楊睿，李占江，陳騰飛

作者單位：鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科，河南 鄭州450000

肺癌是世界范圍內(nèi)發(fā)病率最高的惡性腫瘤［1］，其中非小細(xì)胞腺癌是最常見(jiàn)的類(lèi)型，已進(jìn)入個(gè)體化治療時(shí)期［2］。但病人3年總生存率仍然較低。叉頭蛋白轉(zhuǎn)錄因子3（FOXO3），主要參與細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖、分化和轉(zhuǎn)化等過(guò)程［3］。FOXO3基因表達(dá)在癌組織中下調(diào)，常被稱(chēng)為腫瘤抑制器［4］。YTH結(jié)構(gòu)域家族蛋白2（YTHDF2）作為RNA甲基化的閱讀器蛋白，在腫瘤發(fā)展中起到重要作用［5］。但在肺癌中的表達(dá)及其對(duì)肺腺癌的影響目前報(bào)道尚少。因此，本研究主要分析YTHDF2、FOXO3在肺腺癌組織中的表達(dá)，及與病人臨床病理特征和累積生存率的影響，以期為肺腺癌的預(yù)后評(píng)估提供參考。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2020年1月至2021年5月鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院行手術(shù)治療的肺腺癌病人癌組織及對(duì)應(yīng)的癌旁組織（距離癌組織5 cm以上）80對(duì)，其中男52例，女28例。納入標(biāo)準(zhǔn)：原發(fā)性肺腺癌；臨床及病理資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：拒絕參加此次調(diào)查研究者；隨訪(fǎng)時(shí)間少于1個(gè)月者；有精神疾病史病人；其他部位腫瘤及心、腦、肝、腎等嚴(yán)重疾病病人。本研究符合《世界醫(yī)學(xué)協(xié)會(huì)赫爾辛基宣言》相關(guān)要求。

1.2 方法

1.2.1 生物學(xué)分析 采用Ualcan網(wǎng)站，使用其中的癌癥基因組圖譜（TCGA）數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)YTHDF2、FOXO3基因的表達(dá)分析、生存預(yù)后，并進(jìn)行可視化。

1.2.2 免疫組織化學(xué)檢測(cè) 按照常規(guī)取材肺腺癌組織標(biāo)本及癌旁正常組織標(biāo)本，使用免疫組織化學(xué)試劑盒（北京博奧派克生物科技有限公司）進(jìn)行染色，具體操作按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.2.3 免疫組織化學(xué)染色結(jié)果判定 強(qiáng)度評(píng)分：未染色：0分；略染色：1分；明顯染色：2分；深棕色：3分。陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)比例：隨機(jī)觀察不少于5個(gè)視野，計(jì)數(shù)500個(gè)細(xì)胞中染色陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)，陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目＜5%為0分，5%～＜25%為1分，25%～＜50%為2分，≥50%為3分。強(qiáng)度評(píng)分×陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)比例為染色評(píng)分，根據(jù)評(píng)分結(jié)果分為兩組：分?jǐn)?shù)＜4即為低表達(dá)、分?jǐn)?shù)≥4即為高表達(dá)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 22.2軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目為計(jì)數(shù)資料以例（%）表示，采用χ2檢驗(yàn)分析；生存分析采用Kaplan-Meier法，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 YTHDF2及FOXO3在肺腺癌中及癌旁正常組織中的表達(dá)差異 比較TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中515例肺腺癌組織和59例癌旁正常組織中YTHDF2、FOXO3基因的表達(dá)水平，結(jié)果顯示YTHDF2、FOXO3基因在肺腺癌組織和癌旁正常組織中表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（58.39±21.21比49.06±17.36，13.16±4.33比23.24±7.63，t=3.26、15.38，P=0.001、＜0.001）。

2.2 YTHDF2、FOXO在肺腺癌組織及癌旁正常組織中的免疫組化結(jié)果 免疫組化結(jié)果顯示，YTHDF2、FOXO3基因主要定位于細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞核，見(jiàn)圖1。YTHDF2、FOXO3在肺腺癌組織中的高表達(dá)率分別為26.25%（21/80）、18.75%（15/80），明顯低于癌旁正常組織中的82.50%（66/80）、88.75%（71/80）（χ2=51.02、78.84，均P＜0.001）。

圖1 YTHDF2、FOXO3蛋白在肺腺癌組織及癌旁正常組織中的表達(dá)（免疫組織化學(xué)法×100）

2.3 肺腺癌組織中YTHDF2、FOXO3表達(dá)相關(guān)性 GEPIA數(shù)據(jù)庫(kù)中分析顯示，肺腺癌中YTHDF2與FOXO3基因表達(dá)水平的對(duì)數(shù)值呈正相關(guān)性（R=0.36，P＜0.05）。

2.4 肺腺癌組織中YTHDF2、FOXO3蛋白表達(dá)情況與病人臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系 YTHDF2蛋白表達(dá)情況與肺腺癌病人年齡、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和分化程度相關(guān)（P＜0.05）；與TNM分期、性別無(wú)關(guān)（P＞0.05）；FOXO3蛋白表達(dá)情況與肺腺癌病人性別和分化程度相關(guān)（P＜0.05）；與TNM分期、年齡、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無(wú)關(guān)（P＞0.05）。見(jiàn)表1。

表1 YTHDF2、FOXO3蛋白與肺腺癌臨床病理特征的關(guān)系/例（%）

2.5 肺腺癌組織中YTHDF2、FOXO3蛋白表達(dá)情況與肺腺癌病人3年生存情況的關(guān)系 病例隨訪(fǎng)的方式：采用電話(huà)或信件隨訪(fǎng)，隨訪(fǎng)時(shí)間從出院至最近一次隨訪(fǎng)，隨訪(fǎng)期限為3年。肺腺癌組織中YTHDF2蛋白高表達(dá)組和低表達(dá)組病人3年累積生存率分別為53.30%、14.00%，經(jīng)Log-Rank比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=24.60，P＜0.001）；FOXO3蛋白高表達(dá)組和低表達(dá)組病人3年累積生存率分別為64.50%、12.20%，經(jīng)Log-Rank比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=18.20，P＜0.001）。

3 討論

肺癌已經(jīng)逐漸成為全球癌癥死亡的主要原因［6］。其中有87%被歸類(lèi)為非小細(xì)胞肺癌，而肺腺癌和肺鱗狀細(xì)胞癌是主要的病理類(lèi)型［7］。FOXO3是一種“腫瘤抑制因子”［8］，也是四種相關(guān)的FOXO轉(zhuǎn)錄因子之一，可保護(hù)細(xì)胞免受各種生理應(yīng)激的影響［9］。FOXO3已被證明在DNA修復(fù)，生長(zhǎng)停滯和細(xì)胞凋亡中具有重要作用［10］。研究表明FOXO3能夠激活促凋亡轉(zhuǎn)錄程序，并且可促進(jìn)人類(lèi)肺癌致癌物產(chǎn)生炎癥反應(yīng)［11］。FOXO3定位于6號(hào)染色體，編碼673個(gè)氨基酸［12］。FOXO3在蛋白質(zhì)中的水平受到絲氨酸/蘇氨酸激酶（Akt）的影響。Akt能夠促進(jìn)特定殘基上磷酸化FOXO3，并導(dǎo)致其胞質(zhì)滯留和轉(zhuǎn)錄失活，同時(shí)Akt可被磷脂酰肌醇3-激酶信號(hào)激活［13］。FOXO3可以通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、遷移及血管生成參與癌癥的發(fā)生。研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)OXO3還參與許多化療藥物（吉非替尼等）的作用機(jī)制［14］。另有研究顯示敲除FOXO3基因會(huì)促使腫瘤的發(fā)生，從而發(fā)現(xiàn)FOXO3作為抑癌基因發(fā)揮作用［15］。然而，其他研究報(bào)道FOXO3在腫瘤發(fā)生中起相反的作用，可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移。例如，有研究表明FOXO3既能抑制也能促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的進(jìn)展，且調(diào)節(jié)FOXO3活性對(duì)于腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移至關(guān)重要［16］。

YTHDF2能夠識(shí)別和削弱mRNA穩(wěn)定性［17］。最新的報(bào)告稱(chēng)YTHDF2是能夠降解兩種腫瘤啟動(dòng)子并且能夠抑制腫瘤基因表達(dá)，增強(qiáng)干細(xì)胞自我更新能力［18］。癌細(xì)胞的代謝特征對(duì)于適應(yīng)腫瘤微環(huán)境內(nèi)的變化至關(guān)重要，通常有助于表觀遺傳可塑性［19］。Shen等［20］研究報(bào)道，YTHDF2在胃癌組織及細(xì)胞中均為低表達(dá)，其表達(dá)水平與胃癌分期及病人的生存期密切相關(guān)，可作為胃癌的預(yù)后標(biāo)志物。另王月帆等［21］研究發(fā)現(xiàn)，肝癌組織中YTHDF2高表達(dá)，且YTHDF2高表達(dá)病人具有更低的總體生存率和無(wú)復(fù)發(fā)生存率，YTHDF2可作為判斷肝癌病人預(yù)后的分子標(biāo)志物。但YTHDF2、FOXO3蛋白在肺腺癌中的作用尚不明確，因此本研究分析肺腺癌組織和癌旁正常組織中YTHDF2、FOXO3蛋白的表達(dá)變化。

本研究免疫組化結(jié)果發(fā)現(xiàn)，肺腺癌組織中YTHDF2、FOXO3蛋白高表達(dá)率均較癌旁正常組織低，F(xiàn)OXO3蛋白表達(dá)與TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中FOXO3基因表達(dá)的結(jié)果一致，而YTHDF2蛋白表達(dá)與TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中YTHDF2基因表達(dá)的結(jié)果不一致，考慮可能與本研究納入樣本量與TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中的樣本量相差較大有關(guān)，需擴(kuò)大樣本進(jìn)行驗(yàn)證。另外，GEPIA數(shù)據(jù)庫(kù)中分析發(fā)現(xiàn)，肺腺癌中YTHDF2與FOXO3基因表達(dá)水平的對(duì)數(shù)值呈正相關(guān)。上述結(jié)果提示YTHDF2、FOXO3表達(dá)異常與肺腺癌的發(fā)生密切相關(guān)，F(xiàn)OXO3可能通過(guò)抑制轉(zhuǎn)錄因子的激活，從而降低相關(guān)基因的表達(dá)，抑制癌細(xì)胞的增殖。分析原因可能為YTHDF2、FOXO3蛋白具有DNA結(jié)合、轉(zhuǎn)錄活化和轉(zhuǎn)錄抑制等功能，與增生、分化、血管再生和侵襲等病理生理關(guān)系密切，是重要的細(xì)胞調(diào)控因子。本研究還發(fā)現(xiàn)，YTHDF2蛋白表達(dá)與肺腺癌病人年齡、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和分化程度相關(guān)，而FOXO3蛋白表達(dá)與肺腺癌病人性別、分化程度相關(guān)，提示YTHDF2、FOXO3表達(dá)受多種因素影響，可能在肺腺癌病情進(jìn)展中發(fā)揮作用。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，YTHDF2蛋白、FOXO3蛋白低表達(dá)組病人具有更低的3年累積生存率，提示YTHDF2、FOXO3異常低表達(dá)病人可能更易發(fā)生預(yù)后不良，對(duì)于此類(lèi)病人，應(yīng)及時(shí)采取措施干預(yù)，以提高病人的3年累積生存率，并改善生存質(zhì)量。

綜上所述，YTHDF2、FOXO3在肺腺癌組織中均呈低表達(dá)，與病人腫瘤分化程度和3年累積生存率有關(guān)，可作為評(píng)估預(yù)后的潛在標(biāo)志物。但是本研究樣本量較少，可能存在一定的偏倚，后續(xù)還須擴(kuò)大樣本繼續(xù)研究。