侯卜文 舒敏 劉程豪 杜云峰 黎廣 姜慧嬌 吳向未

摘要：目的 探討UPF3B對上消化道惡性腫瘤細(xì)胞增殖的影響。方法 通過qRT-PCR和Western Blot技術(shù)驗(yàn)證胃癌和食管癌細(xì)胞中UPF3B的敲低和過表達(dá)效率；CCK-8、EdU、平板克隆形成實(shí)驗(yàn)評估細(xì)胞的增殖能力。結(jié)果 在胃癌和食管癌細(xì)胞中通過siRNA敲低UPF3B的表達(dá)水平，UPF3B的mRNA和蛋白表達(dá)水平顯著降低，且有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.001），CCK8、EdU、平板克隆形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明敲低UPF3B抑制胃癌和食管癌細(xì)胞的增殖；在胃癌和食管癌細(xì)胞中轉(zhuǎn)染UPF3B過表達(dá)質(zhì)粒上調(diào)UPF3B的表達(dá)水平，UPF3B的mRNA和蛋白表達(dá)水平顯著升高，且有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.001），CCK8、EdU、平板克隆形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明過表達(dá)UPF3B促進(jìn)胃癌和食管癌細(xì)胞的增殖。結(jié)論 UPF3B促進(jìn)上消化道惡性腫瘤細(xì)胞增殖。

關(guān)鍵詞：上消化道惡性腫瘤；食管癌；胃癌；UPF3B；增殖

中圖分類號：中圖分類號R735.7文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A文獻(xiàn)標(biāo)識碼

UPF3B promotes proliferation of malignant tumor cells in upper gastrointestinal tract

HOU? Bowen1，SHU? Min1，LIU? Chenghao1，DU? Yunfeng1，LI? Guang1，JIANG? Huijiao1，WU? Xiangwei1，2*

（1 School of Medicine， Shihezi University， Shihezi，Xinjiang 832000， China; 2 The First Affiliated Hospital/

Central Asia Key Laboratory for High Incidence Prevention and Control， Shihezi University， Shihezi，Xinjiang 832000， China）

Abstract： Objective To investigate the effect of UPF3B on the proliferation of malignant cells inUpper gastrointestinal malignant tract. Methods Interference and overexpression efficiency of UPF3B in gastric and esophageal cancer cells verified by qRT-PCR and Western blot; the proliferation ability of cells was detected by CCK-8， EdU， and plate colony formation assay. Results siRNA knockdown of UPF3B expression levels in gastric and esophageal cancer cells significantly decreased the mRNA and protein expression levels of UPF3B， and was statistically significant （P<0.001）， and CCK8， EdU and plate colony formation assay showed that knockdown of UPF3B inhibited the proliferation of gastric and esophageal cancer cells; transfection of UPF3B overexpression plasmid in gastric and esophageal cancer cells up-regulated the expression levels of UPF3B， and the mRNA and protein expression levels of UPF3B were significantly increased， and was statistically significant （P<0.001）， and the results of CCK8， EdU and plate colony formation assay showed that overexpression of UPF3B promoted the proliferation of gastric and esophageal cancer cells. Conclusion UPF3B promotes the proliferation of malignant tumor cells in upper gastrointestinal tract.

Key words： Upper gastrointestinal malignant tract;Esophageal cancer;Gastric cancer;UPF3B;proliferation

0 前言

消化道惡性腫瘤是指發(fā)生于胃腸道及相關(guān)器官的一組異質(zhì)性癌癥，其中上消化道惡性腫瘤主要包括食管癌和胃癌，是十大最常見癌癥和癌癥相關(guān)死亡原因之一。據(jù)統(tǒng)計(jì)，2020年上消化道惡性腫瘤（胃癌和食管癌）新增大約140萬病例，有約130萬死亡病例。中國上消化道惡性腫瘤發(fā)生率僅次于肺癌， 為惡性腫瘤發(fā)病和死亡的主要病因［1］。

RNA結(jié)合蛋白（RNA binding protein，RBPs）是一類與轉(zhuǎn)錄本和非編碼 RNA相互作用的多樣化蛋白，通過其自身單個或多個RNA結(jié)合域與RNA結(jié)合，改變結(jié)合RNA的功能，調(diào)節(jié)生物體的許多細(xì)胞過程，創(chuàng)建復(fù)雜的動態(tài)多水平網(wǎng)絡(luò)控制核苷酸代謝和基因表達(dá)［2-3］。RNA結(jié)合蛋白在RNA調(diào)控方面發(fā)揮重要作用，包括轉(zhuǎn)錄、翻譯、剪接、多聚腺苷酸化、穩(wěn)定性和定位［4-10］。RNA結(jié)合蛋白還可以通過與其它蛋白的直接相互作用或作為帶有編碼或非編碼RNA的支架，形成核糖核蛋白復(fù)合體。目前人類中有大約1 500種經(jīng)過實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證的RNA結(jié)合蛋白，約占編碼基因的7%［11］，其功能失調(diào)與多種人類疾病有關(guān)，包括肌肉萎縮、神經(jīng)系統(tǒng)疾病和癌癥［4，12］，也因此成為多種癌癥潛在的生物標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)。

先前的研究發(fā)現(xiàn)，Up-Frameshift Suppressor 3 Homolog B（UPF3B）是NMD通路中的核心接頭蛋白，可直接與釋放因子相互作用，并作為 NMD放大器，使翻譯終止。UPF3B還可以直接與核糖體相互作用，并參與NMD途徑中mRNA的出核運(yùn)輸和質(zhì)量監(jiān)督過程［13］。無義介導(dǎo)的mRNA降解途徑（Nonsense mediated decay，NMD）是一種保守的RNA降解途徑，能夠識別并降解攜帶有提前終止密碼子的異常mRNA，從而確保基因的準(zhǔn)確表達(dá)。NMD通過下調(diào)抑癌基因的表達(dá)在腫瘤進(jìn)展過程中發(fā)揮作用［14］。還有研究使用TCGA泛癌數(shù)據(jù)分析了33種癌癥相對于對應(yīng)正常組織中UPF3B的表達(dá)，結(jié)果表明UPF3B在多種癌癥中呈高表達(dá)，且可作為基因預(yù)后模型因子，預(yù)測各種類型腫瘤的進(jìn)展，包括肝癌、食管癌、胃癌、腎嫌色細(xì)胞癌、皮膚黑色素瘤等。在多種癌癥類型中，UPF3B基因的功能主要與泛素介導(dǎo)的蛋白水解、細(xì)胞周期和mRNA監(jiān)視途徑有關(guān)，且其高表達(dá)與預(yù)后差顯著相關(guān)［15-17］。目前UPF3B在食管癌和胃癌中的作用尚未被研究。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞培養(yǎng)與主要試劑

人胃癌細(xì)胞株SGC-7901和人食管癌細(xì)胞株KYSE450購自中國科學(xué)院細(xì)胞庫。SGC-7901和KYSE450常規(guī)培養(yǎng)在1%青霉素-鏈霉素和含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基中，放置于5% CO2、37 ℃培養(yǎng)箱中孵育。主要試劑詳見表1。

1.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染siRNA和過表達(dá)質(zhì)粒

siRNA和過表達(dá)質(zhì)粒均由上海吉瑪基因設(shè)計(jì)并構(gòu)建合成，siRNA序列詳見表2。

將細(xì)胞SGC-7901和KYSE450分別鋪于12孔板中，確保每孔中含有1.2×105個細(xì)胞接種在1 mL無雙抗且含血清的完全培養(yǎng)基內(nèi)，轉(zhuǎn)染時細(xì)胞匯合度達(dá)到60%～70%。使用LipofectamineRNAiMAX轉(zhuǎn)染siRNA，轉(zhuǎn)染24 h后進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)；使用Lipofectamine 3000轉(zhuǎn)染過表達(dá)UPF3B及其相應(yīng)對照的質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染24 h后進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3 RNA提取和實(shí)時熒光定量PCR

使用E.N.Z.A. Total RNA Kit I從轉(zhuǎn)染24 h的細(xì)胞中分離出總RNA，使用NanoDrop 2000分光光度計(jì)精確測定提取的RNA濃度。通過逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，利用qRT-PCR進(jìn)行大量擴(kuò)增。本實(shí)驗(yàn)以 β-actin為內(nèi)參，每組設(shè)置3個復(fù)孔。應(yīng)用2-△△CT法分析實(shí)驗(yàn)組和對照組的表達(dá)差異倍數(shù)。引物序列見表3。

引物稀釋：（1）10000 g，4 ℃離心2 min，按說明書配比加入相對應(yīng)量的ddH2O用來溶解引物，渦旋振蕩混勻；按所需使用量分裝引物至無酶EP管中，放置于-20 ℃冰箱中保存；（2）使用時需將引物用無酶水稀釋10倍，即每10 μL的（1）溶液中加入90 μL的無酶水，若長期保存需置于-20 ℃冰箱中保存。

1.4 Western blot實(shí)驗(yàn)

分別提取轉(zhuǎn)染siRNA和過表達(dá)質(zhì)粒后48 h后的細(xì)胞蛋白。向1 mL預(yù)冷的Lysis Buffer加入5 μL磷酸酶抑制劑、1 μL蛋白酶抑制劑和10 μL PMSF。將配制好的預(yù)冷的Lysis Buffer加入到12孔板中，每孔100 μL。用SDS PAGE膠分離蛋白，80 V 3 h。轉(zhuǎn)膜條件設(shè)置為80 V 60 min。在常溫下配置5%的封閉液，封閉120 min。按照一抗：GAPDH稀釋比1∶1 000，UPF3B稀釋比1∶2 000。于4 ℃冰箱過夜，第二天清洗一抗，在常溫條件下孵育二抗（稀釋比為1∶5 000），2.5 h，最后使用1×TBST洗3次（每次10 min）后進(jìn)行曝光并檢測蛋白質(zhì)。

1.5 Cell Counting Kit-8（CCK）實(shí)驗(yàn)

CCK-8增殖實(shí)驗(yàn)檢測分別轉(zhuǎn)染siRNA和過表達(dá)質(zhì)粒后的細(xì)胞的增殖能力。將約2 000個細(xì)胞接種于96孔板中，待細(xì)胞貼壁后（約6 h），在不同時間點(diǎn)每孔加入10 μL CCK-8溶液，放于培37 ℃養(yǎng)箱中進(jìn)行2 h的孵育。測定450 nm處吸光度，每孔檢測3次并進(jìn)行記錄。使用GraphPad Prism進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)和分析。

1.6 EdU實(shí)驗(yàn)

將細(xì)胞SGC-7901和KYSE450分別鋪于12孔板，經(jīng)過24 h的轉(zhuǎn)染處理，向每孔內(nèi)加入1 mL EdU儲存液，標(biāo)記細(xì)胞2 h，并用含3% BSA的PBS洗滌3次；每孔中加入1 mL 3.7%甲醛固定細(xì)胞15 min，并用含3% BSA的PBS洗滌3次；每孔加入1 mL 0.5% TritonX-100通透液，室溫孵育20 min，含3% BSA的PBS洗滌3次；每孔加入500 μL EdU Click反應(yīng)液，室溫避光孵育30 min，含3% BSA的PBS洗滌3次；每孔中加入細(xì)胞核染色液，室溫避光孵育30 min，PBS 洗滌3次，最終每個孔保留1 mL的PBS，立刻進(jìn)行熒光顯微鏡下觀察拍照。使用GraphPad Prism將得到的結(jié)果進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)和分析。

1.7 平板克隆實(shí)驗(yàn)

將細(xì)胞SGC-7901和KYSE450分別鋪于12孔板，轉(zhuǎn)染處理24 h后，根據(jù)實(shí)驗(yàn)分組分別取2 000個細(xì)胞鋪于6孔板中，并輕輕晃動，使細(xì)胞均勻分布于孔板中。在37 ℃，5％CO2條件下的孵箱中培養(yǎng)2～3周，每組設(shè)置3個孔。期間根據(jù)培養(yǎng)液及細(xì)胞狀態(tài)情況，更換完全培養(yǎng)基。當(dāng)六孔板中出現(xiàn)肉眼可見的克隆時，應(yīng)立即終止培養(yǎng)。將上清液棄去，使用PBS輕柔清洗2次。每孔加入4%多聚甲醛600 μL，并將其放置于4 ℃冰箱中固定細(xì)胞20 min。棄固定液，加入1%結(jié)晶紫染色液600 μL，在室溫下染色30分鐘，用流水緩慢將染色液洗去。將六孔板倒扣在吸水紙上，待自然風(fēng)干后拍照記錄，使用ImageJ軟件對細(xì)胞數(shù)超過50個的集落進(jìn)行計(jì)數(shù)。使用GraphPad Prism進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)和分析。

1.8 醫(yī)學(xué)統(tǒng)計(jì)方法

本實(shí)驗(yàn)涉及的數(shù)據(jù)均為3次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)結(jié)果，使用Graphpad Prism 8.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析及統(tǒng)計(jì)，結(jié)果符合正態(tài)分布的以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±S）的格式表示，不滿足正態(tài)分布的結(jié)果用中位數(shù)和四分位間距表示。使用unpaired two-tailed Student′s t-test統(tǒng)計(jì)學(xué)方法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)組和對照組之間的統(tǒng)計(jì)分析。P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，用*表示；若P＜0.01，用**表示；若P＜0.001，用***表示。使用Graphpad Prism 8.0軟件作圖。

2 結(jié)果

2.1 胃癌和食管癌細(xì)胞中UPF3B的干擾和過表達(dá)情況

將針對UPF3B的siRNA，對SGC-7901和KYSE450細(xì)胞進(jìn)行體外干擾UPF3B表達(dá)，且通過qRT-PCR和WB技術(shù)檢測UPF3B的敲低效率。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示對于SGC-7901和KYSE450細(xì)胞，3種不同序列的siUPF3B均能顯著下調(diào)UPF3B的轉(zhuǎn)錄和蛋白水平（圖1A、1B）。同樣對SGC-7901和KYSE450細(xì)胞體外轉(zhuǎn)染含UPF3B的質(zhì)粒載體上調(diào)UPF3B表達(dá)量，將空的pEX-4載體作為空白對照。通過qRT-PCR和WB技術(shù)檢測UPF3B發(fā)現(xiàn)，與空白對照組相比，轉(zhuǎn)染含UPF3B的質(zhì)粒載體均能顯著上調(diào)UPF3B的轉(zhuǎn)錄和蛋白水平（圖1C、1D）。

A.qRT-PCR分析證實(shí)siRNA在SGC-7901和KYSE450細(xì)胞中下調(diào)UPF3B mRNA水平;B.WB分析證實(shí)siRNA在SGC-7901和KYSE450細(xì)胞中下調(diào)UPF3B蛋白水平;C.qRT-PCR分析證實(shí)過表達(dá)質(zhì)粒在SGC-7901和KYSE450細(xì)胞中上調(diào)UPF3B mRNA水平;D.WB分析證實(shí)過表達(dá)質(zhì)粒在SGC-7901和KYSE450細(xì)胞中上調(diào)UPF3B蛋白水平。差異的顯著性由unpaired two-tailed Student′s t-test確定。* P＜0.05；** P＜0.01；*** P＜0.001。

2.2 CCK8實(shí)驗(yàn)分析UPF3B干擾和過表達(dá)后細(xì)胞的增殖情況

轉(zhuǎn)染siRNA至SGC-7901和KYSE450細(xì)胞72 h后進(jìn)行CCK8實(shí)驗(yàn)檢測發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染siUPF3B組的OD值與對照組相比均明顯降低且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖2A、2B）。轉(zhuǎn)染質(zhì)粒載體于SGC-7901和KYSE450細(xì)胞72 h后進(jìn)行CCK8實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染過表達(dá)質(zhì)粒組的OD值與對照組相比明顯降低且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖2C、2D）。CCK8實(shí)驗(yàn)表明下調(diào)UPF3B后，細(xì)胞的增殖能力減弱；UPF3B過表達(dá)后其增殖能力顯著增強(qiáng)。CCK8實(shí)驗(yàn)證明在食管癌和胃癌細(xì)胞中，UPF3B可促進(jìn)其增殖。

A.敲低UPF3B抑制SGC-7901和KYSE450細(xì)胞增殖能力。B.過表達(dá)UPF3B促進(jìn)SGC-7901和KYSE450細(xì)胞增殖能力。差異的顯著性由unpaired two-tailed Student′s t-test確定。*P＜0.05；**P＜0.01；***P＜0.001。圖2 CCK8實(shí)驗(yàn)：UPF3B促進(jìn)胃癌和食管癌細(xì)胞的增殖

2.3 EdU實(shí)驗(yàn)分析UPF3B干擾和過表達(dá)后細(xì)胞的增殖情況

SGC-7901和KYSE450細(xì)胞下調(diào)UPF3B后，EdU-摻入細(xì)胞的比例明顯下降（圖3A）；過表達(dá)UPF3B后，EdU-摻入細(xì)胞的比例顯著上升（圖3B）。EdU實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明下調(diào)UPF3B后，細(xì)胞的增殖能力減弱；過表達(dá)UPF3B后，增強(qiáng)了這2種細(xì)胞的增殖能力。EdU實(shí)驗(yàn)再次驗(yàn)證，在食管癌和胃癌細(xì)胞中，UPF3B均可促進(jìn)其增殖。

2.4 平板克隆實(shí)驗(yàn)分析UPF3B干擾和過表達(dá)后細(xì)胞的增殖情況

轉(zhuǎn)染siRNA下調(diào)UPF3B后，SGC-7901和KYSE450細(xì)胞克隆形成團(tuán)數(shù)較對照組顯著減少（圖4A）。轉(zhuǎn)染含UPF3B的質(zhì)粒載體上調(diào)UPF3B表達(dá)量后，其克隆形成團(tuán)數(shù)較對照組顯著增多且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖4B）。克隆形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，下調(diào)UPF3B后，細(xì)胞的增殖能力會減弱；當(dāng)過表達(dá)UPF3B后，細(xì)胞的增殖能力會增強(qiáng)。

A.SGC-7901和KYSE450細(xì)胞下調(diào)UPF3B后，摻入EdU的代表性熒光照片（左）和量化圖（右）；B.SGC-7901和KYSE450細(xì)胞過表達(dá)UPF3B后，摻入EdU的代表性熒光照片（左）和量化圖（右）。

差異的顯著性由unpaired two-tailed Student′s t-test確定。*P＜0.05；**P＜0.01；***P＜0.001。圖3 EdU實(shí)驗(yàn)：UPF3B促進(jìn)胃癌和食管癌細(xì)胞的增殖

A.敲低UPF3B抑制SGC-7901和KYSE450細(xì)胞集落形成能力；B.過表達(dá)UPF3B促進(jìn)SGC-7901和KYSE450細(xì)胞集落形成能力。差異的顯著性由unpaired two-tailed Student′s t-test確定。*P＜0.05；**P＜0.01；***P＜0.001。圖4 平板克隆實(shí)驗(yàn)：UPF3B促進(jìn)胃癌和食管癌細(xì)胞的增殖

3 討論

近年來，隨著早期診斷和治療技術(shù)的飛躍提升，許多患者的生存情況得到改善，但上消化道惡性腫瘤仍保持極高的發(fā)病率和致死率。據(jù)2020年全球癌癥統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)報(bào)告顯示，目前上消化道惡性腫瘤仍然是全球高度難治性且高發(fā)性惡性腫瘤之一，每年約有140萬新增病例和130萬例死亡病例［1］。細(xì)胞穩(wěn)態(tài)失調(diào)導(dǎo)致細(xì)胞生長和增殖失控是腫瘤典型特征之一，但其中復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)尚未完全明了。

越來越多的報(bào)道稱UPF3B可作為候選RNA結(jié)合蛋白基因預(yù)測各種類型腫瘤的進(jìn)展，包括肝癌、食管癌、腎嫌色細(xì)胞癌、皮膚黑色素瘤［15］。有文獻(xiàn)報(bào)道UPF3B參與無義介導(dǎo)的mRNA降解途徑（NMD），且作為該途徑中的核心接頭蛋白，參與mRNA的出核運(yùn)輸和質(zhì)量監(jiān)督［13］。NMD通路是一種重要的RNA監(jiān)視機(jī)制，能識別和降解含有提前終止密碼子的異常mRNA，以確?；虻臏?zhǔn)確表達(dá)［14］。癌癥中突變的腫瘤抑制基因可以通過NMD降解，因此通常認(rèn)為此途徑參與腫瘤的發(fā)生［18-19］。既往研究表明UPF3B突變可引起多種精神疾病，如智力殘疾和精神分裂癥。UPF3B 是多蛋白復(fù)合物的一部分，參與mRNA核輸出和無感覺介導(dǎo)的NMD途徑的啟動。約11%的人類遺傳病是由于NMD途徑的改變。UPF3B已被確定為NMD誘導(dǎo)疾?。òò┌Y）的潛在治療方法［12］。有研究通過綜合分析癌癥基因組圖譜 （TCGA），開發(fā)出一種 DNA 修復(fù)相關(guān)基因標(biāo)志物，其中包括UPF3B，來預(yù)測食管癌患者的預(yù)后［13］。目前UPF3B在上消化道腫瘤中還未得到研究。

本研究選擇上消化道腫瘤中主要的癌癥類型即胃癌和食管癌，進(jìn)行體外驗(yàn)證UPF3B對胃癌和食管癌細(xì)胞系的生物學(xué)功能影響。通過CCK8、EdU和平板克隆形成實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證siRNA敲低UPF3B后兩種癌細(xì)胞的增殖能力受到顯著抑制，而質(zhì)粒過表達(dá)UPF3B后增殖能力明顯增強(qiáng)。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)UPF3B促進(jìn)上消化道惡性腫瘤細(xì)胞增殖，提示UPF3B可能參與了上消化道惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展，但其作為RNA結(jié)合蛋白影響上消化道惡性腫瘤的作用機(jī)制需要進(jìn)一步的分析和實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。腫瘤細(xì)胞的侵襲和遷移也是其惡性表型的重要特征，UPF3B對上消化道腫瘤細(xì)胞侵襲和遷移的影響還需要進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，為更全面的了解其促癌作用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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（責(zé)任編輯：編輯唐慧）