蔣應(yīng)磊 羅超 陳詩雯 邵欣 鄒一萍 陶飛 薛應(yīng)鈺

摘 要 為探究細胞周期蛋白依賴性激酶（Cyclin-dependent kinase 5，CDK5）在小麥條銹菌（Puccinia striiformis f. sp. tritici）新菌系CYR34夏孢子萌發(fā)過程的毒性作用，以天水地區(qū)小麥條銹菌新菌系CYR34夏孢子標樣為試材，通過RACE克隆CDK5基因并對其進行生物信息學分析，獲得長度為706 bp，編碼190個氨基酸的cDNA序列。蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)預(yù)測顯示，其二級結(jié)構(gòu)主要以α-螺旋為主，且具有典型的STKC激酶結(jié)構(gòu)域。同源性分析顯示，CDK5與小麥桿銹菌（Puccinia graminis f. sp. tritici）中的CDK5親緣關(guān)系較近。蛋白質(zhì)互作數(shù)據(jù)庫預(yù)測分析發(fā)現(xiàn)，CDK5可以與磷酸核酮糖3-差異構(gòu)酶、莢膜生物合成蛋白、鳥苷酸激酶、絲氨酸/蘇氨酸特異性蛋白激酶、16S rRNA 蛋白以及肌苷-5′-單磷酸脫氫酶6個蛋白互作關(guān)系；基因時序表達發(fā)現(xiàn)在孢子萌發(fā)0～6 h時，基因的表達量持續(xù)下調(diào)，6 h后表現(xiàn)為上調(diào)，萌發(fā)10 h后為對照的1.2倍，萌發(fā)14 h后基因的表達量達趨于平臺期，為對照的1.36倍。綜上所述，推測細胞周期蛋白依賴性激酶CDK5在小麥條銹菌（CYR34）夏孢子萌發(fā)過程中參與了適應(yīng)環(huán)境的信號調(diào)控。

關(guān)鍵詞 小麥條銹菌； CDK5；基因克?。簧镄畔W分析

小麥條銹病是由條形柄銹菌（Puccinia striiformis f. sp. tritici）引起，主要以氣流傳播的一種真菌性病害，是目前世界上溫帶地區(qū)最具破壞性的小麥病害之一[1]。在1950年，小麥條銹病的發(fā)生造成小麥生產(chǎn)損失達到6萬t，而1990年和2002年小麥條銹病的發(fā)生更甚，造成的損失分別達到了180萬t和130萬t[2-3]。2020年，小麥條銹病在全國的發(fā)病面積為439.52萬hm2，同比上年增加1.9倍，實際造成小麥減產(chǎn)2.49億kg[4]。在中國，小麥條銹病幾乎在所有小麥主產(chǎn)區(qū)都有過發(fā)生，一直都是中國西北、北部和西南部以及長江中下游地區(qū)小麥生產(chǎn)的潛在威脅[5-6]。2015年Beddow等[7]使用條銹病發(fā)生數(shù)據(jù)來建立概率蒙特卡羅模擬模型，來分析近幾十年來該疾病地理傳播的變化，結(jié)果顯示自1960年以來，條銹病的發(fā)生傳播顯著增加，每年約547萬t小麥因感染小麥條銹病而造成損失，相當于每年損失9.79億美元，使之成為世界上小麥生產(chǎn)出口國最具威脅性的生物災(zāi)害。

小麥條銹病的發(fā)病“熱點”主要集中在甘肅東南部和四川西北部，是小麥條銹病主要越夏區(qū)和多樣性的發(fā)源地[4，8]。在甘肅隴南、天水地區(qū)，高山、半山、盆地的垂直海拔（1 100～2 716 m）差異較大，小麥的栽培又呈垂直分布，便產(chǎn)生了對條銹病生長擴展有利的局部小氣候，當條件適宜時，小麥條銹病可以在所有產(chǎn)區(qū)爆發(fā)流行[9]。天水市小麥種植面積廣，在高海拔地區(qū)，由于交叉栽培早熟冬麥與晚熟冬麥，使小麥條銹菌完整的生活史即可在當?shù)仨樌瓿?，更加有利于它的繁衍和變異[8，10]。劉博等[11]研究發(fā)現(xiàn)，小麥條銹菌CYR34小種出現(xiàn)的頻率是10.56%，較2014年的頻率升高了一倍，代替原本流行的生理小種，逐漸變成在甘肅省流行傳播的首位生理小種，其流行程度和傳播趨勢逐漸加重。與先前報道的CYR32和CYR33這兩種快速流行傳播的生理小種對比，CYR34小種的毒性、致病性以及寄生能力都更強[12]。新的毒性小種的出現(xiàn)和種群數(shù)目的急劇革新，致使小麥條銹菌病原群體結(jié)構(gòu)發(fā)生了轉(zhuǎn)變，抗病小麥品種淪為感病品種，最終導致小麥條銹病的爆發(fā)和流行。

細胞周期蛋白依賴性激酶（Cyclin-dependent kinase 5，CDK5）是一種蛋白質(zhì)激酶，在控制細胞分裂和調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄應(yīng)答多種胞外和胞內(nèi)線索中發(fā)揮著重要作用，而來自CDK5/Pho85家族的周期蛋白依賴性激酶被認為在包括酵母和人類在內(nèi)的多種生物體的形態(tài)變化中發(fā)揮某種功能[13-14]。CDK5不直接參與細胞周期的調(diào)節(jié)，主要通過磷酸化相應(yīng)底物來發(fā)揮其生理學作用[15]。先前的研究表明，CDK5是一種受脯氨酸影響的蛋白激酶，大多數(shù)已知的CDK5底物是細胞骨架元件、信號分子或調(diào)節(jié)蛋白。CDK5主要與其伴侶分子P25結(jié)合，可以增加CDK5激酶穩(wěn)定性導致CDK5持續(xù)激活，且在神經(jīng)系統(tǒng)中最豐富，使得CDK5被一些神經(jīng)學家在人類疾病中研究較多[16-17]。目前的研究中CDK5基因在植物真菌病害中僅有少量報道。Castillo等[18]以玉米黑穗病菌（Ustilago maydis）為研究對象，探討CDK5/Pho85激酶在二型植物病原菌形態(tài)發(fā)生和毒力中的作用時，發(fā)現(xiàn)一個溫度敏感的CDK5突變體在限制性溫度下會引起細胞壁的形態(tài)缺陷，黑穗病菌持續(xù)的細胞極性和毒性依賴于CDK5/Pho85家族中一種必要的細胞周期依賴性激酶，并提出CDK5激酶可能在病原真菌感染過程中發(fā)揮了重要作用。截至目前，關(guān)于細胞周期蛋白依賴性激酶基因 CDK5在小麥條銹菌夏孢子萌發(fā)的相關(guān)研究尚未報道。

小麥條銹病菌群體的毒性和溫敏性，正隨著全球變暖的環(huán)境而發(fā)生變化。而根據(jù)目前的研究結(jié)果，推測CDK5基因參與了條銹菌的夏孢子的生長繁殖及適應(yīng)環(huán)境等過程，且對條銹菌的毒性也有一定的影響。本文以條銹菌生理小種CYR34為材料，通過對CDK5基因的RACE克隆及生物信息學分析，研究該基因?qū)Νh(huán)境的變化，探索條銹菌群體變異進化規(guī)律。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 供試病原菌 小麥條銹菌34號小種由甘肅省農(nóng)科院賈秋珍老師饋贈，擴繁后收集新鮮夏孢子，備用。

1.1.2 供試藥品及儀器 供試藥品：TAE緩沖液，瓊脂糖，β-巰基乙醇，無水乙醇，DEPC，無菌水，反轉(zhuǎn)錄試劑盒RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit（賽默飛世爾科技有限公司），MicroAmpTM EnduraPlateTM Optical 96-Well Fast Clear Reaction Plates with Barcode（Applied BiosystemsTM公司），MicroAmpTM Optical Adhesive Film（Applied BiosystemsTM公司），SMART○RRACE 5′/3′ Kit Components（北京寶日醫(yī)生物技術(shù)有限公司）。

RNA提取試劑盒：E.Z.N.A.○RPlant RNA Kit（廣州飛揚生物工程有限公司）。

供試儀器：實時熒光定量 PCR 儀（美國Thermo Fisher Scientific），水浴鍋（北京 HW.SY11-KP1），超凈工作臺（AIRTECH），滅菌鍋（上海申安LDZX-50KBS），漩渦震蕩儀（北京USV-1），電熱鼓風干燥箱（江蘇DGG-9023A），? 1.5 mL 離心管電泳儀（北京六一DYY-8C型），超微量分光光度計（德國IMPLEN公司的NanoPhotometer NP 80-Touch），-80 ℃超低溫冰箱（北京DW-HL398），H1850R高速臺式冷凍R離心機（湖南湘儀實驗儀器開發(fā)有限公司），凝膠成像系統(tǒng)（UVITECESSENTIRL V6）。

1.2 研究方法

1.2.1 菌種的擴繁與保存 供試的小麥條銹菌是從天水地區(qū)分離純化的CYR34，為恢復其孢子萌發(fā)的活性，選取感病品種為‘銘賢169，采用涂抹法將夏孢子接種到感病品種上進行擴繁，涂抹法所采用的夏孢子濃度為30 mg/L。接種后在濕度大于75%的黑暗條件下保濕24 h，次日放到人工氣候箱培養(yǎng)，設(shè)置氣候箱中的溫度為15 ℃上下（不超過2 ℃），濕度為70%～85%，光照條件設(shè)置為一個循環(huán)16 h，光照度為9 000～11 500 lx[19]。大約10～12 d，待大量產(chǎn)孢后，收集備用。

1.2.2 條銹菌總RNA的提取 基于前期優(yōu)化試驗條件將夏孢子做5種處理（Ⅰ：萌發(fā)0 h的夏孢子樣品；Ⅱ：萌發(fā)2 h的夏孢子樣品；Ⅲ：萌發(fā)? 6 h的夏孢子樣品；Ⅳ：萌發(fā)10 h的夏孢子樣品；Ⅴ：萌發(fā)14 h的夏孢子樣品），之后用RNA提取試劑盒E.Z.N.A. ○RPlant RNA Kit（廣州飛揚生物工程有限公司提供）對上述5個處理的夏孢子提取總RNA，將提取后的總RNA保存在-80 ℃的超低溫冰箱。

1.2.3 cDNA的合成和RACE克隆 參照Thermo Scientific公司生產(chǎn)供應(yīng)的cDNA合成試劑盒（RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit），根據(jù)其自帶試劑說明書的使用方法，對? cDNA的第1鏈進行生物合成。以轉(zhuǎn)錄組測序組裝后的EST序列為依據(jù)，設(shè)計CDK5的RACE引物，以小麥條銹菌（CYR34）萌發(fā)10 h的樣本為模板進行克隆，RACE克隆反應(yīng)體系及PCR反應(yīng)條件按照說明書進行。

1.2.4 引物的設(shè)計與合成 根據(jù)Garnica等[20]提供的和孢子萌發(fā)有關(guān)的 CDK5基因序列，BLAST到小麥條銹菌Pst-78的基因組上，找到對應(yīng)的基因序列（PST79_11595），通過Primer Premier 5對其進行特異性引物的設(shè)計（表1），之后委托北京擎科生物科技有限公司（西安分部）實現(xiàn)引物的合成工作。

1.2.5 系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建 為明確CDK5的分類地位及進化情況，利用NCBA Blastn 進行序列比對，選擇與其同源的核苷酸及氨基酸序列，采用鄰接法（Neighbor joining methed， NJ），bootstrap重復檢驗次數(shù)設(shè)置為1 000，在MAGA 5.1 構(gòu)建系統(tǒng)進化樹。

1.2.6 qRT-PCR分析 qRT-PCR分析在iQTM5熒光定量PCR反應(yīng)儀上進行，反應(yīng)體系為20? μL：2×SYBR○R? Green Pro Taq HS Premix（ROX plus） 10? μL、cDNA 1? μL、F-Primer 0.5? μL、R-Primer 0.5? μL和RNase free water 8? μL。

實時熒光定量PCR的反應(yīng)條件為：Step 1：95 ℃，30 s；Step 2：95 ℃，5 s；Step 3：50～60 ℃，30 s；Step 4：將Step 2和Step 3循環(huán)35次；Step 5：反應(yīng)結(jié)束后，進行數(shù)據(jù)分析。

數(shù)據(jù)收集來自3個生物學重復試驗，每組至少3次技術(shù)重復，陰性對照為不加模板，并選取條銹菌延伸因子基因（ EF1α）和肌動蛋白基因（ACT）作為內(nèi)參基因，以矯正目的基因在小麥條銹菌萌發(fā)過程中的真實表達水平，采用2-ΔΔCt法計算目的基因的相對表達量。

1.2.7 生物信息學分析 通過EMBOSS（http：//emboss.open-bio.org/wiki/Appdocs）對CDK5基因所編碼蛋白質(zhì)的氨基酸序列進行預(yù)測；通過ExPASy（http：//web.expasy.org/protparam/）對CDK5基因所編碼的氨基酸的類別、數(shù)量及其分子質(zhì)量進行預(yù)測；通過SMART（http：//smart.embl-heidelberg.de/#）對CDK5基因編碼蛋白質(zhì)的保守結(jié)構(gòu)域進行預(yù)測; 通過蛋白互作網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫（http：//string-db.org/）進行CDK5基因編碼的蛋白進行互作預(yù)測。

1.2.8 數(shù)據(jù)分析 數(shù)據(jù)的處理以及圖表制作使用Excel 2019統(tǒng)計軟件完成，統(tǒng)計分析使用SAS?? v8.01完成。在對每一個處理間的差異進行顯著性檢驗時，采用Duncan氏新復極差法檢驗其顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1? CDK5基因的RACE克隆及生物信息學分析

2.1.1? CDK5基因的RACE克隆 以小麥條銹菌（CYR34）夏孢子萌發(fā)后10 h的樣本為模板，提取總RNA后反轉(zhuǎn)錄為cDNA，進行CDK5基因的RACE擴增，最終獲得cDNA序列的全長為706 bp（圖1）。

2.1.2 CDK5編碼的氨基酸的類別、數(shù)量及其相對分子質(zhì)量 通過開放閱讀框預(yù)測（ORF）， CDK5 共編碼190個氨基酸，蛋白質(zhì)的分子質(zhì)量為21.68 ku，等電點（PI）為9.24。其中亮氨酸（Leu）22個（11.60%）、精氨酸（Arg）16個? （8.40%）、纈氨酸（Val）13個（6.80%）和脯氨酸（Pro）12個（6.30%）等（圖2）。

2.1.3 CDK5結(jié)構(gòu)域分析 通過SMART結(jié)構(gòu)域預(yù)測發(fā)現(xiàn)，該蛋白從第3位至287位區(qū)間含有典型的STKC激酶結(jié)構(gòu)域，蛋白二級結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果顯示，主要以α-螺旋為主（圖3）。

2.2 CDK5基因進化樹分析

與Nr數(shù)據(jù)庫進行比對之后，發(fā)現(xiàn)小麥桿銹菌（Puccinia graminis f. sp. tritici）中的CDK5基因（Gene Bank ID：XP 003321865.2）與本研究克隆的CDK5基因的相似度達到了99%。與紫色菌（Violaceomyces palustris）和紅酵母（Rhodotorula diobovata）相比，親緣關(guān)系更為接近的是小麥桿銹菌中的CDK5基因（圖4）。

2.3 CDK5基因的蛋白互做網(wǎng)絡(luò)分析

為了揭示CDK5基因編碼蛋白之間的關(guān)系，采用蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫（PPIs）進行預(yù)測分析。構(gòu)建的網(wǎng)絡(luò)有21個蛋白組成，CDK5編號為ESK66431.1，能夠與磷酸核酮糖3-差異異構(gòu)酶（Ribulose-phosphate 3-epimerase）、莢膜生物合成蛋白（Capsular biosynthesis protein）、鳥苷酸激酶（Guanylate kinase）、絲氨酸/蘇氨酸特異性蛋白激酶（Serine/threonine-specific protein kinase）、16S rRNA 蛋白和肌苷-5′-單磷酸脫氫酶（Inosine-5′-monophosphate dehydrogenase）6個蛋白之間互作（圖5）。

2.4 CDK5基因在CYR-34-8中的時序表達分析

以EF1α和ACT為雙內(nèi)參基因，萌發(fā)0 h的夏孢子樣本作為對照，通過分析細胞周期蛋白依賴性激酶基因CDK5的時序表達發(fā)現(xiàn)，在孢子萌發(fā)0～6 h的樣本中，基因的表達量表現(xiàn)出明顯的下調(diào)，萌發(fā)6 h后的樣品中基因表達量開始上升，萌發(fā)10 h后為對照的1.2倍，萌發(fā)14 h后基因的表達量達趨于平臺期，為對照的1.36倍（圖6）。

3 討? 論

隨著全球氣候變暖，小麥條銹菌耐高溫性和毒性變異越顯突出[21]。近幾年在甘肅省小麥條銹菌群體研究中，CYR34是省內(nèi)第一流行小種，它具有毒性譜寬、致病性強等特點，在眾多文獻報道中小麥主栽品種大多數(shù)對其已經(jīng)“喪失”抗性[12，22-23]。

細胞周期蛋白依賴性激酶（CDKs）屬于絲氨酸/蘇氨酸激酶家族，其家族種類數(shù)目較多。CDKs于20世紀80年代在裂殖菌和芽殖酵母中被發(fā)現(xiàn)，其與細胞周期密切相關(guān)，通過與細胞周期蛋白相互作用，以磷酸化、去磷酸化、泛素化等方式促進細胞周期的運行[24]，同時CDKs與癌癥、神經(jīng)退行性疾病等關(guān)系密切，因此在哺乳動物乃至人類中被廣泛研究[14，25-26]。CDK5屬于CDC2/CDK1家族的絲氨酸/蘇氨酸激酶，其兩側(cè)擁有參與調(diào)解的催化結(jié)構(gòu)域，由特定的輔助因子組成如p35和p39和細胞周期蛋白Ⅰ激活[27-29]。在微生物，一些真菌的新陳代謝過程中，都包含蛋白的磷酸化過程，且真菌侵染、繁殖以及信號傳導與激酶也可能與磷酸酶存在一定的關(guān)聯(lián)[30]。2015年，在煙草栽培品種紅花大金元中細胞周期蛋白依賴性激酶NtCDK8基因成功克隆，該基因含有絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶結(jié)構(gòu)域，可以通過磷酸化下游蛋白中的絲氨酸/蘇氨酸殘基，將信號從胞外轉(zhuǎn)向胞內(nèi)[31]。本試驗克隆獲得的小麥條銹菌細胞周期蛋白依賴性激酶基因CDK5，具有典型的STKC激酶結(jié)構(gòu)域，蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫（PPI）預(yù)測分析發(fā)現(xiàn)，可以與莢膜生物合成蛋白、磷酸核酮糖3-差異構(gòu)酶、肌苷-5′-單磷酸脫氫酶、絲氨酸/蘇氨酸特異性蛋白激酶、鳥苷酸激酶以及16S rRNA 蛋白互作，推測該蛋白的功能實現(xiàn)可能是通過絲氨酸蘇氨酸殘基磷酸化，從而參與到對逆境的應(yīng)答反應(yīng)過程中。

CDK5基因可以與細胞周期蛋白D/E進行結(jié)合，并與哺乳動物CDK2和酵母CDC2有60%的序列同源性，該分子高度保守，在有絲分裂后神經(jīng)元和膠質(zhì)細胞中廣泛存在，且基因的表達量較高，使得分子神經(jīng)科學家對其產(chǎn)生興趣，并對它的作用在大腦中樞神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)展做了廣泛研究[32-35]。水稻的CDK7基因不僅能夠磷酸化水稻的CDKA，還可以磷酸化人類的CDK2，參與細胞周期的調(diào)控[36]。本研究中通過分析細胞周期蛋白依賴性激酶CDK5基因的時序表達發(fā)現(xiàn)，在孢子萌發(fā)0～6 h時，基因的表達量表現(xiàn)出明顯下調(diào)，6 h后基因表達量有所回升，6～10 h回升較快，10 h后逐漸趨于穩(wěn)定，14 h表達量達到本研究中的最大值，該基因?qū)Νh(huán)境變化產(chǎn)生了應(yīng)激反應(yīng)，推斷細胞周期蛋白依賴性激酶基因 CDK5可能參與了小麥條銹菌夏孢子萌發(fā)過程中對環(huán)境信號的調(diào)控。

本研究通過時序表達分析，發(fā)現(xiàn)該基因?qū)Νh(huán)境變化產(chǎn)生了應(yīng)激反應(yīng)，推測細胞周期蛋白依賴性激酶基因 CDK5響應(yīng)了夏孢子萌發(fā)過程中的信號調(diào)控，后續(xù)將進行基因功能研究，以便對小麥條銹病的發(fā)生和傳播做到更加有效的預(yù)防和控制。

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Cloning and? Bioinformatics Analysis ofCDK5 Gene from

a?? New Wheat Stripe Rust Strain CYR34

Abstract In this study，we explored the toxic effect of cyclin-dependent kinase 5 （CDK5） on the germination of urediospores from the newly idencified CYR34 rust strain in Tianshui.TheCDK5 gene was? cloned ussing RACE （Rapid Amplifiction of cDNA Ends） and analyzed through bioinformatics tools.We successfully obtained a 706 bp cDNA sequence capable of? encoding 190 amino acid.The structural prediction of protein showed a predominant? α spiral secondary structure，with a characteristic STKC kinase domain.The homolology analysis demonstrated that CDK5 shared a closer relationship with the CDK5 found in? Puccinia graminis f.sp.? tritici.Moreover，based on? the prediction and the analysis of CDK5 protein interaction network using PPIs database，CDK5 was shown to interact with six proteins，including ribose phosphate-3 isomerase，capsule biosynthetic protein，guanylate kinase，serine/threonine-specific protein kinase，16S rRNA protein and inosine-5′-monophosphate dehydrogenase.Furthermore，the gene expression analysis indicated thatCDK5? expression was initially? down-regulated during 0-6 hours post germination （hpg） of urediospores，followed by an up-regulated after 6 hpg，reaching a peak at 14 hpg，where? was? 1.36 times higher than the control.This suggests that CDK5 may paly a role in the regulating environmental signals during the germination of CYR34 urediospores.

Key words Puccinia striiformis f.sp.tritici;CDK5; Gene clone; Bioinformatics analysis