兩進(jìn)行共轉(zhuǎn)染，每個(gè)處理設(shè)置3孔重復(fù)。將轉(zhuǎn)染的細(xì)胞置于37 ℃共培養(yǎng)24 h后，使用? Dual-Luciferase 報(bào)告基因檢測(cè)系統(tǒng)試劑盒檢測(cè)細(xì)胞熒光素酶活性。以螢火蟲熒光素酶與海腎熒光素酶的比值作為相對(duì)熒光活性。

1.2.6 細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染

將 SH-SY5Y 細(xì)胞復(fù)蘇24 h后觀察細(xì)胞狀態(tài)，并根據(jù)細(xì)胞生長(zhǎng)情況更換培養(yǎng)基。用PBS 清洗2遍 SH-SY5Y 細(xì)胞，加入 2 mL 胰蛋白酶消化。在顯微鏡下觀察到細(xì)胞呈現(xiàn)流沙狀時(shí)，立即加入 4 mL 完全培養(yǎng)基終止消化。在 800 r·min-1條件下離心5 min，棄上清液后加入 1 mL 完全培養(yǎng)基重懸 SH-SY5Y細(xì)胞，并將其接種至 10 cm 細(xì)胞培養(yǎng)皿，在37 ℃，5% CO2環(huán)境下培養(yǎng)；293T 細(xì)胞的操作步驟與之相同。在6孔板中根據(jù)試劑盒說明書進(jìn)行，使用 Lipofectamine 3000 轉(zhuǎn)染miR-181a的mimic和inhibitor，并在轉(zhuǎn)染后24 h收取細(xì)胞待檢。

1.2.7 OGD/R 模型的構(gòu)建

將 SH-SY5Y 細(xì)胞培養(yǎng)至狀態(tài)良好后按照接種量進(jìn)行細(xì)胞鋪板，等到第二天細(xì)胞生長(zhǎng)至所需狀態(tài)及數(shù)量后（16～24 h），用1×無(wú)菌PBS清洗3次，之后將皿內(nèi)10%完全培養(yǎng)基置換成無(wú)糖DMEM培養(yǎng)基。將神經(jīng)細(xì)胞置于預(yù)先充95% N2、0% O2、5% CO2混合氣的三氣培養(yǎng)箱中，進(jìn)行缺糖缺氧處理。OGD處理結(jié)束后，棄去無(wú)糖DMEM培養(yǎng)基，加入10%完全培養(yǎng)基，然后將細(xì)胞置于5% CO2的常氧培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)，在復(fù)糖復(fù)氧24 h后，收集細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)研究。

1.2.8 qRT-PCR 檢測(cè)

莖環(huán)引物及 PCR 引物信息見表2。qRT-PCR 使用 TB Green Premix Ex TaqTM 試劑盒（RR800A， Takara， Japan），采用15 μL體系，PCR 體系及反應(yīng)條件見表3、表4。

1.2.9 Western Blot檢測(cè)

將腦組織在液氮中搗碎，在冰上用 RIPA 緩沖液裂解30 min并進(jìn)行超聲處理（30%能量，2 s持續(xù)時(shí)間，2 s間隔，總時(shí)間30 s）。在4℃下以12 000 r·min-1離心10 min。將上清液轉(zhuǎn)移到新管中。添加 PMSF（10∶1 000），并使用 BCA 試劑盒（Biomiga）測(cè)定蛋白質(zhì)濃度。對(duì)于 SH-SY5Y 細(xì)胞，用 PBS 洗滌細(xì)胞，在冰上用 RIPA 緩沖液裂解30 min并進(jìn)行超聲處理（30%能量，2 s持續(xù)時(shí)間，2 s間隔，總時(shí)間30 s）。添加 PMSF（10∶1 000），并使用BCA試劑盒（Biomiga）測(cè)定蛋白質(zhì)濃度。蛋白質(zhì) （30 μg） 通過10% SDS-PAGE 分離并轉(zhuǎn)移到NC膜上。將膜封閉2 h（室溫下5% BSA）。將膜與抗Bcl-2（abcam，ab196495，1∶1 000）、Bax（abcam，ab53154，1∶2 000）、β-actin（中杉金橋，TA-09，1∶2 000）在 4 ℃ 過夜。將膜用TBS-Tween-20（TBS-T）洗滌3次，并與二抗在室溫下孵育2 h。將膜用TBS-T洗滌3次，并在 West Femto ECL Substrate（Beijing Solarbio Science & Technology Co.， Ltd.）下暴露于 Bio-Rad ChemiDoc XRS（Bio-Rad Laboratories， Inc.），并用 ImageJ（v. 1.6.0）進(jìn)行分析。

1.2.10 Hoechst 熒光染色

OGD/R 模型結(jié)束后，每孔加入適當(dāng)量 Hoechst 33258 染色液充分覆蓋住待染色的樣品（六孔板每孔加入1 mL，96孔板每孔需加入100 μL）。培養(yǎng)箱中放置20～30 min。棄去染色液，用1×PBS 或培養(yǎng)基洗滌2～3次。結(jié)果直接在熒光顯微鏡下觀察，拍照記錄結(jié)果。

1.2.11 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

所有實(shí)驗(yàn)均進(jìn)行3次重復(fù)，用平均值± SD表示，組別比較采用方差分析和獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，使用 SPSS 19.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)其進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。P<0.05為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。qRT-PCR 采用2 -ΔΔCt方法計(jì)算其相對(duì)表達(dá)水平。

2 結(jié)果

2.1 大鼠 MCAO 2 h/R 24 h 模型的構(gòu)建與評(píng)估

由于大腦皮層對(duì)腦缺血十分敏感，因此在本研究中，我們選擇了皮層區(qū)域進(jìn)行數(shù)據(jù)挖掘，在 SD 大鼠上構(gòu)建了 MCAO 模型，腔內(nèi)線栓阻斷法對(duì)大鼠大腦中動(dòng)脈進(jìn)行梗死2 h、再灌注24 h處理。模型結(jié)束后收集 Sham 組與 MCAO 組的大鼠大腦皮層進(jìn)行高通量測(cè)序，測(cè)序結(jié)果顯示缺血缺氧損傷后，miR-181a 表達(dá)下調(diào)，Bcl-2 表達(dá)上調(diào)。我們前期發(fā)表的成果［19］上傳了該數(shù)據(jù)集，可在國(guó)家生物技術(shù)信息中心（NCBI）的短讀檔案 （SRA） 中找到，生物項(xiàng)目編號(hào)為 PRJNA690203（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/bioproject/PRJNA690203/）。

為了驗(yàn)證 miR-181a 與 Bcl-2 的表達(dá)趨勢(shì)是否與測(cè)序結(jié)果一致，本研究在 SD 大鼠上構(gòu)建了 MCAO 2 h/R 24 h 動(dòng)物模型。在神經(jīng)行為學(xué)上，longa 評(píng)分結(jié)果顯示，MCAO 組大鼠相較于 Sham 組具有明顯的神經(jīng)行為缺損（P<0.05）（圖1B）。在病理上，MCAO 組全腦切片 TTC 染色顯示梗死區(qū)顏色蒼白且出現(xiàn)較為嚴(yán)重的水腫，對(duì)照組大腦組織顏色紅潤(rùn)，無(wú)明顯梗死病灶（圖1A）；對(duì)梗死密度進(jìn)行量化，結(jié)果顯示MCAO組大鼠的梗死密度顯著高于Sham組大鼠（P<0.001）（圖1C）。神經(jīng)行為學(xué)與病理切片的結(jié)果均表明模型構(gòu)建成功，可以進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)研究。

2.2 MCAO 模型中 miR-181a、Bcl-2 的表達(dá)變化

收集 SD 大鼠大腦皮層組織的總 RNA 和總蛋白，檢測(cè) miR-181a、Bcl-2 表達(dá)趨勢(shì)是否與測(cè)序結(jié)果相一致。結(jié)果顯示，與 Sham 組相比，miR-181a 的表達(dá)在 MCAO 模型損傷后上調(diào)（P<0.001）（圖2A），Bcl-2 mRNA 及蛋白的表達(dá)在 MCAO 模型損傷后均下調(diào)（P<0.001），并且 Bcl-2/β-actin蛋白比值顯著降低（P<0.001）（圖2B～2D）。以上結(jié)果顯示，miR-181a 與 Bcl-2 的表達(dá)變化趨勢(shì)相反；此外，上述結(jié)果還表明在腦缺血再灌注損傷后，伴隨 miR-181a 的高表達(dá)與Bcl-2的低表達(dá)。

2.3 miR-181a 與 Bcl-2 基因 3′-UTR 區(qū)結(jié)合位點(diǎn)預(yù)測(cè)及驗(yàn)證

通過 RNA hybird 軟件預(yù)測(cè) miR-181a 成熟體序列與 Bcl-2 基因的 3′-UTR 區(qū)存在保守的結(jié)合位點(diǎn)（圖3）。miR-181a 成熟序列以及種子區(qū)序列“ACAUUC”在人、大鼠、小鼠、大猩猩、獼猴、豚尾獼猴、原雞、斑馬魚、綿羊和鴨嘴獸等物種之間高度保守（表5）；Bcl-2與 miR-181a 的結(jié)合位點(diǎn)“GAAUGUA”在大鼠、小鼠、人、貓、豬、兔等物種之間高度保守，這提示二者可能在多個(gè)物種之間發(fā)揮類似的生物學(xué)功能。根據(jù)其保守結(jié)合區(qū)域，我們構(gòu)建了含有 miR-181a 和 Bcl-2 3′-UTR 區(qū)結(jié)合位點(diǎn)附近區(qū)域序列的野生型和突變型質(zhì)粒，進(jìn)行雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)二者的結(jié)合位點(diǎn)。通過熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)發(fā)現(xiàn)，293T 細(xì)胞中共轉(zhuǎn)染帶有 Bcl-2 3′-UTR 區(qū)序列的質(zhì)粒和miR-181a mimic可以導(dǎo)致熒光素酶活性的下調(diào)，而共轉(zhuǎn)染 Bcl-2 突變型質(zhì)粒和miR-181a mimic后熒光素酶活性無(wú)變化。以上結(jié)果表明miR-181a 可與 Bcl-2 3′-UTR 結(jié)合，即 miR-181a 可以靶向結(jié)合 Bcl-2。

2.4 miR-181a 可以負(fù)向調(diào)控 Bcl-2 mRNA 及蛋白表達(dá)

在 SH-SY5Y 細(xì)胞 OGD/R 探究 miR-181a 與 Bcl-2 是否具有相反的調(diào)控模式，合成了 miR-181a mimic、miR-181a inhibitor 片段及其對(duì)應(yīng)的陰性對(duì)照 mimic-NC 和 inhibitor-NC。在培養(yǎng)的 SH-SY5Y 細(xì)胞轉(zhuǎn)染上述片段，通過 qRT-PCR 檢測(cè)其轉(zhuǎn)染效率，以確保本研究所采用的寡核苷酸能夠達(dá)到實(shí)驗(yàn)要求。如圖4所示，結(jié)果顯示 mimic 組的 miR-181a 表達(dá)升高約為5 000倍，且 Bcl-2 mRNA 和蛋白表達(dá)顯著降低；inhibitor 組結(jié)果顯示 miR-181a 表達(dá)降低約為70%，且 Bcl-2 mRNA 和蛋白表達(dá)顯著升高。以上結(jié)果表明 miR-181a 可負(fù)向調(diào)控 Bcl-2 轉(zhuǎn)錄后水平的表達(dá)。

2.5 SH-SY5Y細(xì)胞構(gòu)建OGD/R損傷模型

為了探究 miR-181a—Bcl-2 軸在腦缺血缺氧損傷中的生物學(xué)功能，我們首先在 SH-SY5Y 細(xì)胞上構(gòu)建了氧糖剝奪/復(fù)氧復(fù)糖（OGD/R）細(xì)胞模型，用以模擬腦缺血再灌注損傷的神經(jīng)細(xì)胞，之后檢測(cè)缺糖缺氧2、4、6 h后復(fù)糖復(fù)氧24 h的 SH-SY5Y 細(xì)胞的活力與氧化應(yīng)激水平。CCK-8 細(xì)胞活力及臺(tái)盼藍(lán)拒染的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，隨著 OGD 處理時(shí)間的持續(xù)延長(zhǎng)，細(xì)胞存活率逐漸降低，至 OGD 6 h/R 24 h 細(xì)胞存活率降至60%（P<0.01）（圖5A、5B）。之后檢測(cè) SOD 酶活性及 MDA 含量，結(jié)果顯示 SH-SY5Y 細(xì)胞氧化應(yīng)激水平隨著缺糖缺氧時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸增加，SOD活力顯著下降（P<0.01），MDA 含量明顯升高（P<0.001）（圖5C、5D）。以上結(jié)果提示在 SH-SY5Y 細(xì)胞成功構(gòu)建 OGD/R 模型，且隨缺糖缺氧時(shí)間延長(zhǎng)，細(xì)胞損傷進(jìn)一步加重。

2.6 在 SH-SY5Y 細(xì)胞 OGD/R 模型損傷時(shí)段構(gòu)建 miR-181a、Bcl-2 的時(shí)序表達(dá)譜

為了探究 SH-SY5Y 細(xì)胞在 OGD/R 損傷后 miR-181a、Bcl-2 的表達(dá)變化，我們檢測(cè)了 SH-SY5Y 細(xì)胞缺糖缺氧不同時(shí)段、復(fù)糖復(fù)氧 24 h 后的上述兩種 RNA 及靶標(biāo)蛋白的表達(dá)變化。如圖6所示，從 OGD 2 h/R 24 h 開始，miR-181a 的表達(dá)顯著升高（P<0.05），Bcl-2 mRNA 水平及蛋白水平的表達(dá)均顯著降低（P<0.01），二者的表達(dá)趨勢(shì)相反，且在OGD 6 h/R 24 h損傷時(shí)段，miR-181a 和 Bcl-2表達(dá)的反向趨勢(shì)最為顯著，因此選擇 OGD 6 h/R 24 損傷時(shí)段進(jìn)行后續(xù)研究。

2.7 下調(diào) miR-181a 可介導(dǎo) Bcl-2 上調(diào)挽救缺血缺氧損傷誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞凋亡

為了進(jìn)一步研究下調(diào) miR-181a 是否可通過上調(diào) Bcl-2 基因抑制 SH-SY5Y 神經(jīng)細(xì)胞凋亡，在對(duì) SH-SY5Y 細(xì)胞進(jìn)行 OGD 6 h/R 24 h 處理，之后轉(zhuǎn)染 miR-181a mimic 及 inhibitor，圖7結(jié)果顯示 OGD 6 h/R 24 h 損傷后 miR-181a 表達(dá)顯著升高（P<0.001），Bcl-2 mRNA 及蛋白表達(dá)均顯著降低（P<0.001）；與 OGD/R 組相比，OGD/R + miR-181a mimic 組 Bcl-2? mRNA 和蛋白表達(dá)顯著降低（P<0.001）、OGD/R + miR-181a inhibitor 組 Bcl-2 的 mRNA 和蛋白表達(dá)顯著升高（P<0.001）。Bcl-2 和 Bax 的比值改變可以反映凋亡的水平，當(dāng) Bcl-2/Bax 比值降低表明凋亡水平增加，Bcl-2/Bax 比值升高表明凋亡水平降低。檢測(cè)各個(gè)組別二者比值改變，圖7結(jié)果顯示與 control 組相比，OGD 6 h/R 24 h 組 Bcl-2/Bax 蛋白比值顯著降低（P<0.001）。與 OGD/R 組相比，OGD/R + miR-181a mimic 組 Bcl-2/Bax 蛋白比值顯著降低（P < 0.001）；OGD/R + miR-181a inhibitor 組Bcl-2/Bax 蛋白比值顯著增加（P < 0.001）。以上結(jié)果進(jìn)一步提示 miR-181a 與 Bcl-2 具有相反的調(diào)控模式；此外Bcl-2/Bax 蛋白比值變化初步提示 miR-181a inhibitor 可以逆轉(zhuǎn) OGD/R損傷誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。

為了進(jìn)一步研究 miR-181a—Bcl-2 軸介導(dǎo) SH-SY5Y 神經(jīng)細(xì)胞凋亡的影響，通過Hoechst 熒光染色檢測(cè) SH-SY5Y 細(xì)胞凋亡情況。圖8結(jié)果顯示，與 control 組相比，OGD 6 h/R 24 神經(jīng)細(xì)胞凋亡水平均顯著增加（P<0.001）。與 OGD/R 組相比，OGD/R + miR-181a mimic 組細(xì)胞凋亡水平顯著增加（P<0.001）；OGD/R + miR-181a inhibitor 組細(xì)胞凋亡水平顯著降低（P<0.001）。熒光染色結(jié)果進(jìn)一步提示下調(diào)miR-181a 可以介導(dǎo)Bcl-2的上調(diào)從而逆轉(zhuǎn)OGD/R損傷誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞凋亡。

3 討論

中風(fēng)是全球第二大死因，每年約有670萬(wàn)人死于中風(fēng)［20］，其中缺血性中風(fēng)占病例的 80% 以上，主要是由于頸內(nèi)動(dòng)脈或大腦中動(dòng)脈突然阻塞所致［21］，而 MCAO 實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ褪亲畛Ｓ玫亩虝盒跃衷钚阅X缺血再灌注損傷動(dòng)物模型，可用于臨床前研究缺血性腦卒中的病理生理學(xué)及其潛在機(jī)制研究［22］。OGD/R 模型是體外模擬腦缺血再灌注損傷的公認(rèn)模型，在剝奪相應(yīng)時(shí)段神經(jīng)細(xì)胞中的葡萄糖和氧氣后再給予恢復(fù)，以此模擬腦缺血再灌損傷中的神經(jīng)細(xì)胞［23-24］。SH-SY5Y 細(xì)胞是一種可以分化為具有成熟神經(jīng)元形態(tài)和生物特征的神經(jīng)細(xì)胞［25］，常被用于神經(jīng)損傷性疾病機(jī)制的研究。

在缺血核心區(qū)域，許多細(xì)胞尤其是神經(jīng)元，會(huì)在僅僅5 min內(nèi)死亡，而毗鄰區(qū)域的神經(jīng)細(xì)胞處于可逆狀態(tài)，因此挽救這類神經(jīng)細(xì)胞是目前研究的主要方向［26］。細(xì)胞凋亡是缺血性中風(fēng)的關(guān)鍵機(jī)制，挽救細(xì)胞凋亡可減輕缺血和再灌注誘導(dǎo)的腦損傷。

目前已有許多文獻(xiàn)證實(shí) microRNA 在缺血性中風(fēng)誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞凋亡中發(fā)揮重要調(diào)控作用，例如 miR-124 通過靶向小鼠 DAPK1 減輕缺血性中風(fēng)誘導(dǎo)的神經(jīng)元死亡，包括小鼠的整體神經(jīng)功能［27］；microRNA-195 通過抑制 KLF5 介導(dǎo)的 JNK 信號(hào)通路激活來(lái)減輕缺血性中風(fēng)大鼠的神經(jīng)細(xì)胞凋亡［28］；上調(diào) microRNA-9 通過靶向缺血性中風(fēng)中的 Bcl2l11 抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡［29］?；诖?，本研究向 OGD/R 處理的 SH-SY5Y 細(xì)胞中分別轉(zhuǎn)染了 miR-181a 模擬物和抑制物以及其陰性對(duì)照，發(fā)現(xiàn)過表達(dá) miR-181a 能促進(jìn)缺血缺氧誘導(dǎo)的 SH-SY5Y 細(xì)胞凋亡，抑制 miR-181a 的表達(dá)，SH-SY5Y 細(xì)胞凋亡率明顯降低，再次證實(shí)了下調(diào) miR-181a 可上調(diào) Bcl-2 從而對(duì)腦缺血再灌注損傷誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞凋亡發(fā)揮保護(hù)作用。

在先前報(bào)道中，雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)證實(shí)了 miR-181 可靶向多個(gè) Bcl-2 家族成員（Bcl-2、Mcl-1），其中 miR-181 對(duì) Bcl-2 和 Mcl-1 的調(diào)節(jié)有助于在體外缺血應(yīng)激（葡萄糖剝奪）星形膠質(zhì)細(xì)胞中觀察到線粒體功能障礙［30］。Bcl-2調(diào)控細(xì)胞凋亡機(jī)制如下［31］：Bcl-2 可競(jìng)爭(zhēng)性地結(jié)合 Bax 蛋白，減少 Bax/Bak 寡聚化在線粒體外膜上形成孔，阻止細(xì)胞色素c等促凋亡物質(zhì)釋放入胞質(zhì)。細(xì)胞色素 c 與細(xì)胞質(zhì)中的凋亡蛋白酶活化因子-1（Apaf-1）結(jié)合形成凋亡小體，激活 caspase-3 介導(dǎo)凋亡。Mcl-1 在細(xì)胞凋亡機(jī)制如下［32］：Mcl-1也可以通過在線粒體外膜螯合促凋亡蛋白 Bak 阻止其寡聚化和細(xì)胞色素 c 釋放來(lái)發(fā)揮抗凋亡作用。

我們的研究為 OGD/R 誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞凋亡機(jī)制提供了新的思路，但本研究仍然存在不足之處：雖然下調(diào)的 miR-181a 負(fù)向調(diào)控靶標(biāo) Bcl-2 發(fā)揮抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡的作用，但這種作用是否與 miR-181a 通過對(duì)其它 Bcl-2 家族成員的表達(dá)調(diào)控，進(jìn)而協(xié)同發(fā)揮抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡的作用還不明確；此外我們僅在細(xì)胞水平上進(jìn)行了驗(yàn)證，miR-181a—Bcl-2 軸在體內(nèi)是否發(fā)揮同樣的功能仍需進(jìn)一步探究；且 miR-181a 在缺血性腦卒中上調(diào)的原因以及 miR-181a 上游的調(diào)控因子也待進(jìn)一步研究。

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（責(zé)任編輯：編輯唐慧）