王靜 張東鎖 董慧 孫妍妍 王珍珍 郭媛 胡勝武

摘 要 旨在明確甘藍(lán)型油菜溫敏不育系373S溫敏不育基因表達(dá)與特定細(xì)胞質(zhì)之間的關(guān)系。以甘藍(lán)型油菜373S（微粉）為父本，以具有cam細(xì)胞質(zhì)的Shaan 2B為母本，雜交、回交及自交得到BC1及F2代群體。結(jié)果表明，在上述具有cam細(xì)胞質(zhì)的BC1及F2中，可育株與不育株的分離比分別符合3∶1與15∶1，表明該群體中不育性狀受2對基因控制。分離群體中的不育株表現(xiàn)出溫敏不育特征，其不育花形態(tài)與373S沒有明顯差別；與373S比較，該分離群體中的不育植株結(jié)實(shí)角果數(shù)及自交結(jié)實(shí)率有不同程度的降低，不育期時間率（不育期時間所占百分比）無顯著差異；花冠直徑、四強(qiáng)花藥長度、二弱花藥長度無明顯差異，花柄長度、花瓣長度、花瓣寬度、四強(qiáng)雄蕊長度、二弱雄蕊長度略有增加。細(xì)胞學(xué)觀察表明，該分離群體中的不育株小孢子的發(fā)育過程、染色體形態(tài)、胼胝質(zhì)沉積與373S無明顯差異，均在花粉母細(xì)胞時期出現(xiàn)異常。本研究成功地將373S溫敏不育基因從pol細(xì)胞質(zhì)導(dǎo)入cam細(xì)胞質(zhì)，說明該溫敏不育性狀是由細(xì)胞核內(nèi)溫敏不育基因?qū)е拢c細(xì)胞質(zhì)背景無關(guān)。

關(guān)鍵詞 甘藍(lán)型油菜（Brassica napus L.）；溫敏基因；細(xì)胞質(zhì)類型；雄性不育

油菜是中國乃至世界重要的油料作物，是人類食用植物油的重要來源，也是動物飼料中蛋白質(zhì)的重要來源。中國油菜常年播種面積700萬hm2，總產(chǎn)超過1 400萬t，可生產(chǎn)優(yōu)質(zhì)食用油約550萬t，約占國產(chǎn)植物油50%；菜籽榨油后可獲得高蛋白飼用菜粕約800萬t。在油菜全價(jià)值鏈挖掘和全產(chǎn)業(yè)鏈開發(fā)中，還可以充分挖掘其菜用、蜜用、飼用、肥用、休閑觀光等價(jià)值［1］。2017年全國消費(fèi)植物油總量為3 565萬t，其中，自產(chǎn)植物油為1 100萬t，自給率僅為30.8%，國產(chǎn)油料難以滿足消費(fèi)需求，供需缺口與日俱增［2］。因此，大力發(fā)展油菜產(chǎn)業(yè)對于中國食用植物油安全供給、增加菜農(nóng)收入、實(shí)現(xiàn)鄉(xiāng)村振興戰(zhàn)略具有非常重要的意義。油菜雜種優(yōu)勢顯著，利用雜種優(yōu)勢是顯著提高油菜產(chǎn)量的重要途徑之一。目前，油菜雜種優(yōu)勢利用的主要途徑有細(xì)胞質(zhì)雄性不育（Cytoplasmic male sterility，CMS）、細(xì)胞核雄性不育（Genic male sterility，GMS）、生態(tài)型雄性不育（Ecotype male sterility，EMS）、化學(xué)雜交劑誘導(dǎo)的雄性不育（Chemical hybridization agent （CHA）-induced male sterility，CIMS）和自交不親和（Self-incompatibility，SI）等［3］。生態(tài)型（光溫敏）雄性不育是一種特殊的不育系類型，其育性由自身基因和外界環(huán)境條件共同決定，特定生態(tài)條件下既可作為不育系進(jìn)行制種，又可作為保持系自交繁殖，真正實(shí)現(xiàn)一系兩用。生態(tài)型雄性不育具有恢復(fù)譜廣、無細(xì)胞質(zhì)負(fù)效應(yīng)、配組自由、易選配出強(qiáng)優(yōu)勢組合等優(yōu)勢，在油菜雜種優(yōu)勢利用中受到廣泛關(guān)注和研究。中國科學(xué)家在油菜光溫敏雄性不育材料的發(fā)掘及利用方面做了大量先驅(qū)工作，發(fā)現(xiàn)了一些光溫敏雄性不育材料，選育出湘雜油系列、贛兩油系列、華油雜系列等兩系雜交種，預(yù)示油菜兩系雜交種發(fā)展前景廣闊。目前，利用生態(tài)型雄性不育材料選育出一系列油菜雜交種，例如，利用湘油91S配制出的‘湘雜油5號［4-5］，利用其衍生系湘油402S配制出的‘湘雜油7號［6-7］；利用501-8S配制出的‘兩優(yōu)586［8-9］，利用其衍生不育系選育出‘贛兩優(yōu)2號‘贛兩優(yōu)3號‘贛兩優(yōu)5號‘秀油雜610等品種［10-13］。此外，報(bào)道的光溫敏雄性不育兩用系還有湘油104S［14］、溫敏不育系533S及其衍生系417S［15-16］、H50S［17］、160S［18］、SP2S［19］、TE5A［20］、K121S［21］等；光溫敏互作不育系有H90S、N196S、遵矮S等［22-24］。

甘藍(lán)型油菜生態(tài)型雄性不育系373S是由西北農(nóng)林科技大學(xué)油菜研究中心（以下稱本課題組）發(fā)現(xiàn)的自然突變不育株，經(jīng)多年選擇育成［25］。前期研究表明，373S的育性主要受溫度條件影響，表現(xiàn)為低溫可育、高溫不育，育性轉(zhuǎn)換的臨界值在10～12? ℃；細(xì)胞學(xué)研究結(jié)果表明，373S小孢子敗育起始于花粉母細(xì)胞時期；遺傳研究表明，373S的不育性狀受1對隱性核基因Bnmst1控制。分子鑒定結(jié)果表明，373S具有pol細(xì)胞質(zhì)，其不育性狀遺傳機(jī)制與國內(nèi)油菜雜交種育種中廣泛利用的pol CMS不同［26-27］。那么，373S溫敏不育基因的表達(dá)是否與pol細(xì)胞質(zhì)背景有關(guān)？為回答這一科學(xué)問題，本研究以373S微量花粉為父本，以具有可育細(xì)胞質(zhì)cam的甘藍(lán)型油菜為母本，將373S的溫敏不育基因通過雜交等手段，導(dǎo)入cam細(xì)胞質(zhì)背景中，對其后代群體的不育株進(jìn)行花器官形態(tài)觀察、育性調(diào)查、細(xì)胞學(xué)觀察以及遺傳研究，旨在明確373S溫敏不育基因與特定油菜細(xì)胞質(zhì)之間是否存在互作關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

甘藍(lán)型油菜生態(tài)型雄性不育系373S、Shaan 2B、ZS9?? 3個自交系。在細(xì)胞質(zhì)類型分子檢測結(jié)果的基礎(chǔ)上，以具有cam細(xì)胞質(zhì)類型的Shaan 2B為母本，373S為父本，進(jìn)行雜交獲得F1代，F(xiàn)1代自交獲得F2代，F(xiàn)1代與373S回交獲得BC1代。以上材料于2020年9月播種于陜西楊凌西北農(nóng)林科技大學(xué)楊凌試驗(yàn)基地，一般大田管理，小區(qū)? 種植。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞質(zhì)類型鑒定 采取373S，以及Shaan 2B 與373S雜交衍生的具有cam細(xì)胞質(zhì)背景的BC1代及F2代群體中不育株的幼嫩葉片，利用改良CTAB方法［28］提取基因組DNA。采用一步多重PCR方法鑒定所取材料的細(xì)胞質(zhì)類型，所用3對PCR引物信息及試驗(yàn)方法見Zhao等［29］文獻(xiàn)報(bào)道。

1.2.2 植株形態(tài)觀察及育性統(tǒng)計(jì) 2021年盛花期，調(diào)查統(tǒng)計(jì)Shaan 2B×373S衍生的具有cam細(xì)胞質(zhì)背景的BC1及F2群體中可育株與不育株（≥5朵不育花的單株［27］）情況。上述群體中，可育株與不育株的分離比率利用χ2檢驗(yàn)，確定該群體中不育性狀的遺傳行為。

在上述BC1及F2群體中，各隨機(jī)選取10株不育株，每個不育株隨機(jī)選取20朵花，對其花冠直徑、花柄長度、花瓣長度、花瓣寬度、四強(qiáng)雄蕊長度、二弱雄蕊長度、四強(qiáng)花藥長度、二弱花藥長度等指標(biāo)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)；記載其總花期時間、不育期時間、計(jì)算不育時間率（不育期時間所占百分比），不育時間率=不育期時間/總花期時間×100；不育植株套袋自交，統(tǒng)計(jì)自交結(jié)實(shí)率，自交結(jié)實(shí)率=? 自交結(jié)實(shí)角果數(shù)/自交花朵總數(shù)；同時，對不育植株花序、花器官形態(tài)特征進(jìn)行拍照記載。

1.2.3 細(xì)胞學(xué)觀察 花期選取ZS9、373S、Shaan 2B×373S衍生的BC1、F2群體中不育株的主花序，利用卡諾固定液［V（無水乙醇）∶V（冰乙? 酸）=3∶1］ 固定12～24 h，經(jīng)梯度乙醇（100%，95%，85%，75%）脫水各2 h后，置于70%乙醇中保存?zhèn)溆谩Ｈ」潭ú牧系男廴?，利?%醋酸洋紅染液染色壓片觀察；苯胺藍(lán)染液（DAPI染液）染色壓片，進(jìn)行染色體及胼胝質(zhì)的觀察。細(xì)胞學(xué)觀察結(jié)果在OLYMPUS BX51（奧林巴斯，日本）熒光顯微鏡下拍照記錄。

1.3 數(shù)據(jù)處理

利用Excel 2013對試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行整理，SPSS 24.0對群體育性數(shù)據(jù)進(jìn)行χ2檢驗(yàn)，且對指標(biāo)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，差異顯著性分析使用Duncans法，P<0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 細(xì)胞質(zhì)類型鑒定結(jié)果

為確定待測材料的細(xì)胞質(zhì)類型，利用本課題組前期研發(fā)的一步多重PCR方法［30］對參試材料的細(xì)胞質(zhì)類型進(jìn)行鑒定。結(jié)果表明（圖1），不同的細(xì)胞質(zhì)類型（IP-ogu、ogu、pol、nap、cam）擴(kuò)增出特定的細(xì)胞質(zhì)類型條帶，與Zhao等［29］報(bào)道結(jié)果相符。其中，373S擴(kuò)增出747 bp條帶，為pol細(xì)胞質(zhì)類型。Shaan? 2B擴(kuò)增500 bp和800 bp兩條條帶，這兩條條帶亮度基本一致，為cam細(xì)胞質(zhì)類型。以Shaan 2B為母本，以373S不育株（微粉）為父本，雜交得到的BC1及F2群體中不育株，擴(kuò)增結(jié)果與Shaan? 2B帶型一致，為cam細(xì)胞質(zhì)類型。

2.2 育性遺傳

對Shaan 2B×373S衍生的F1、BC1及F2群體進(jìn)行育性調(diào)查（表1），結(jié)果顯示，F(xiàn)1植株全部表現(xiàn)為可育，而在總共87株的BC1群體中，可育株63株，不育株24株，分離比符合3∶1（P>? 0.05），在總共406株的F2群體中，可育株386株，不育株20株，分離比符合15∶1（P>0.05）。育性分離比結(jié)果說明，由373S衍生的cam細(xì)胞質(zhì)類型的群體中，其不育性狀受2對隱性基因控制。結(jié)果表明，373S的溫敏基因已成功導(dǎo)入cam細(xì)胞質(zhì)類型內(nèi)，373S溫敏不育基因的表達(dá)與特定細(xì)胞質(zhì)背景（pol）無關(guān)。

2.3 不同細(xì)胞質(zhì)背景下的不育植株形態(tài)學(xué)觀察及單花性狀調(diào)查

觀察具有pol細(xì)胞質(zhì)背景的373S植株，以及Shaan 2B×373S衍生的具有cam細(xì)胞質(zhì)背景的BC1及F2群體中不育植株的育性變化、單花形態(tài)和花粉活力情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)三者初花期時，同一花序底端所開花均為不育花，雄蕊退化，無花粉或微量花粉；隨著田間環(huán)境條件的轉(zhuǎn)變，花序頂端新開放的花朵育性開始轉(zhuǎn)變?yōu)榭捎隣顟B(tài)，花藥形態(tài)飽滿，正常開裂，釋放花粉，期間，有多級育性花并存。兩種不同細(xì)胞質(zhì)背景的生態(tài)不育株，植株花的育性均隨田間環(huán)境條件的變化而發(fā)生轉(zhuǎn)變，同一花序中出現(xiàn)可育花和不育花并存的現(xiàn)象，育性表現(xiàn)為環(huán)境敏感不育（圖2-A1～C1）。對其不育花單花觀察發(fā)現(xiàn)，其單花形態(tài)沒有明顯差異?；ㄆ鞴偻庑慰傮w來看，萼片、花瓣、雌蕊發(fā)育均正常，但雄蕊退化，導(dǎo)致不育花花冠正面均看不到雄蕊，花絲長度明顯變短，花藥干癟萎縮，高度不及柱頭（圖2-A2～C2）。分別對其不育花花粉活力進(jìn)行測定，發(fā)現(xiàn)其花粉育性表現(xiàn)為徹底不育（圖2-? A3～C3）。

為探究其不育期時間、結(jié)實(shí)率及花器官性狀之間是否存在差異，對所取不育材料進(jìn)行育性統(tǒng)計(jì)調(diào)查及花器官性狀調(diào)查。結(jié)果表明，373S、Shaan 2B×373S衍生的BC1及F2群體中不育株的不育期時間與花期總時間、不育時間率無顯著差異。結(jié)實(shí)率方面，與373S相比，Shaan 2B×373S衍生的BC1及F2群體中，不育株的自交結(jié)實(shí)率有所降低（表2）?；ㄆ鞴傩誀钫{(diào)查發(fā)現(xiàn)（表3），除花冠直徑、四強(qiáng)花藥長度、二弱花藥長度外，Shaan?? 2B×373S衍生的BC1及F2群體中不育株的其他5個指標(biāo)（花柄長度、花瓣長度、花瓣寬度、四強(qiáng)雄蕊長度、二弱雄蕊長度）比373S顯著增加。

2.4 不同細(xì)胞質(zhì)背景下的不育株花藥敗育的細(xì)胞學(xué)觀察

通過對不同細(xì)胞質(zhì)背景下的油菜溫敏雄性不育材料小孢子發(fā)育觀察，研究其小孢子在主要細(xì)胞學(xué)發(fā)育時期是否存在差異。結(jié)果表明，與可育植株（圖3-F1）相比，373S及其衍生的不育植株均在花粉母細(xì)胞時期出現(xiàn)異常（圖3-A1～C1），可育花藥的花粉母細(xì)胞周圍被圓潤的胼胝質(zhì)層包裹，而不育花藥周圍胼胝質(zhì)稀薄，但均能進(jìn)行減數(shù)分裂且形成四分體結(jié)構(gòu)。四分體時期，373S及其衍生的cam細(xì)胞質(zhì)背景的不育花藥周圍胼胝質(zhì)均明顯薄于可育花藥（圖3-F2～C2）。隨后，胼胝質(zhì)解體，小孢子釋放，此時可育小孢子與不育小孢子形態(tài)出現(xiàn)明顯異常，可育小孢子花粉壁形成，外形圓潤（圖3-F3），而不同細(xì)胞質(zhì)背景下的不育小孢子花粉外壁形狀異常且不規(guī)則，出現(xiàn)橢圓形、多邊形等異常形狀（圖3-A3～C3）。之后，小孢子進(jìn)行有絲分裂，可育小孢子體積逐步增大，而不育小孢子的體積無明顯變化（圖3-F3～C3）。成熟期，可育花粉粒細(xì)胞質(zhì)分布均勻，形態(tài)飽滿，而不育花粉粒只?；ǚ劭諝ぃǚ蹟∮▓D3-F5～C5）。在花藥發(fā)育的整個時期內(nèi)，不論是pol細(xì)胞質(zhì)背景的373S，還是其衍生出的cam細(xì)胞質(zhì)背景的不育植株，在相同時期內(nèi)，其小孢子發(fā)育形態(tài)等無明顯差異。

為探究花藥發(fā)育期間核內(nèi)染色體形態(tài)是否存在差異，對所取材料的花藥進(jìn)行DAPI染色觀察。結(jié)果表明，與可育花藥相比，兩種不同細(xì)胞質(zhì)背景下的不育株，在花粉母細(xì)胞減數(shù)分裂期，核內(nèi)染色體出現(xiàn)異常，Shaan 2B×373S衍生的BC1及F2群體中不育株花藥減數(shù)分裂不同步（圖4-B1，4-C1），373S不育花藥呈團(tuán)狀且黏連狀態(tài)（圖4-A1）。四分體時期，pol細(xì)胞質(zhì)背景373S及衍生的cam細(xì)胞質(zhì)背景的BC1代及F2代中不育株的不育花藥其四分體熒光信號均模糊，與可育花藥清晰的熒光信號成明顯對比（圖4-F2～C2）。成熟花粉粒時期，可育花粉粒核內(nèi)染色體熒光信號強(qiáng)烈，而不育花粉粒均無熒光信號（圖4-F3～C3）。對其胼胝質(zhì)沉積模式觀察發(fā)現(xiàn)，可育花藥的胼胝質(zhì)圓潤清晰，不育花藥其熒光信號在花粉母細(xì)胞時期便出現(xiàn)模糊現(xiàn)象（圖5-F1～c1）。四分體時期，不育花藥的四分體體積均小于可育花藥（圖5-F2～C2），其胼胝質(zhì)厚度也明顯薄于可育四分體，但在373S及衍生的cam細(xì)胞質(zhì)背景的不育花藥之間，其發(fā)育大小及胼胝質(zhì)厚度無明顯差異（圖5-f2～c2）。

3 討論與結(jié)論

利用雜種優(yōu)勢可提高作物產(chǎn)量品質(zhì)，是作物育種的重要途徑。生態(tài)型雄性不育材料的發(fā)現(xiàn)，促使作物雜種優(yōu)勢利用由“三系”向“兩系”轉(zhuǎn)變，因其育性受自身基因型和外界環(huán)境因素共同調(diào)控，其遺傳機(jī)制也復(fù)雜多樣。研究表明，油菜生態(tài)不育系501-8S［30］、104S［14］、Huiyou50S［31］、TE5A［20］等均屬于單基因遺傳模式；417S［32］、SP2S［19］、100S［33］其育性則由2對基因控制，屬于雙基因遺傳模式；3基因及以上遺傳模式則包括湘油91S、H90S、芥菜型油菜溫敏核不育系K121S［34-36］；甘藍(lán)型油菜細(xì)胞質(zhì)生態(tài)雄性不育兩用系A(chǔ)B1［37］及其衍生系8-8112AB［38］等則屬于質(zhì)量-數(shù)量遺傳。本課題組前期對373S的遺傳研究表明，其育性受1對隱性核基因控制，且具有pol細(xì)胞質(zhì)背景［27-28］。本研究以373S（微粉）為父本，通過雜交手段嘗試將其溫敏不育基因?qū)肟捎?xì)胞質(zhì)cam背景中，以此探究該溫敏不育基因的表達(dá)與細(xì)胞質(zhì)背景之間的關(guān)系。結(jié)果表明，由373S衍生的cam細(xì)胞質(zhì)類型的BC1及F2群體中，均有不育株出現(xiàn)，且表現(xiàn)為溫敏不育特性，表明373S溫敏不育基因已成功導(dǎo)入cam細(xì)胞質(zhì)背景中，且能夠正常表達(dá)，從而使植株表現(xiàn)為溫敏

不育性狀。但對BC1群體及F2群體中，可育株與不育株的分離比的卡方檢驗(yàn)表明，373S衍生的cam細(xì)胞質(zhì)類型的后代其不育性狀受2對獨(dú)立基因控制，表現(xiàn)為隱性，這與前期研究的373S不育性狀受1對隱性基因控制的結(jié)果有差異。推測出現(xiàn)這種現(xiàn)象的原因，可能是不同的油菜親本與373S之間存在的育性基因數(shù)目有差異，在一些親本中僅有1對基因差異，在另外一些親本中存在2對基因差異。筆者正在對出現(xiàn)這種遺傳行為的原因，進(jìn)行經(jīng)典遺傳學(xué)和分子標(biāo)記驗(yàn)證。

對生態(tài)型雄性不育材料進(jìn)行細(xì)胞學(xué)觀察，能夠發(fā)現(xiàn)其敗育時期及特征，有助于研究揭示其敗育機(jī)理。前人研究表明，反型生態(tài)不育系533S無法分化出正常的花粉囊，屬于孢原細(xì)胞敗育型［39］。SP2S、TE5A由于減數(shù)分裂時期胼胝質(zhì)降解滯后導(dǎo)致不育，屬于花粉母細(xì)胞敗育型，其中SP2S還出現(xiàn)絨氈層細(xì)胞空泡化現(xiàn)象［19］，但TE5A的絨氈層發(fā)育正常［40］。生態(tài)型雄性不育系H50S、反型溫敏不育系Huiyou50S均在單核時期出現(xiàn)異常現(xiàn)象，其中，H50S在此時期絨氈層降解緩慢，細(xì)胞核呈現(xiàn)解體［17］，而Huiyou50S其絨氈層在單核后期迅速降解，兩者均屬于小孢子發(fā)育時期敗育型［41］。本研究發(fā)現(xiàn)，373S中不育基因在不同細(xì)胞質(zhì)背景下的不育株花藥均在花粉母細(xì)胞時期出現(xiàn)異?，F(xiàn)象。由373S衍生出的cam細(xì)胞質(zhì)類型的不育株其核內(nèi)染色體在花粉母細(xì)胞時期出現(xiàn)降解現(xiàn)象，減數(shù)分裂不同步、胼胝質(zhì)層稀薄等；在小孢子時期，其花粉外壁不規(guī)則，體積不增大，直至敗育。

本研究結(jié)果表明，調(diào)控373S育性的溫敏基因在不同細(xì)胞質(zhì)背景下表達(dá)，不同細(xì)胞質(zhì)溫敏不育材料間小孢子發(fā)育行為無明顯差異，溫敏基因的表達(dá)與pol細(xì)胞質(zhì)背景無關(guān)。該研究結(jié)果將為分離克隆油菜373S溫敏不育基因、明確其雄性不育機(jī)理及育種利用奠定基礎(chǔ)。

參考文獻(xiàn) Reference：

［1］ 王漢中.以新需求為導(dǎo)向的油菜產(chǎn)業(yè)發(fā)展戰(zhàn)略［J］.中國油料作物學(xué)報(bào)，2018，40（5）：613-617.

WANG H ZH.New-demeand oriented oilseed rape industry developing strategy［J］.Chinese Journal of Oil Crop Sciences，2018，40（5）：613-617.

［2］ 劉 成，馮中朝，肖唐華，等.我國油菜產(chǎn)業(yè)發(fā)展現(xiàn)狀、潛力及對策［J］.中國油料作物學(xué)報(bào)，2019，41（4）：485-489.

LIU CH，F(xiàn)ENG ZH ZH，XIAO T H，et al.Development，potential and adaptation of Chinese rapeseed industry［J］.Chinese Journal of Oil Crop Sciences，2019，41（4）：485-489.

［3］ 傅廷棟，沈金雄，易 斌.雜交油菜的遺傳與育種［M］.武漢：湖北科學(xué)技術(shù)出版社：2019.

FU T D，SHEN J X，YI B.Breeding and Utilization of Rapeseed［M］.Wuhan：Hubei? Science & Technology Press，2019.

［4］ 席代汶，陳衛(wèi)江，寧祖良.甘藍(lán)型油菜溫敏核不育系‘湘91S的選育［J］.湖南農(nóng)業(yè)科學(xué)，1994（4）：17-18.

XI D W，CHEN W J，NING Z L，et al.Breeding of thermo-sensitive genic male-sterile line ‘Xiang91S in Brassica napus［J］.Hunan Agricultural Sciences，1994（4）：17-18.

［5］ 席代汶，鄔賢夢，寧祖良，等.優(yōu)質(zhì)兩系雜交油菜湘雜油5號的選育［J］.中國油料作物學(xué)報(bào)，2005，27（1）：23-25.

XI D W，WU X M，NING Z L，et al.Breeding of a two-linehybrid variety Xiangzayou 5 with double-low quality in Brassica napus L.［J］.Chinese Journal of Oil Crop Sciences，2005，27（1）;23-25.

［6］ 鄔賢夢，席代汶，寧祖良，等.甘藍(lán)型油菜溫敏核不育系湘油402S的選育［J］.中國油料作物學(xué)報(bào)，2005，27（3）：74-76.

WU X M，XI D W，NING Z L，et al.Breeding of thermo-sensitive genic male-sterile line Xiangyou 402S in Brassica napus［J］.Chinese Journal of Oil Crop Sciences，2005，? 27（3）：74-76.

［7］ 鄔賢夢，寧祖良，黃虎蘭，等.優(yōu)質(zhì)雜交油菜新品種湘雜油7號的選育［J］.湖南農(nóng)業(yè)科學(xué)，2005（5）：37-38.

WU X M，NING Z L，HUANG H L，et al.Breeding of high quality rape variety Xiangzayou No.7［J］.Hunan Agricultural Sciences，2005（5）：37-38.

［8］ 劉尊文，彭芝蘭，周小平，等.甘藍(lán)型油菜光溫敏雄性不育兩用系501-8S的選育［J］.中國油料作物學(xué)報(bào)，1998，20（1）：13-16.

LIU Z W，PENG ZH? L，ZHOU X P，et al.Breeding of GMS two-line system 501-8S sensitive to temperature and photoperiod in Brassica napus［J］.Chinese Journal of Oil Crop Sciences，1998，20（1）：13-16.

［9］ 劉尊文，袁衛(wèi)紅，李文信，等.甘藍(lán)型兩系雜交油菜兩優(yōu)586的選育［J］.中國油料作物學(xué)報(bào)，2000，22（2）：5-7.

LIU Z W，YUAN W H，LI W X，et al.Breeding of two-line system hybrid Liangyou 586 in Brassica napus［J］.Chinese Journal of Oil Crop Sciences，2000，22（2）：5-7.

［10］ [ZK（#]劉尊文，吳 平，張遷西，等.優(yōu)質(zhì)兩系雜交油菜“贛兩優(yōu)二號”的選育［J］.江西農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2007，19（11）：10-11.

LIU Z W，WU P，ZHANG Q X，et al.Breeding of high quality two-line hybrid rape variety Ganliangyou2［J］.Acta? Agriculturae Jiangxi，2007，19（11）：10-11.

［11］ 高海軍，劉尊文，袁衛(wèi)紅，等.甘藍(lán)型兩系雜交油菜贛兩優(yōu)3號的選育［J］.湖北農(nóng)業(yè)科學(xué)，2010，49（10）：2370-2371.

GAO H J，LIU Z W，YUAN W H，et al.Breeding of two-line hybrid rape variety Ganliangyou No.3［J］.Hubei Agricultural Sciences，2010，49（10）：2370-2371.

［12］ 劉 寧，吳 平，袁衛(wèi)紅，等.優(yōu)質(zhì)兩系雜交油菜‘贛兩優(yōu)5號的選育［J］.江西農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2013，25（2）：25-26.

LIU N，WU P，YUAN W H，et al.Breeding of high-quality two-line hybrid rape variety ‘Ganliangyou No.5［J］.Acta? Agriculturae Jiangxi，2013，25（2）：25-26.

［13］ 王小武，袁衛(wèi)紅，吳 平，等.甘藍(lán)型早熟兩系雜交油菜‘秀油雜610的選育［J］.湖南農(nóng)業(yè)科學(xué)，2016（4）：14-15，18.

WANG X W，YUAN W H，WU P，et al.Breeding of precocious two-line hybrid rape variety ‘Xiuyouza 610? in Brassica napus［J］.Hunan Agricultural Sciences，2016（4）：14-15，18.

［14］ 鄔賢夢，肖 鋼，官春云.甘藍(lán)型油菜溫敏核不育材料104S的發(fā)現(xiàn)及遺傳特性分析［J］.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2009，35（6）：597-601.

WU X M，XIAO G，GUAN CH? Y.Discovery and genetic analysis of a thermo-sensitive genic ms material 104S in Brassica napus［J］.Journal of Hunan Agricultural University （Natural Sciences），2009，35（6）：597-601.

［15］ 董軍剛，董振生，劉創(chuàng)社，等.甘藍(lán)型油菜生態(tài)型雄性不育兩用系533st的選育［J］.陜西農(nóng)業(yè)科學(xué)，2001（7）：8-9.

DONG J G，DONG ZH SH，LIU CH SH，et al.Breeding of GMS two-line system 533st in Brassica napus［J］.Shaanxi Agricultural Sciences，2001（7）：8-9.

［16］ 董軍剛，董振生，劉創(chuàng)社，等.甘藍(lán)型油菜溫敏不育系417S選育與鑒定［J］.中國油料作物學(xué)報(bào)，2008，30（3）：306-311.

DONG J G，DONG ZH SH，LIU CH? SH，et al.Selection and identification of thermo-sensitive male sterile line 417S in Brassica napus L.［J］.Chinese Journal of Oil Crop Sciences，2008，30（3）：306-311.

［17］ 孫曉敏，胡勝武，于澄宇.油菜生態(tài)不育系H50S花藥敗育的細(xì)胞學(xué)觀察［J］.西北農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2009，18（5）：153-158.

SUN X M，HU SH W，YU CH? Y.Cytological observation of anther development of an ecological male sterile line H50S in Brassica napus L.［J］.Acta Agriculturae Boreali-occidentalis Sinica，2009，18（5）：153-158.

［18］ 張 濤，沈亮余，王瑞雪，等.甘藍(lán)型油菜雄性不育系160S育性轉(zhuǎn)換與利用［J］.西北植物學(xué)報(bào)，2012，32（1）：35-41.

ZHANG T，SHEN L Y，WANG R X，et al.Fertility alteration and utilization of male-sterile line 160S in Brassica napus［J］.Acta Botany Boreali-occidentalis Sinica，2012，32（1）：35-41.

［19］ YU C Y，GUO Y F，GE J，et al. Characterization of a new temperature-sensitive male sterile line SP2S in rapeseed （Brassica napusL.）［J］.Euphytica，2015，206（2）：473-485.

［20］ ZENG X H，LI W P，WU Y H，et al. Fine mapping of a dominant thermo-sensitive genic male sterility gene （BntsMs） in rapeseed （Brassica napus） with AFLP- and Brassica rapa-derived PCR markers［J］.Theoretical and Applied Genetics，2014，127（8）：1733-1740.

［21］ 李石開，劉其寧，吳學(xué)英，等.芥菜型油菜光溫敏核不育系K121S的選育［J］.中國油料作物學(xué)報(bào)，2002，24（3）：1-5.

LI SH?? K，LIU Q N，WU X Y，et al.Breeding of photo-thermosensitive GMS line K121S in mustard（Brassica juncea）［J］.Chinese Journal of Oil Crop Sciences，2002，24（3）：? 1-5.

［22］ 王 華，趙繼獻(xiàn)，湯曉華.甘藍(lán)型油菜新型細(xì)胞核雄性不育材料的選育［J］.中國油料，1997，9（1）：8-11.

WANG H，ZHAO J X，TANG X H.Selection and breeding of a new genetic male sterility type in B.napus? L.［J］.Chinese Oil，1997，9（1）：8-11.

［23］ 劉尊文，吳 平，袁衛(wèi)紅，等.甘藍(lán)型油菜光溫敏核不育兩用系N196S的選育［J］.江西農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2006，28（5）：654-667.

LIU Z W，WU P，YUAN W H，et al.Breeding of photo and temperature sensitive genic male sterile doub-use line N196S in Brassica napus［J］.Acta Agriculturae? Universitatis Jiangxiensis，2006，28（5）：654-667.

［24］ 蘇振喜，邱懷珊，李石開，等.芥菜型油菜生態(tài)型雄性不育兩用系研究［J］.中國油料作物學(xué)報(bào)，1999，21（2）：5-7.

SU ZH? X，QIU H SH，LI SH? K，et al.Preliminary studies on GMS two-line system in B.juncea［J］.Chinese Journal of Oil Crop Sciences，1999，21（2）：5-7.

［25］ 于澄宇，李 瑋，常建軍，等.油菜溫敏雄性不育系373S的選育［J］.中國農(nóng)學(xué)通報(bào)，2007，23（7）：245-248.

YU CH? Y，LI W，CHANG J J，et al.Development of a thermo-sensitive male-sterile line 373S in Brassica napus L.［J］.Chinese Agricultural Science Bulletin，2007，? 23（7）：24-248.

［26］ 孫妍妍.甘藍(lán)型油菜生態(tài)不育系373S的溫光特性、細(xì)胞學(xué)特征及遺傳調(diào)控網(wǎng)絡(luò)研究［D］.陜西楊凌：西北農(nóng)林科技大學(xué)，2020.

SUN Y? Y.Thermo- and photoperiod- characterization，cytological characterization and genetic regulatory betwork of the ecotype male sterile line 373S in Brassica napus L.［D］.Yangling Shaanxi：Northwest Agriculture & Forestry University，2020.

［27］ SUN Y Y，ZHANG D S，WANG Z Z，et al. Cytological observation of anther structure and genetic investigation of a thermo-sensitive genic male sterile line 373S in Brassica napus L［J］.BMC Plant Biology，2020，20（8）：1-14.

［28］ LI J L，WANG S，YU J，et al. A modified CTAB protocol for plant DNA extraction［J］.Chinese Bulletin of Botany，2013，48（1）：72-78.

［29］ ZHAO H X，LI Z J，HU S W，et al. Identification of cytoplasm types in rapeseed （Brassica napus L.） accessions by a multiplex PCR assay［J］.Theoretical and Applied Genetics，2010，121（4）：643-650.

［30］ 徐 亮，彭小松，賀浩華，等.甘藍(lán)型油菜生態(tài)型細(xì)胞質(zhì)雄性不育系育性的初步研究［J］.西北農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2006，? 15（1）：20-23.

XU L，PENG X S，HE H H，et al. Preliminary study on the fertility of the ecotypical? CMS for Brassica napus L.［J］.Acta Agriculturae Boreali-occidentalis Sinica，2006，15（1）：20-23.

［31］ 徐獻(xiàn)鋒，胡玉梅，于澄宇，等.甘藍(lán)型油菜反型溫敏核不育Huiyou50S的生理特征及遺傳分析［J］.華北農(nóng)學(xué)報(bào)，2014，29（3）：147-152.

XU X F，HU Y M，YU CH? Y，et al. Physiological characterization and genetic analysis of reverse thermo-sensitive genic male-sterile line Huiyou50S in Brassica napus［J］.Acta Agriculturae Boreali-Sinica，2014，29（3）：147-152.

［32］ 董軍剛.甘藍(lán)型油菜溫敏細(xì)胞質(zhì)雄性不育系417S選育與鑒定［D］.陜西楊凌：西北農(nóng)林科技大學(xué)，2010.

DONG J G.Development and indentification of thermos-sensitive CMS 417S in Brassica napus L.［D］.Yangling Shaanxi：Northwest A&F? University，2010.

［33］ 陶芬芳，楊學(xué)樂，彭 燁，等.甘藍(lán)型油菜溫敏核不育系100S的遺傳特性分析［J］.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2016，42（2）：125-128.

TAO F F，YANG X L，PENG Y，et al. Analysis of the inherited character of a thermo-sensitive genic male sterile line 100S in Brassica napus［J］.Journal of Hunan Agricultural University （Natural Sciences），2016，42（2）：125-128.

［34］ 李 莓，陳衛(wèi)江，席代汶.甘藍(lán)型油菜溫敏核不育系湘油91S的研究與應(yīng)用前景［J］.作物研究，1997（4）：23-26.

LI M，CHEN W J，XI D W. Research and application prospect of thermosensitive male sterile line Xiangyou 91S in Brassica napus L［J］.Crop Research，1997（4）：23-26.

［35］ 王 華，湯曉華，趙繼獻(xiàn).甘藍(lán)型油菜胞核雄性不育材料H90S的遺傳研究［J］.中國油料作物學(xué)報(bào)，2001，23（4）：11-15.

WANG H，TANG X H，ZHAO J X. Genetic study on ecotype genetic male sterile of H90S in Brassica napus L［J］.Chinese Journal of Oil Crops，2001，23（4）：11-15.

［36］ 李石開，蘇振喜，吳學(xué)英.油菜‘K121S溫敏核不育的遺傳初探［J］.西南農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2004，17（增刊）：49-54.

LI SH? K，SU ZH X，WU X Y.Preliminary study on inheritance of? Brassica? juncea? thermosensitive? genicmale sterile fine ‘K121S［J］.Southwest China Journal of Agricultural Science，2004，17（Suppl）：49-54.

［37］ 楊光圣，傅廷棟，楊小牛，等.甘藍(lán)型油菜生態(tài)雄性不育兩用系的研究Ⅰ.雄性不育兩用系的遺傳［J］.作物學(xué)報(bào)，1995，21（2）：129-135.

YANG G SH，F(xiàn)U T D，YANG X N，et al.Studies on ecotypical male sterile line of Brassica napus L. I. Inheritance of the ecotypical male sterile line［J］.Acta? Agronomica Sinica，1995，21（2）：129-135.

［38］ 袁 美，楊光圣，傅廷棟，等.甘藍(lán)型油菜生態(tài)型細(xì)胞質(zhì)雄性不育兩用系的研究Ⅲ．8-8112AB的溫度敏感性及其遺傳［J］.作物學(xué)報(bào)，2003，29（3）：330-335.

YUAN M，YANG G SH，F(xiàn)U T D，et al.Studies on the ecotypical male sterile-fertile line of Brassica napus L. III. Sensitivity to temperature of 8-8112AB and its inheritance［J］.Acta? Agronomica Sinica，2003，29（3）：330-335.

［39］ 董軍剛，董振生，劉絢霞，等.甘藍(lán)型油菜生態(tài)雄性不育系533S花藥發(fā)育的細(xì)胞學(xué)研究［J］.西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2004，32（7）：61-66.

DONG J G，DONG ZH SH，LIU X X，et al.Cytological studies on anther development of ecological male sterile line 533S in Brassica napus L.［J］.Journal of Northwest A&F University（Natural Science Edition），2004，32（7）：61-66.

［40］ 李可琪，曾新華，袁 榮，等.甘藍(lán)型油菜溫敏細(xì)胞核雄性不育系TE5A花藥發(fā)育的細(xì)胞學(xué)研究［J］.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)，2016，49（12）：2408-2417.

LI K Q，ZENG X H，YUAN R，et al.Cytological researches on the anther development of a thermo-sensitive genic male sterile line TE5A in Brassica napus［J］.Scientia? Agricultura Sinica，2016，49（12）：2408-2417.

［41］ 葛 娟，郭英芬，于澄宇，等.甘藍(lán)型油菜光、溫敏雄性不育系Huiyou50S花粉敗育的細(xì)胞學(xué)觀察［J］.作物學(xué)報(bào)，2012，38（3）：541-548.

Expression of Thermo-sensitive? Male Sterility Gene in Normal Cytoplasmic Type Derived from? TGMS Line 373S （Brassica napus）

Abstract This study investigated the relationship between the thermo-sensitive male sterile gene and specific cytoplasmic type in thermo-sensitive genic male sterile （TGMS） line 373S in Brassica napus L.，with the aim of advancing the understanding of its male sterility mechanism and utilization in two-line hybrid breeding.This study used the? female parent line Shaan 2B with normal cytoplasmic type cam and the TGMS line 373S as the male parent，in a cross，resulting in the separation ratios of fertile and sterile plants at 3∶1 and 15∶1 in BC1 and F2 population，respectively，suggesting? that the male sterility trait was controlled by two pairs of recessive genes in this population. The sterile plants in the BC1 and F2 populations exhibited thermo-sensitive sterility.Compared with the line 373S，the seed-setting rate of male sterile plants slightly decreased，and the male sterile period had no significant difference in the segregated populations. Additionally，there were no significant differences in the corolla diameter，length of four stronger stamens anther，and length of two weaker stamens anther，while a slightly increase was observed in the length of stalk，length of petal，width of petal，length of four stronger stamens and length of two weaker stamens in the segregated populations. Cytological observation revealed abnormal? microspores at pollen mother cell stage in male sterile plants in the segregated populations in terms of anther development stage，chromosome morphology and callose deposition，with no differences compared with the line 373S. These findings suggest that the TGMS gene（s） in the line 373S is successfully introduced from pol? to cam cytoplasm，and the TGMS trait of 373S is caused by the TGMS gene（s） in the nucleus，independent of the cytoplasmic background.

Key words Brassica napus；Thermo-sensitive sterility gene；Cytoplasmic types；Male sterile