張倩，俱京濤，張雅瓊，張春謙

作者單位：1滄州市人民醫(yī)院核磁共振室，河北 滄州061000；2北京中醫(yī)藥大學(xué)房山醫(yī)院，北京 102400；3石家莊市第三醫(yī)院放射科，河北 石家莊050000；4滄州市中心醫(yī)院CT室，河北 滄州061000

乳腺癌是臨床常見(jiàn)惡性腫瘤類型之一，具有高發(fā)病率、病死率等特征［1］。目前有關(guān)乳腺癌發(fā)病機(jī)制尚未十分明確，且早期多無(wú)特異性臨床表現(xiàn)，故常需與乳腺囊腫、炎癥等良性疾病鑒別診斷。血循環(huán)腫瘤細(xì)胞（CTCs）主要來(lái)源于轉(zhuǎn)移或原發(fā)腫瘤，能有效反映腫瘤侵襲與轉(zhuǎn)移［2］。循環(huán)游離DNA（cfDNA）是循環(huán)血中游離在細(xì)胞外的高度片段化DNA，在肺癌、食管癌等多種疾病診斷中的價(jià)值現(xiàn)已被證實(shí)［3］。目前乳腺癌影像學(xué)研究逐漸深入到分子生物學(xué)層面，采用影像學(xué)聯(lián)合細(xì)胞因子進(jìn)行診斷已成為可能。磁共振動(dòng)態(tài)增強(qiáng)（DCE-MRI）是MRI掃描序列之一，可觀察病變血流動(dòng)力學(xué)特征，同時(shí)其定量參數(shù)能反映造影劑在腫瘤內(nèi)的動(dòng)態(tài)分布情況，對(duì)提高疾病診斷準(zhǔn)確性意義重大［4］。但目前有關(guān)DCE-MRI結(jié)合CTCs、cfDNA診斷乳腺癌的報(bào)道少見(jiàn)。鑒于此，本研究就DCE-MRI結(jié)合CTCs、cfDNA對(duì)乳腺癌的診斷價(jià)值進(jìn)行了探討，以期為臨床治療該病提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集滄州市人民醫(yī)院2020年6月至2021年11月收治的乳腺癌病人的臨床資料。納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）均經(jīng)術(shù)后穿刺病理活檢確診為腫塊型乳腺癌；（2）無(wú)MRI檢查禁忌證；（3）影像學(xué)圖像清晰，不影響診斷；（4）實(shí)驗(yàn)室、影像學(xué)及病理等資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）存在自身免疫疾病或全身感染性疾病；（2）孕婦、交流障礙、意識(shí)障礙等特殊人群；（3）進(jìn)行化療、放療等治療者；（4）循環(huán)功能嚴(yán)重障礙、肝腎功能嚴(yán)重?fù)p傷者；（5）非腫塊型或直徑較小無(wú)法進(jìn)行病灶常規(guī)測(cè)量者。根據(jù)公式：N=Z2×σ2/d2，置信區(qū)間95%，抽樣誤差10%，標(biāo)準(zhǔn)差取值0.5，得到預(yù)計(jì)樣本量96例，根據(jù)納入及排除標(biāo)準(zhǔn)，最終82例乳腺癌病人納入本次研究。將82例乳腺癌病人納入乳腺癌組，病人均為女性，病人年齡范圍為26～67歲，年齡（44.42±6.17）歲。臨床分期：Ⅰ～Ⅱ期28例，Ⅲ～Ⅳ期54例，58例伴淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。

另選取同期符合納入、排除標(biāo)準(zhǔn)的乳腺良性病變病人65例作為良性組。良性組納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）影像學(xué)圖像資料完整；（2）未合并其他疾??；（3）經(jīng)過(guò)病理學(xué)活檢證實(shí)；排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）未進(jìn)行CTCs、cfDNA檢測(cè)者；（2）既往行乳腺手術(shù)史者；（3）非妊娠期、哺乳期女性。乳腺良性病變病人作為良性組，病人年齡范圍26～68歲，年齡（45.18±7.05）歲。兩組資料比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。本研究符合《世界醫(yī)學(xué)協(xié)會(huì)赫爾辛基宣言》相關(guān)要求。

1.2 方法

1.2.1 MRI檢查 MRI平掃：3.0 T飛利浦磁共振掃描儀，乳腺聯(lián)合線圈，行軸位快速自旋回波T1WI、T2WI及冠狀自旋回波脂肪飽和T2WI序列掃描。②DWI掃描參數(shù)：重復(fù)時(shí)間（TR）9 145 ms，回波時(shí)間（TE）79 ms，層厚、間距分別為3.5 mm、0 mm。b值=0、800 s/mm2。③增強(qiáng)掃描：對(duì)比劑為Gd-DTPA 0.2 mmol/kg，注射速率2 mL/s，隨后快速推注20 mL 0.9%氯化鈉溶液，隨后行動(dòng)態(tài)增強(qiáng)掃描，注入對(duì)比劑同時(shí)立即開始eTHRIVE掃描，參數(shù)：TR 4.3 ms，TE 2.1 ms，層厚1.5 mm，矩陣280×339，F(xiàn)OV 280 mm×340 mm。共9期，每期74 s。掃描結(jié)束后利用相應(yīng)MRI工作站進(jìn)行圖像處理，并選擇病變最佳層面，將興趣區(qū)（ROI）置于病變實(shí)質(zhì)區(qū)域（ROI面積根據(jù)病變實(shí)質(zhì)區(qū)域面積而定），避開鈣化、血管、壞死組織，每例至少重復(fù)測(cè)量3次，取平均值，由同一技師進(jìn)行上述操作。定量參數(shù)包括速度常數(shù)（Ktrans）值、速率常數(shù)（Kep）值及血管外細(xì)胞外容積分?jǐn)?shù)（Ve）。

1.2.2 CTCs、cfDNA檢測(cè) 空腹抽取兩組病人晨起靜脈血5 mL，離心（3 500 r/min，離心半徑15 cm，5 min），分離上層血漿，低溫保存用于cfDNA提取檢測(cè)。采用qPCR檢測(cè)外周血cfDNA，提取血漿中DNA，基于實(shí)驗(yàn)室前期建立的Alu序列RTFQ PCR檢測(cè)cfDNA的方法進(jìn)行檢測(cè)：針對(duì)Alu115、247序列的引物：（5'-3'）Alu115正向CCTGAGGTCAGGAGTT CGAG，反向CCCGAGTAGCTGGGATTACA；Alu 247正向GTGGCTCACGCCTGTAATC，反向CAGGCTGGAGTGCAGTGG。按說(shuō)明書進(jìn)行配置成10 μmol/mL溶液，置于低溫保存。PCR循環(huán)參數(shù)：95 ℃ 10 min，95 ℃ 15 S，60 ℃ 60 s，共35個(gè)循環(huán)。完成擴(kuò)增后，對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，并取3次結(jié)果均值作為1次檢測(cè)結(jié)果。以長(zhǎng)、短片段（115 bp、247 bp）擴(kuò)增產(chǎn)物比值作為cfDNA完整性指標(biāo)。

CTCs采用Cell Search系統(tǒng)檢測(cè)，取7.5 mL血漿樣本與6.5 mL緩沖液置于Autoprep錐形管中，離心10 min后，取上清液，置入Autoprep系統(tǒng)中檢測(cè)。將每7.5毫升外周血中檢出至少1個(gè)CTCs定義為CTCs表達(dá)陽(yáng)性。

1.3 觀察指標(biāo) 比較兩組DCE-MRI定量參數(shù)、CTCs、cfDNA水平，并對(duì)比MRI一般特征，包括邊緣情況、形態(tài)、強(qiáng)化、TIC分型及早期增強(qiáng)率。分析上述因子與乳腺癌臨床特征的關(guān)系及DCE-MRI結(jié)合CTCs、cfDNA診斷價(jià)值。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 22.0軟件分析本組數(shù)據(jù)，各組DCE-MRI定量參數(shù)、CTCs、cfDNA水平均以描述，行t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以例（%）表示，采用χ2檢驗(yàn)；診斷價(jià)值采用ROC曲線分析，ACU值顯著性檢驗(yàn)采用Z檢驗(yàn)；P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組DCE-MRI定量參數(shù)及CTCs、cfDNA比較 乳腺癌組DCE-MRI定量參數(shù)Ktrans、Kep及Alu247/115水平明顯高于良性組，CTCs計(jì)數(shù)多于良性組（P＜0.05）。見(jiàn)表1。

表1 乳腺癌82例及乳腺良性病變65例磁共振動(dòng)態(tài)增強(qiáng)（DCE-MRI）定量參數(shù)及CTCs、cfDNA比較/

表1 乳腺癌82例及乳腺良性病變65例磁共振動(dòng)態(tài)增強(qiáng)（DCE-MRI）定量參數(shù)及CTCs、cfDNA比較/

注：cfDNA為循環(huán)游離DNA，CTCs為血循環(huán)腫瘤細(xì)胞，Ktrans為速度常數(shù)，Kep為速率常數(shù)，Ve為血管外細(xì)胞外容積分?jǐn)?shù)。

組別良性組乳腺癌組t值P值A(chǔ)lu247/115 0.55±0.12 0.97±0.32 10.30＜0.001例數(shù)65 82 Ktrans/min 0.05±0.01 0.18±0.04 25.56＜0.001 Kep/min 0.51±0.11 1.32±0.27 22.73＜0.001 Ve 0.13±0.03 0.14±0.04 1.68 0.096 CTCs計(jì)數(shù)/（個(gè)/毫升）10.15±1.45 12.97±2.14 9.09＜0.001

2.2 兩組MRI一般特征比較 良性組邊緣多光滑，形狀規(guī)則，內(nèi)部強(qiáng)化以均勻?yàn)橹?，TIC分型Ⅰ型多見(jiàn)，早期增強(qiáng)率＜60%，乳腺癌組邊緣毛刺征、形狀不規(guī)則，內(nèi)部不均勻強(qiáng)化為主，以TIC分型Ⅲ型多見(jiàn)，早期增強(qiáng)率＜60%占比高。見(jiàn)表2。

表2 乳腺癌82例及乳腺良性病變65例MRI一般特征比較/例（%）

2.3 CTCs、cfDNA與乳腺癌臨床特征間的關(guān)系 淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、Ⅲ～Ⅳ期者CTCs數(shù)量、Alu247/115水平明顯高于無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、Ⅰ～Ⅱ期者（P＜0.05），見(jiàn)表3。

表3 乳腺癌82例血循環(huán)腫瘤細(xì)胞（CTCs）、循環(huán)游離DNA（cfDNA）與乳腺癌臨床特征間的關(guān)系/

表3 乳腺癌82例血循環(huán)腫瘤細(xì)胞（CTCs）、循環(huán)游離DNA（cfDNA）與乳腺癌臨床特征間的關(guān)系/

特征CTCs計(jì)數(shù)/（個(gè)/毫升）Alu247/115年齡＜45歲≥45歲腫瘤長(zhǎng)徑＜5 cm≥5 cm病理類型浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌導(dǎo)管原位癌浸潤(rùn)性小葉癌臨床分期Ⅰ～Ⅱ期Ⅲ～Ⅳ期淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是否例數(shù)4 2 t，P值1.56，0.124 t，P值0.67，0.503 40 12.61±1.87 13.34±2.36 0.95±0.21 0.99±0.32 1.16，0.251 1.18，0.242 69 13 12.85±2.06 13.61±2.74 0.98±0.19 0.91±0.23 2.26，0.111 0.01，0.998 54 21 7 12.63±1.85 13.74±2.36 13.21±2.59 0.97±0.33 0.96±0.31 0.98±0.36 7.11，＜0.001 5.31，＜0.001 28 54 9.76±1.03 14.63±3.54 0.68±0.17 1.12±0.42 17.79，＜0.001 9.33，＜0.001 58 24 15.56±3.57 6.71±0.63 1.17±0.52 0.48±0.12

2.4 DCE-MRI結(jié)合CTCs、cfDNA對(duì)乳腺癌診斷價(jià)值分析 三者聯(lián)合（DCE-MRI+CTCs+cfDNA）診斷效果優(yōu)于單一檢測(cè)CTCs、cfDNA檢測(cè)（P＜0.05），見(jiàn)表4。

表4 DCE-MRI結(jié)合CTCs、cfDNA對(duì)乳腺癌診斷價(jià)值分析

2.5 病例分析 女，45歲，乳腺癌（圖1），MRI掃描示雙側(cè)乳腺對(duì)稱，腺體呈散在纖維腺體型，背景實(shí)質(zhì)強(qiáng)化輕微，右側(cè)乳腺外上象限約10點(diǎn)方向可見(jiàn)一不規(guī)則結(jié)節(jié)狀長(zhǎng)T1稍長(zhǎng)T2信號(hào)灶（圖1A），DWI呈高信號(hào)（圖1B）。MRI增強(qiáng)掃描可見(jiàn)病灶呈明顯不均質(zhì)強(qiáng)化（圖1C～1E）。大小約為16 mm（上下徑）×13 mm（前后徑）×12 mm（左右徑），邊緣欠清晰，可見(jiàn)淺分葉，鄰近皮膚未見(jiàn)明顯增厚，右側(cè)乳頭未見(jiàn)凹陷。病理診斷為乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌（圖1F）。

圖1 女，45歲，乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌，乳房MRI掃描圖像及病理圖片：A為乳房T1WI圖；B為乳房T2WI圖；C為乳房增強(qiáng)1期圖；D為乳房增強(qiáng)2期圖；E為乳房增強(qiáng)3期圖，F(xiàn)為乳腺切除標(biāo)本病理學(xué)圖（HE染色×10）

3 討論

隨著疾病的進(jìn)展，原發(fā)性乳腺癌易發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和血行轉(zhuǎn)移。早期診斷和治療是改善病人預(yù)后的關(guān)鍵［5］。病理活檢仍是乳腺癌臨床診斷的金標(biāo)準(zhǔn)，但屬于有創(chuàng)檢查，在早期篩查中存在一定局限性［6］。目前，臨床早期篩查主要依靠影像學(xué)檢查和血清腫瘤標(biāo)志物。影像學(xué)檢查中，MRI檢查具有多角度成像、分辨率高等優(yōu)勢(shì)，有助于發(fā)現(xiàn)細(xì)小病灶或多發(fā)病灶，近年來(lái)檢查適應(yīng)證范圍逐漸擴(kuò)大［7］。本研究發(fā)現(xiàn)，良性組、乳腺癌組邊緣、形狀、內(nèi)部強(qiáng)化、TIC分型及早期強(qiáng)化率等MRI一般特征均具有差異，與既往報(bào)道結(jié)果相似，病灶邊緣出現(xiàn)毛刺，提示腫塊浸潤(rùn)性生長(zhǎng)、容易浸潤(rùn)周圍血管、淋巴管，淋巴結(jié)更易發(fā)生轉(zhuǎn)移。由此可見(jiàn)，多數(shù)乳腺病灶的常規(guī)MRI形態(tài)學(xué)有一定特征可循，通過(guò)分析MRI影像學(xué)表現(xiàn)能對(duì)病灶行初步定性評(píng)估。值得注意的是，部分極低度惡性或體積較小的病變處，影像學(xué)征象存在一定重疊，常規(guī)MRI檢查在該類病灶的定性評(píng)估效果欠佳［8］。

DCE-MRI屬于一種功能性MRI成像方法，可通過(guò)繪制TIC來(lái)評(píng)估腫瘤動(dòng)態(tài)強(qiáng)化特征，既往研究指出，血管生長(zhǎng)在腫瘤發(fā)生、發(fā)展中具有重要作用，而DCE-MRI可觀察血流動(dòng)力學(xué)情況，通過(guò)收集定量參數(shù)用于評(píng)估腫瘤血管生成狀態(tài)［9］。在DCE-MRI定量參數(shù)中，Ktrans是指對(duì)比劑由血漿向血管外細(xì)胞外間隙（extracellular space，EES）轉(zhuǎn)移的速率，與滲透性存在一定關(guān)系，可反映對(duì)比劑經(jīng)血管腔內(nèi)擴(kuò)散至腔外的血流信息，實(shí)際上，Ktrans并非反映對(duì)比劑血管分布的理想?yún)?shù)，任何影響血流灌注的因素，譬如高血壓、心輸出量等均引起Ktrans值發(fā)生波動(dòng)；Kep反應(yīng)了對(duì)比劑由EES重新回流至血漿的速率，可提供血管外細(xì)胞間隙回流至腔內(nèi)的相關(guān)信息，凸顯腫瘤血管的生成特征；Ve則是指對(duì)比劑漏出的間隙或分布間隙［10］。

Bertani等［11］發(fā)現(xiàn)，乳腺良、惡性疾病DCE-MRI定量參數(shù)Ve比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，Ktrans、Kep比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。本研究結(jié)果與上述報(bào)道相符。究其原因可能是：乳腺癌病人腫瘤組織血管密度較高，血管外腫瘤細(xì)胞間隙增寬，微循環(huán)血容量大、流速快；而良性病灶相較乳腺癌組織，微血管較少，血管壁結(jié)構(gòu)完整，血流灌注低，強(qiáng)化程度輕。本研究進(jìn)一步通過(guò)ROC曲線分析發(fā)現(xiàn)DCE-MRI定量參數(shù)用于鑒別診斷乳腺良惡性疾病的AUC值達(dá)0.80，與王睿等［12］研究結(jié)果相似，證實(shí)DCE-MRI定量參數(shù)在良惡性乳腺疾病鑒別診斷中具有重要價(jià)值。值得注意的是良性組與乳腺癌組的DCE-MRI定量參數(shù)Ve比較無(wú)差異，推測(cè)其原因可能是Ve值在病變過(guò)程中變化較小，良、惡性腫瘤的Ve水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，因此引起良惡性腫塊Ve值的變化范圍產(chǎn)生重疊區(qū)域，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理后未見(jiàn)兩者間存在明顯差異。另一方面亦可能與惡性變四周組織的水腫程度或動(dòng)脈有關(guān)，實(shí)際上部分學(xué)者認(rèn)為，可以通過(guò)延長(zhǎng)獲取圖像的時(shí)間，解決上述技術(shù)問(wèn)題，提高Ve值變化度，進(jìn)而獲取更高的診斷效果，但有關(guān)這一項(xiàng)解決方案目前尚存在爭(zhēng)議，同時(shí)本研究中結(jié)果發(fā)現(xiàn)三者聯(lián)合診斷效果與DCE-MRI相當(dāng)，雖與以往文獻(xiàn)資料顯示聯(lián)合效能優(yōu)于單一影像學(xué)診斷的結(jié)果存在一定差異，引起這一差異的原因有待后續(xù)進(jìn)一步深入探討，但DCE-MRI暫時(shí)獲得的診斷效果值得肯定。

近年來(lái)研究顯示，腫瘤細(xì)胞生物學(xué)行為和其組織病理學(xué)改變與分子生物學(xué)之間存在某種關(guān)系［13-14］。CTCs屬于異質(zhì)腫瘤細(xì)胞，是原發(fā)、復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移病灶脫落后，從脈管系統(tǒng)浸潤(rùn)外周血循環(huán)的腫瘤細(xì)胞總稱，通過(guò)檢測(cè)血液中CTCs數(shù)量可獲取腫瘤實(shí)時(shí)信息［15］。cfDNA可來(lái)源于壞死、凋亡的腫瘤細(xì)胞或由腫瘤細(xì)胞自身分泌［16-17］。已有研究證實(shí)，cfDNA完整性在腫瘤診斷、評(píng)估分期等具有重要作用［18］。本研究中，乳腺癌組CTCs數(shù)量、基于Alu序列的cfDNA247/115比值均高于良性組；且隨分期增高、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，CTCs數(shù)量、Alu247/115水平亦更高，表明CTCs、cfDNA完整性可能成為早期診斷乳腺癌、評(píng)估其病情的可靠指標(biāo)。通過(guò)ROC曲線分析乳腺癌CTCs、cfDNA完整性水平單項(xiàng)檢測(cè)時(shí)，發(fā)現(xiàn)二者單獨(dú)檢測(cè)靈敏度、特異度較低，但聯(lián)合DCE-MRI檢查時(shí)靈敏度、特異度分別達(dá)0.93、0.84，可見(jiàn)DCE-MRI結(jié)合CTCs、cfDNA能幫助臨床獲取更高的診斷效果，推測(cè)其原因可能是聯(lián)合檢查可為臨床提供影像學(xué)、分子生物學(xué)方面的雙重信息，使診斷依據(jù)更加充分，從而提高診斷價(jià)值［19-20］。

綜上所述，乳腺癌病人CTCs、cfDNA存在異常表達(dá)，可能與病人臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，相對(duì)單一實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)，DCE-MRI結(jié)合CTCs、cfDNA檢測(cè)能獲取更多可靠信息。本研究的不足之處在于屬于回顧性研究，樣本量偏低可能對(duì)統(tǒng)計(jì)學(xué)結(jié)果產(chǎn)生一定偏倚，后續(xù)仍需擴(kuò)大樣本量，進(jìn)一步行多中心前瞻性研究證實(shí)結(jié)論。