廖子龍，向國強(qiáng)，陳繪迦

作者單位：恩施土家族苗族自治州中心醫(yī)院血液病科，湖北 恩施445000

彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤（DLBCL）是一種在遺傳發(fā)現(xiàn)、治療反應(yīng)和臨床預(yù)后方面具有高度異質(zhì)性的腫瘤［1］。盡管治療策略的進(jìn)步，如脂質(zhì)體多柔比星和利妥昔單抗，大大提高了DLBCL的治療效果，但總體5年生存率仍較低［2］。因此，進(jìn)一步研究與DLBCL發(fā)病機(jī)制有關(guān)的治療靶點(diǎn)可能會(huì)為DLBCL的有效治療提供更多的機(jī)會(huì)。大量證據(jù)顯示，長鏈非編碼RNA（lncRNA）失調(diào)與腫瘤的進(jìn)展密切相關(guān)［3］。人類白細(xì)胞抗原復(fù)合體18（HCG18）是一種新發(fā)現(xiàn)的lncRNA，已有研究發(fā)現(xiàn)，HCG18在胃癌、咽喉癌中高表達(dá)，且可促進(jìn)腫瘤的進(jìn)展［4-5］。而HCG18對(duì)DLBCL細(xì)胞惡性生物學(xué)行為的影響尚不清楚。此外，lncRNA可以充當(dāng)ceRNA通過海綿化miRNA來調(diào)節(jié)基因表達(dá)，進(jìn)而在許多疾病中發(fā)揮關(guān)鍵作用［6］。生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)HCG18與微小RNA-497-5p（miR-497-5p）、miR-497-5p與細(xì)胞周期蛋白E1（cyclin E1，CCNE1）存在結(jié)合位點(diǎn)。相關(guān)研究顯示，過表達(dá)miR-497-5p可抑制胰腺癌細(xì)胞增殖［7］，CCNE1在DLBCL中發(fā)揮致癌作用［8］。而HCG18能否通過調(diào)控miR-497-5p/CCNE1軸影響DLBCL惡性進(jìn)展尚不可知。因此，本研究擬從細(xì)胞水平上探究HCG18對(duì)DLBCL細(xì)胞行為的影響以及對(duì)應(yīng)的分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 臨床樣本及細(xì)胞 以2018年5月至2021年5月恩施土家族苗族自治州中心醫(yī)院收集的23例DLBCL病人淋巴組織以及同期本院收治的23例良性淋巴結(jié)增生病人的淋巴組織為研究對(duì)象。病人或其近親屬已知情同意，本實(shí)驗(yàn)符合《世界醫(yī)學(xué)協(xié)會(huì)赫爾辛基宣言》要求。

人正常B細(xì)胞永生化細(xì)胞HMy2.CIR、DLBCL細(xì)胞系SU-DHL-1、OCI-LY8、U2932均購自上海烜雅生物公司。

1.2 主要試劑 CCK-8試劑盒購自杭州昊鑫生物公司（貨號(hào)HY-K0301），Annexin V-FITC細(xì)胞凋亡試劑盒購自沈陽萬類生物公司（貨號(hào)WLA001），兔源一抗CCNE1、甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）、Bcl-2相關(guān)X蛋白（Bax）、增殖細(xì)胞核抗原（PCNA）、基質(zhì)金屬蛋白酶9（MMP-9）及羊抗兔IgG二抗均購自英國Abcam公司（貨號(hào)ab33911、ab32503、ab29、ab8245、ab76003、ab6721）。

1.3 實(shí)驗(yàn)分組 將HMy2.CIR、OCI-LY8、SU-DHL-1、U2932細(xì)胞在RPMI 1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)。取對(duì)數(shù)生長期的OCI-LY8細(xì)胞，分別將過表達(dá)物陰性對(duì)照（pcDNA）、HCG18過表達(dá)物（pcDNA-HCG18）、小干擾RNA陰性對(duì)照（si-NC）、HCG18小干擾RNA（si-HCG18）、si-HCG18和抑制物陰性對(duì)照（inhibitorNC）、si-HCG18和miR-497-5p 抑制物（miR-497-5p inhibitor）轉(zhuǎn)染于OCI-LY8細(xì)胞，并分組為pcDNA組、pcDNA-HCG18組、si-NC組、si-HCG18組、si-HCG18+inhibitorNC組、si-HCG18+miR-497-5p inhibitor組。另取正常培養(yǎng)的OCI-LY8細(xì)胞作為Ct組。轉(zhuǎn)染48 h后收集各組細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.4 qRT-PCR檢測HCG18、miR-497-5p表達(dá)TRIzol試劑提取總RNA，總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA后進(jìn)行PCR反應(yīng)。通過2-ΔΔCt法分別以GAPDH、U6為內(nèi)參計(jì)算HCG18、miR-497-5p相對(duì)表達(dá)量。引物為GAPDH正向5＇-AAAGGGTCATCATCTCTG-3＇，反向5＇-GCTGTTGTCATACTTCTC-3＇，HCG18正向5＇-GCTAGGTCCTCTACTTTCTG-3＇，反向5＇-CAGAAAGTAGAGGACCTAGC-3＇，miR-497-5p正向5'-CCTTCA GCAGCACACTGTGG-3'，反向5'-CAGTGCAGGGTC CGAGGTAT-3'，U6正向5'-CTCGCTTCGGCAGCACA-3'，反向5'-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3'。

1.5 細(xì)胞增殖的檢測 將細(xì)胞接種在96孔板（1×104個(gè)/孔）中，并在37 ℃、5%二氧化碳下培養(yǎng)48 h。然后，去除上清液，使用無血清新鮮培養(yǎng)基以10∶1的比例稀釋CCK-8溶液。各孔加入100 μL CCK-8溶液孵育1 h后測量450 nm處的吸光度［D（λ）450nm］。

1.6 細(xì)胞凋亡的檢測 調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度至7×104個(gè)/毫升。然后用500 μL結(jié)合緩沖液、5 μL Annexin-V-FITC和5 μL PI重懸細(xì)胞。在4 ℃下避光孵育15 min，觀察細(xì)胞凋亡。

1.7 細(xì)胞侵襲的檢測 將細(xì)胞稀釋至2×105個(gè)/毫升并懸浮到預(yù)涂有基質(zhì)膠的上室中，再向下室加入含12%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基。孵育24 h后，用多聚甲醛固定、0.1%結(jié)晶紫染色侵襲的細(xì)胞，觀察并統(tǒng)計(jì)細(xì)胞侵襲數(shù)。

1.8 PCNA、CCNE1、Bax、MMP-9蛋白的檢測RIPA緩沖液提取蛋白。取30 μg蛋白經(jīng)定量、電泳、轉(zhuǎn)模、封閉處理后，將膜在4 ℃下與一抗PCNA（1∶5 000）、CCNE1（1∶4 000）、Bax（1∶2 000）、GAPDH（1∶5 000）、MMP-9（1∶2 000）過夜孵育，再與二抗（1∶5 000）孵育1.5 h。加入ECL觀察蛋白印跡，Image J軟件統(tǒng)計(jì)蛋白表達(dá)情況。

1.9 靶向關(guān)系驗(yàn)證 分別構(gòu)建HCG18、CCNE1野生型質(zhì)粒和突變型質(zhì)粒，并命名為HCG18-WT、CCNE1-WT、HCG18-MUT、CCNE1-MUT，將HCG18-MUT、HCG18-WT、CCNE1-MUT、CCNE1-WT分別與miR-497-5pmimic或mimic NC共轉(zhuǎn)染于OCI-LY8細(xì)胞，48 h后，評(píng)估螢光素酶活性變化。

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 SPSS 29.0軟件用于統(tǒng)計(jì)分析，以表示數(shù)據(jù)。獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)用于兩組間比較，單因素方差分析及事后SNK-q檢驗(yàn)用于多組間的比較，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 HCG18、miR-497-5p表達(dá)及CCNE1蛋白表達(dá)比較 與良性淋巴結(jié)增生病人淋巴組織比較，DLBCL淋巴組織中HCG18、CCNE1蛋白表達(dá)升高，miR-497-5p表達(dá)降低（P＜0.05），見圖1，表1。與HMy2.CIR細(xì)胞相比，SU-DHL-1、OCI-LY8、U2932細(xì)胞中HCG18表達(dá)及CCNE1蛋白表達(dá)上調(diào)，miR-497-5p表達(dá)下調(diào)，且HCG18表達(dá)及CCNE1蛋白表達(dá)量最高，以及miR-497-5p表達(dá)量最低的細(xì)胞是OCI-LY8細(xì)胞，因此，選取OCI-LY8細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)，見圖2，表2。

表1 HCG18、miR-497-5p、CCNE1蛋白在淋巴組織中的表達(dá)/

表1 HCG18、miR-497-5p、CCNE1蛋白在淋巴組織中的表達(dá)/

注：DLBCL為彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤，HCG18為人類白細(xì)胞抗原復(fù)合體18，miR-497-5p為微RNA-497-5p，CCNE1為細(xì)胞周期蛋白E1，GAPDH為甘油醛-3-磷酸脫氫酶。

CCNE1/GAPDH 0.23±0.02 1.45±0.14組別良性淋巴結(jié)增生病人淋巴組織DLBCL淋巴組織例數(shù)23 23 HCG18 1.00±0.00 2.36±0.15 miR-497-5p 1.00±0.00 0.18±0.02 41.37＜0.001 t值P值43.48＜0.001 196.63＜0.001

表2 HCG18、miR-497-5p、CCNE1蛋白在OCI-LY8細(xì)胞中的表達(dá)/

表2 HCG18、miR-497-5p、CCNE1蛋白在OCI-LY8細(xì)胞中的表達(dá)/

注：HCG18為人類白細(xì)胞抗原復(fù)合體18，miR-497-5p為微RNA-497-5p，CCNE1為細(xì)胞周期蛋白E1，GAPDH為甘油醛-3-磷酸脫氫酶。①與HMy2.CIR細(xì)胞比較，P＜0.05。

CCNE1/GAPDH 0.29±0.02 1.42±0.13①1.08±0.09①0.87±0.07①178.20＜0.001組別HMy2.CIR細(xì)胞OCI-LY8細(xì)胞SU-DHL-1細(xì)胞U2932細(xì)胞F值P值例數(shù)6 6 6 6 HCG18 1.00±0.00 2.66±0.24①2.01±0.14①1.72±0.09①133.30＜0.001 miR-497-5p 1.00±0.00 0.17±0.01①0.39±0.02①0.56±0.05①989.30＜0.001

圖1 蛋白質(zhì)印跡法檢測淋巴組織中CCNE1蛋白表達(dá)

圖2 蛋白質(zhì)印跡法檢測OCI-LY8細(xì)胞中CCNE1蛋白表達(dá)

2.2 HCG18、miR-497-5p、CCNE1蛋白在OCI-LY8細(xì)胞中的表達(dá) 與Ct組和pcDNA組對(duì)比，pcDNAHCG18組HCG18表達(dá)及CCNE1蛋白表達(dá)上調(diào)，miR-497-5p表達(dá)下調(diào)（P＜0.05），與si-NC組、Ct組相比，si-HCG18組HCG18、CCNE1蛋白表達(dá)下調(diào)，miR-497-5p表達(dá)上調(diào)（P＜0.05），與si-HCG18+inhibitor NC組、si-HCG18組相比，si-HCG18+miR-497-5p inhibitor組miR-497-5p表達(dá)下調(diào)，CCNE1蛋白表達(dá)上調(diào)（P＜0.05），見圖3，表3。

表3 HCG18、miR-497-5p、CCNE1蛋白在OCI-LY8細(xì)胞中的表達(dá)/

表3 HCG18、miR-497-5p、CCNE1蛋白在OCI-LY8細(xì)胞中的表達(dá)/

注：HCG18為人類白細(xì)胞抗原復(fù)合體18，miR-497-5p為微RNA-497-5p，CCNE1為細(xì)胞周期蛋白E1，GAPDH為甘油醛-3-磷酸脫氫酶，Ct為對(duì)照，pcDNA為過表達(dá)物陰性對(duì)照，pcDNA-HCG18為HCG18過表達(dá)物，si-NC為小干擾RNA陰性對(duì)照，si-HCG18為HCG18小干擾RNA，inhibitorNC為抑制物陰性對(duì)照，miR-497-5p inhibitor為miR-497-5p 抑制物。①與Ct組對(duì)比，P＜0.05。②與pcDNA組對(duì)比，P＜0.05。③與si-NC組對(duì)比，P＜0.05。④與si-HCG18組對(duì)比，P＜0.05。⑤與si-HCG18+inhibitorNC組對(duì)比，P＜0.05。

2.33±0.21①②1.44±0.19 0.45±0.03①③0.44±0.04 0.87±0.08④⑤127.80＜0.001 pcDNA-HCG18組si-NC組si-HCG18組si-HCG18+inhibitorNC組si-HCG18+miR-497-5p inhibitor組F值P值6 6 6 6 6 1.96±0.23①②1.01±0.01 0.26±0.03①③0.25±0.02 0.26±0.03 298.80＜0.001 0.28±0.02①②1.03±0.02 1.95±0.14①③1.94±0.13 1.21±0.09④⑤314.50＜0.001

圖3 蛋白質(zhì)印跡法檢測OCI-LY8細(xì)胞中CCNE1蛋白表達(dá)

2.3 過表達(dá)或沉默HCG18對(duì)OCI-LY8細(xì)胞增殖的影響 與Ct組和pcDNA組對(duì)比，pcDNA-HCG18組OCI-LY8細(xì)胞D（λ）450nm值升高（P＜0.05），與Ct組、si-NC組比較，si-HCG18組OCI-LY8細(xì)胞D（λ）450nm值降低（P＜0.05），與si-HCG18組、si-HCG18+inhibitor NC組比較，si-HCG18+miR-497-5p inhibitor組OCILY8細(xì)胞D（λ）450nm值升高（P＜0.05），見表4。

表4 各組OCI-LY8細(xì)胞增殖、凋亡、侵襲情況比較/

表4 各組OCI-LY8細(xì)胞增殖、凋亡、侵襲情況比較/

注：D（λ）450 nm為OCI-LY8細(xì)胞450 nm處吸光度，Ct為對(duì)照，pcDNA為過表達(dá)物陰性對(duì)照，pcDNA-HCG18為HCG18過表達(dá)物，si-NC為小干擾RNA陰性對(duì)照，si-HCG18為HCG18小干擾RNA，inhibitorNC為抑制物陰性對(duì)照，miR-497-5p inhibitor為miR-497-5p 抑制物。①與Ct組對(duì)比，P＜0.05。②與pcDNA組對(duì)比，P＜0.05。③與si-NC組對(duì)比，P＜0.05。④與si-HCG18組對(duì)比，P＜0.05。⑤與si-HCG18+inhibitorNC組對(duì)比，P＜0.05。

侵襲細(xì)胞數(shù)目/個(gè)68.85±5.67 70.23±5.62 115.58±8.42①②69.63±5.72 28.31±2.44①③27.31±2.35 46.65±3.22④⑤207.56＜0.001分組Ct組pcDNA組pcDNA-HCG18組si-NC組si-HCG18組si-HCG18+inhibitorNC組si-HCG18+miR-497-5p inhibitor組F值P值例數(shù)6 6 6 6 6 6 6 D（λ）450 nm值1.06±0.12 1.08±0.11 1.98±0.15①②1.07±0.10 0.36±0.04①③0.34±0.03 0.79±0.07④⑤195.00＜0.001細(xì)胞凋亡率/%18.38±1.62 18.46±1.56 9.45±0.28①②18.56±1.66 43.67±3.25①③44.18±3.37 25.58±2.24④⑤44.91＜0.001

2.4 過表達(dá)或沉默HCG18對(duì)OCI-LY8細(xì)胞凋亡的影響 與Ct組、pcDNA組比較，pcDNA-HCG18組OCI-LY8細(xì)胞凋亡率降低（P＜0.05），與Ct組、si-NC組比較，si-HCG18組OCI-LY8細(xì)胞凋亡率上升（P＜0.05），與si-HCG18+inhibitor NC組、si-HCG18組相比，si-HCG18+miR-497-5p inhibitor組OCI-LY8細(xì)胞凋亡率下降（P＜0.05），見圖4，表4。

圖4 流式細(xì)胞術(shù)檢測OCI-LY8細(xì)胞凋亡

2.5 過表達(dá)或沉默HCG18影響OCI-LY8細(xì)胞侵襲與pcDNA組、Ct組相比，pcDNA-HCG18組OCI-LY8細(xì)胞侵襲數(shù)目升高（P＜0.05），與Ct組、si-NC組比較，si-HCG18組OCI-LY8細(xì)胞侵襲數(shù)目降低（P＜0.05），與si-HCG18組、si-HCG18+inhibitor NC組比較，si-HCG18+miR-497-5p inhibitor組OCI-LY8細(xì)胞侵襲數(shù)目升高（P＜0.05），見圖5，表4。

圖5 Transwell實(shí)驗(yàn)檢測OCI-LY8細(xì)胞侵襲（結(jié)晶紫染色×200）

2.6 過表達(dá)或沉默HCG18影響OCI-LY8細(xì)胞中蛋白表達(dá) 與Ct組和pcDNA組對(duì)比，pcDNAHCG18組OCI-LY8細(xì)胞中PCNA、MMP-9蛋白表達(dá)升高，Bax蛋白表達(dá)降低（P＜0.05），與Ct組和si-NC組對(duì)比，si-HCG18組PCNA和MMP-9蛋白表達(dá)下調(diào)，Bax蛋白表達(dá)上調(diào)（P＜0.05），與si-HCG18組、si-HCG18+inhibitor NC組比較，si-HCG18+miR-497-5p inhibitor組PCNA和MMP-9蛋白表達(dá)上調(diào)，Bax蛋白表達(dá)下調(diào)（P＜0.05），見圖6，表5。

表5 各組OCI-LY8細(xì)胞中PCNA、Bax、MMP-9蛋白表達(dá)比較/

表5 各組OCI-LY8細(xì)胞中PCNA、Bax、MMP-9蛋白表達(dá)比較/

注：Bax為Bcl-2相關(guān)X蛋白，PCNA為增殖細(xì)胞核抗原，MMP-9為基質(zhì)金屬蛋白酶9，GAPDH為甘油醛-3-磷酸脫氫酶，Ct為對(duì)照，pcDNA為過表達(dá)物陰性對(duì)照，pcDNA-HCG18為HCG18過表達(dá)物，si-NC為小干擾RNA陰性對(duì)照，si-HCG18為HCG18小干擾RNA，inhibitorNC為抑制物陰性對(duì)照，miR-497-5p inhibitor為miR-497-5p抑制物。①與Ct組對(duì)比，P＜0.05。②與pcDNA組對(duì)比，P＜0.05。③與si-NC組對(duì)比，P＜0.05。④與si-HCG18組對(duì)比，P＜0.05。⑤與si-HCG18+inhibitorNC組對(duì)比，P＜0.05。

PCNA/GAPDH 0.71±0.07 0.72±0.06 1.39±0.13①②0.73±0.06 0.22±0.03①③0.23±0.02 Bax/GAPDH 0.35±0.02 0.36±0.03 0.17±0.01①②0.34±0.03 0.94±0.09①③0.95±0.08 MMP-9/GAPDH 0.92±0.07 0.93±0.08 1.72±0.16①②0.94±0.06 0.31±0.02①③0.32±0.03 0.71±0.07④⑤204.90＜0.001分組Ct組pcDNA組pcDNA-HCG18組si-NC組si-HCG18組si-HCG18+inhibitor NC組si-HCG18+miR-497-5p inhibitor組F值P值例數(shù)6 6 6 6 6 6 6 0.54±0.05④⑤199.73＜0.001 0.57±0.05④⑤207.81＜0.001

圖6 蛋白質(zhì)印跡法檢測OCI-LY8細(xì)胞中PCNA、Bax、MMP-9蛋白表達(dá)

2.7 HCG18靶向調(diào)控miR-497-5p/CCNE1軸lncRNA HCG18與miR-497-5p、miR-497-5p與CCNE1存在結(jié)合位點(diǎn)，見圖7。miR-497-5p mimic和HCG18-WT共轉(zhuǎn)染組的螢光素酶活性低于mimic NC和HCG18-WT共轉(zhuǎn)染組（P＜0.05）。miR-497-5p mimic和CCNE1-WT共轉(zhuǎn)染組的螢光素酶活性低于mimic NC和CCNE1-WT共轉(zhuǎn)染組（P＜0.05），見表6。

表6 各組螢光素酶活性比較/

表6 各組螢光素酶活性比較/

注：mimic NC為模擬物陰性對(duì)照，miR-497-5p mimic為微RNA-497-5p模擬物，HCG18-WT為人類白細(xì)胞抗原復(fù)合體18野生型質(zhì)粒，HCG18-MUT為人類白細(xì)胞抗原復(fù)合體18突變型質(zhì)粒，CCNE1-WT為細(xì)胞周期蛋白E1野生型質(zhì)粒，CCNE1-MUT為細(xì)胞周期蛋白E1突變型質(zhì)粒。

CCNE1-MUT 1.01±0.13 1.00±0.11 0.14 0.888組別mimic NC組miR-497-5p mimic組t值P值例數(shù)6 6 HCG18-WT 1.02±0.10 0.26±0.02 18.26＜0.001 HCG18-MUT 1.03±0.14 1.05±0.16 0.23 0.822 CCNE1-WT 1.06±0.17 0.22±0.03 11.92＜0.001

圖7 長鏈非編碼RNA人類白細(xì)胞抗原復(fù)合體18（lncRNA HCG18）與微RNA-497-5p（miR-497-5p）、miR-497-5p與細(xì)胞周期蛋白E1（CCNE1）的結(jié)合位點(diǎn)圖

3 討論

最近，越來越多的研究開始關(guān)注一系列在DLBCL進(jìn)展中發(fā)揮基本生物學(xué)作用的lncRNA。如lnc SMAD5-AS1過表達(dá)可以通過海綿化miR-135b-5p上調(diào)APC表達(dá)來抑制體外和體內(nèi)DLBCL增殖［9］，lncRNA FIRRE通過促進(jìn)DLBCL中的細(xì)胞增殖和減少細(xì)胞凋亡而發(fā)揮癌基因的作用［10］。此外，各種研究已將HCG18與腫瘤進(jìn)展聯(lián)系起來。如HCG18在透明細(xì)胞腎細(xì)胞癌組織和細(xì)胞中高表達(dá)，沉默HCG18減弱了透明細(xì)胞腎細(xì)胞癌細(xì)胞活力、遷移和侵襲能力［11］，HCG18可促進(jìn)肺腺癌中的腫瘤生長［12］。這些結(jié)果揭示了HCG18在上述腫瘤中的促癌作用。本研究表明，在DLBCL淋巴組織和DLBCL細(xì)胞中HCG18上調(diào)表達(dá)，并選擇了HCG18上調(diào)表達(dá)最高的OCI-LY8細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。PCNA是一種重要的復(fù)制輔助因子，具有促進(jìn)細(xì)胞增殖的作用［13］，Bax作為一種細(xì)胞凋亡調(diào)節(jié)劑，其缺失會(huì)阻止細(xì)胞快速凋亡［14］，MMP-9被認(rèn)為是腫瘤侵襲過程中細(xì)胞外基質(zhì)蛋白水解降解的主要因素［15］。本研究顯示，過表達(dá)HCG18可促進(jìn)OCI-LY8細(xì)胞中PCNA、MMP-9蛋白表達(dá)及細(xì)胞增殖、侵襲，抑制Bax蛋白表達(dá)及細(xì)胞凋亡，而沉默HCG18則影響效果呈相反趨勢。提示HCG18在DLBCL中具有致癌作用，沉默HCG18可抑制OCI-LY8細(xì)胞增殖、侵襲，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。說明HCG18參與調(diào)控DLBCL細(xì)胞的增殖、凋亡和侵襲。

大量研究證實(shí)，lncRNA可以作為miRNA海綿并調(diào)控靶 miRNA的表達(dá)［16］。本研究通過生物信息學(xué)分析及雙螢光素酶驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)證實(shí)了miR-497-5p可與HCG18靶向結(jié)合。相關(guān)研究表明，過表達(dá)miR-497-5p可抑制肺鱗狀細(xì)胞癌進(jìn)展［17］，下調(diào)miR-497-5p促進(jìn)了肝癌細(xì)胞的增殖、侵襲［18］。本研究發(fā)現(xiàn)，miR-497-5p在DLBCL組織和細(xì)胞中下調(diào)表達(dá)，過表達(dá)HCG18抑制了OCI-LY8細(xì)胞中miR-497-5p表達(dá)，下調(diào)HCG18促進(jìn)了OCI-LY8細(xì)胞中miR-497-5p表達(dá)，猜想沉默HCG18抑制OCI-LY8細(xì)胞增殖、侵襲，促進(jìn)細(xì)胞凋亡可能是通過上調(diào)miR-497-5p表達(dá)來實(shí)現(xiàn)的。為了驗(yàn)證該假設(shè)，本研究在沉默HCG18的同時(shí)再用miR-497-5p inhibitor處理OCI-LY8細(xì)胞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，miR-497-5p inhibitor逆轉(zhuǎn)了沉默HCG18對(duì)OCI-LY8細(xì)胞增殖、侵襲、凋亡的影響。證明了猜想的正確性。間接證實(shí)了HCG18靶向miR-497-5p在DLBCL細(xì)胞的增殖、凋亡、侵襲中發(fā)揮調(diào)節(jié)作用。

miRNA可通過與mRNA的3'UTR互補(bǔ)結(jié)合來降解mRNA或抑制蛋白質(zhì)翻譯［19］。為了進(jìn)一步探究相應(yīng)的分子機(jī)制，本研究通過starbase數(shù)據(jù)庫發(fā)現(xiàn)CCNE1為miR-497-5p的靶基因。據(jù)報(bào)道，過表達(dá)CCNE1與卵巢癌的不良預(yù)后相關(guān)［20］，上調(diào)CCNE1表達(dá)可促進(jìn)結(jié)腸癌細(xì)胞增殖、侵襲［21］。表明CCNE1在上述腫瘤中發(fā)揮著癌基因的作用。本研究顯示，在DLBCL淋巴組織和細(xì)胞中CCNE1蛋白上調(diào)表達(dá)，上調(diào)HCG18抑制了OCI-LY8細(xì)胞中miR-497-5p表達(dá)，促進(jìn)了CCNE1蛋白表達(dá)，而沉默HCG18后則呈相反趨勢，且miR-497-5p與CCNE1存在靶向調(diào)控關(guān)系，證實(shí)了沉默HCG18可能通過上調(diào)miR-497-5p來抑制CCNE1表達(dá)，進(jìn)而抑制OCI-LY8細(xì)胞增殖、侵襲，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。闡明HCG18可通過miR-497-5p/CCNE1軸對(duì)DLBCL細(xì)胞的增殖、凋亡、侵襲起調(diào)節(jié)作用。

綜上所述，沉默HCG18抑制OCI-LY8細(xì)胞增殖、侵襲，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡可能是通過調(diào)控miR-497-5p/CCNE1軸實(shí)現(xiàn)的。該研究可能為DLBCL的治療提供新的靶點(diǎn)。