劉涵斐，李錫宏，徐婷婷，許汝冰，鄭露，黃俊斌，黎妍妍*

植物保護(hù)

貝萊斯芽孢桿菌F85拮抗煙草炭疽菌的轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析

劉涵斐1，李錫宏2，徐婷婷1，許汝冰2，鄭露1，黃俊斌1，黎妍妍2*

1 華中農(nóng)業(yè)大學(xué)植物科技學(xué)院，湖北省作物病害監(jiān)測(cè)和安全控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北省武漢市獅子山街特1號(hào) 430207；2 湖北省煙草科學(xué)研究院，湖北省武漢市硚口區(qū)寶豐路6號(hào) 430030

【目的】為探索煙草炭疽菌響應(yīng)貝萊斯芽孢桿菌（）F85拮抗的分子機(jī)制。【方法】以引起煙草炭疽病的為研究對(duì)象，設(shè)置經(jīng)F85無(wú)菌發(fā)酵液處理后的菌株（T）和正常生長(zhǎng)的菌株（CK），利用轉(zhuǎn)錄組測(cè)序探究貝萊斯芽孢桿菌拮抗條件下煙草炭疽菌菌絲的差異表達(dá)基因（Differential Expressed Genes, DEGs）和代謝通路富集情況?！窘Y(jié)果】無(wú)菌發(fā)酵液處理的菌株（T）與對(duì)照（CK）相比，共有2870個(gè)DEGs，其中1524個(gè)基因上調(diào)表達(dá)，1346個(gè)基因下調(diào)表達(dá)。KEGG富集分析結(jié)果表明，DEGs主要富集在苯丙氨酸代謝（Phenylalanine metabolism）、纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸降解（Valine, leucine and isoleucine degradation）等通路上，編碼過(guò)氧化物酶體（KatGs）、醛脫氫酶（ALDH）、甲基丙二酸半醛脫氫酶（MoMsdh）等的基因顯著下調(diào)表達(dá)。【結(jié)論】在貝萊斯芽孢桿菌F85拮抗下，煙草炭疽菌菌絲轉(zhuǎn)錄組特征發(fā)生顯著變化，F(xiàn)85主要影響菌絲過(guò)氧化物酶體調(diào)控以及菌絲能量形成過(guò)程等。

貝萊斯芽孢桿菌；煙草炭疽菌；轉(zhuǎn)錄組分析；生物防治

芽胞桿菌（）是目前用于生物防治的主要微生物之一，其生長(zhǎng)繁殖迅速，可以有效定殖在植物根際，其中，貝萊斯芽孢桿菌（）因其廣譜高效的抑菌特性而備受關(guān)注[1]。據(jù)報(bào)道，貝萊斯芽孢桿菌可分泌幾丁質(zhì)酶和葡聚糖酶等抗菌物質(zhì)，降解病原菌細(xì)胞壁，使病原菌失去活性[2]；產(chǎn)生surfactin、fengycin和iturin等脂肽類抗生素，其中surfactin的分泌產(chǎn)物有助于生防細(xì)菌更好地在植物上定殖，fengycin和iturin可抑制病原真菌菌絲的生長(zhǎng)，脂肽類抗生素相關(guān)基因、、、等在抗病機(jī)理中具有重要作用[3]；產(chǎn)生由非核糖體多肽合成酶（NRPS）和聚酮化合物（PKS）直接合成的抗病相關(guān)基因簇[4]。除直接作用于病原菌外，貝萊斯芽孢桿菌可誘導(dǎo)植物體內(nèi)過(guò)氧化氫積累和胼胝質(zhì)生成，啟動(dòng)植物自身的防御系統(tǒng)來(lái)提高植物抗病性[5]；還可分泌嗜鐵素、吲哚-3-乙酸等物質(zhì)促進(jìn)植物生長(zhǎng)[1, 6]。目前，貝萊斯芽孢桿菌已廣泛用于煙草病害（如青枯病[7]、赤星病[8]、靶斑 病[9]等）的防治中。

植物炭疽病由炭疽菌屬真菌侵染引起。炭疽菌屬共有14個(gè)復(fù)合種，每個(gè)復(fù)合種又包含不同的炭疽菌種[10]。在我國(guó)，已鑒定出引起煙草炭疽病的病原主要包括C. destructivum復(fù)合種中的[11]、C. gloeosporioides復(fù)合種中的和[12-13]、C. orbiculare復(fù)合種中的[14]、C.boninense復(fù)合種中的[15]，不同的復(fù)合種在菌落特征、分生孢子和附著胞形態(tài)特征、大小等方面存在明顯差異[10]。在這幾種炭疽菌中，不僅是引起煙草炭疽病的主要病原[13]，還可引起杧果[16]、橡膠樹(shù)[17]、蘋果[18]、草莓[19]等多種作物炭疽病。因此，關(guān)于的防控應(yīng)引起足夠重視。

前人研究結(jié)果表明[20-24]，貝萊斯芽孢桿菌X10-03、SM905、HN-2、JK3、CE100等菌株對(duì)草莓、芒果、鐵皮石斛等作物炭疽病菌具有較好的抑菌活性，而關(guān)于炭疽病菌如何響應(yīng)或應(yīng)答貝萊斯芽孢桿菌的機(jī)制并不清楚。本研究以和作為生防微生物和植物病原微生物互作系統(tǒng)，采用轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)比較分析菌株和經(jīng)發(fā)酵液處理后菌株的基因表達(dá)特征，在轉(zhuǎn)錄組水平上揭示響應(yīng)拮抗的分子機(jī)制，旨在為貝萊斯芽孢桿菌作為煙草炭疽病生防菌的開(kāi)發(fā)奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

貝萊斯芽孢桿菌（）菌株F85由華中農(nóng)業(yè)大學(xué)植物真菌病害研究室保藏。炭疽菌（）菌株BB001ES11分離自恩施州宣恩縣涼風(fēng)村煙草（云煙87）葉片。

1.2 炭疽菌的鑒定

按照相關(guān)文獻(xiàn)中的方法[25]進(jìn)行BB001ES11菌株的形態(tài)學(xué)鑒定和多基因分子鑒定。PDA培養(yǎng)基（馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、瓊脂15～20 g、純水定容至 1 L）中培養(yǎng)后，觀察菌落形態(tài)并測(cè)量菌落直徑，光學(xué)顯微鏡下觀察產(chǎn)孢表型及分生孢子、附著胞的形態(tài)和大??；提取菌絲DNA后，基于多基因序列各引物[25]進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR反應(yīng)體系和反應(yīng)程序見(jiàn)文獻(xiàn)[25]，測(cè)序完成后在MEGA11.0中采用鄰近法（Neighbor Joining，NJ）構(gòu)建BB001ES11菌株序列與參考菌株基因序列的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，自舉法檢測(cè)1000次。

打取在PDA平板上培養(yǎng)5～7 d的菌落邊緣的菌絲塊，采用微傷接種（劃傷葉片但不穿破葉片）方式接種云煙87葉片。置于28℃恒溫箱中培養(yǎng)，黑暗條件下培養(yǎng)5 d，觀察葉片發(fā)病情況。

1.3 貝萊斯芽孢桿菌-炭疽菌共培養(yǎng)與樣品制備

將活化后的F85菌株的菌液按0.5%（V/V）的比例接種于200 mL液體LB培養(yǎng)基（胰蛋白胨10 g、酵母提取物5 g、氯化鈉5 g、純水定容至1 L）中，在37℃、180 r/min的條件下培養(yǎng)48 h。將搖培后的發(fā)酵液于8000 r/min離心15 min，上清液用細(xì)菌過(guò)濾器過(guò)濾即獲得F85菌株的無(wú)菌發(fā)酵濾液。將該無(wú)菌發(fā)酵濾液加至PDB培養(yǎng)基（馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、純水定容至1 L）中，使其終濃度為5%，打取直徑為5 mm的煙草炭疽菌菌絲塊接種于PDB培養(yǎng)液中，標(biāo)記為處理組（T）；以不加F85無(wú)菌發(fā)酵濾液的處理作為對(duì)照，標(biāo)記為對(duì)照組（CK）。28℃、180 r/min條件下?lián)u培5 d后抽濾菌絲，用液氮冷凍菌絲后于-80℃冰箱中保存?zhèn)溆?。每個(gè)處理重復(fù)3個(gè)樣本。

1.4 總RNA提取、文庫(kù)構(gòu)建和Illumina測(cè)序

采用Trizol試劑盒（Invitrogen, Burlington, ON, Canada）提取樣品總RNA，采用瓊脂糖凝膠電泳分析樣品RNA完整性及是否存在DNA污染；用NanoPhotometer spectrophotometer檢測(cè)RNA純度（OD260/280及OD260/230比值）；用Agilent 2100 bioanalyzer檢測(cè)RNA完整性。

使用Illumina的NEBNext?UltraTMRNA Library Prep Kit試劑盒進(jìn)行建庫(kù)，庫(kù)檢合格后，在Illumina Novaseq 6000平臺(tái)上進(jìn)行測(cè)序（北京諾禾致源科技股份有限公司），產(chǎn)生150 bp配對(duì)末端讀數(shù)。

為保證數(shù)據(jù)分析的質(zhì)量及可靠性，使用fastp（version 0.19.7）軟件對(duì)原始數(shù)據(jù)（Raw reads）進(jìn)行過(guò)濾，去除帶接頭（adapter）的reads、含N的reads、低質(zhì)量reads（Qphred≤20的堿基數(shù)占整個(gè)read長(zhǎng)度的50%以上的reads），得到Clean reads。同時(shí)，計(jì)算Clean reads的Q20、Q30和GC含量。

1.5 差異表達(dá)基因（DEGs）篩選

從NCBI網(wǎng)站（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）下載參考基因組和基因模型注釋文件[26]；使用HISAT2 v2.0.5構(gòu)建參考基因組的索引，并將配對(duì)末端Clean reads與參考基因組比對(duì)。

使用DESeq2軟件（1.16.1）分別進(jìn)行處理組（T）和對(duì)照組（CK）之間的差異表達(dá)分析。以校正后的值（-adj < 0.05）以及|log2Fold change| >1（Fold change為T的表達(dá)量/CK的表達(dá)量）作為基因顯著差異表達(dá)的閾值。

預(yù)算評(píng)價(jià)是指采用科學(xué)方法對(duì)預(yù)算管理及運(yùn)行情況進(jìn)行的定性和定量分析與評(píng)估。預(yù)算評(píng)價(jià)是加強(qiáng)預(yù)算管理、優(yōu)化資源配置、提高財(cái)政資金使用效益的有效措施。預(yù)算評(píng)價(jià)信息系統(tǒng)不僅是預(yù)算管理子系統(tǒng)的集合，更重要的是可以進(jìn)行信息的收集、處理、存儲(chǔ)和分發(fā)，以支持一個(gè)組織的決策制定和控制，預(yù)算評(píng)價(jià)信息系統(tǒng)還可以成為問(wèn)題分析和創(chuàng)造新產(chǎn)品的工具。從技術(shù)的視角看，預(yù)算評(píng)價(jià)信息系統(tǒng)將原始數(shù)據(jù)進(jìn)行輸入、處理和輸出，通過(guò)收集、儲(chǔ)存、轉(zhuǎn)換、分發(fā)可以支持組織的決策、通信、協(xié)調(diào)、控制、分析和設(shè)想。作為一個(gè)基于信息技術(shù)的組織和管理解決方案是應(yīng)對(duì)環(huán)境賦予的挑戰(zhàn)的有效工具，可以提高組織績(jī)效，最終提升財(cái)政效率。

1.6 GO分類注釋和KEGG注釋富集分析

采用R軟件clusterProfiler包對(duì)差異表達(dá)基因進(jìn)行GO富集分析，以-adj<0.05作為顯著性富集的閾值。將差異表達(dá)基因提交至KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)（https://www. kegg.jp/）中進(jìn)行注釋，獲得KEGG富集分析結(jié)果，以-adj<0.05作為顯著性富集的閾值。

1.7 實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）驗(yàn)證

為驗(yàn)證轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果的準(zhǔn)確性，以作為內(nèi)參基因，隨機(jī)選取8個(gè)差異表達(dá)基因進(jìn)行qRT-PCR驗(yàn)證。使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒（TransScript One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix，北京全式金公司）進(jìn)行cDNA合成，具體步驟參照說(shuō)明書(shū)。qRT-PCR涉及的引物序列見(jiàn)表1。qRT-PCR反應(yīng)體系為cDNA模板1 μL、正反向引物（10 μmol/L）各0.4 μL，2× SuperMix 10 μL，補(bǔ)足ddH2O至20 μL。反應(yīng)程序在CFX96? Real Time PCR system上進(jìn)行。反應(yīng)條件：95℃，30 s；95℃，5 s；60℃，30 s重復(fù)40個(gè)循環(huán)；65～95℃，每個(gè)循環(huán)上升0.5℃，持續(xù)5 s。待擴(kuò)增結(jié)束后，使用2?ΔΔCT方法計(jì)算基因的相對(duì)表達(dá)量[27]。每個(gè)樣品3次生物學(xué)重復(fù)。

表1 qRT-PCR引物序列信息

2 結(jié)果與分析

2.1 炭疽菌的鑒定

對(duì)分離自煙草葉片上的BB001ES11菌株的生長(zhǎng)特性、分生孢子和附著胞進(jìn)行了形態(tài)學(xué)鑒定（圖1 A～D）。在28℃、PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)7 d后，BB001ES11的菌落凸起且邊緣完整，氣生菌絲較濃密，絮狀，呈現(xiàn)同心環(huán)紋，正面中央淺灰色，且由中央向邊緣顏色遞減，邊緣白色；背面中央深墨綠色，邊緣白色；菌落平均直徑7.7 cm。分生孢子透明，無(wú)隔膜，圓柱狀，兩端鈍圓，大小17.8～18.0 μm × 6.5～6.8 μm；附著胞光滑，黑色，近球形或者橢圓形，大小6.8～7.0 μm × 9.1～9.3 μm。按照Sutton[28]和Cai等[29]的分類標(biāo)準(zhǔn)，BB001ES11菌株屬于復(fù)合種。

注：菌株BB001ES11：正面和背面菌落（B, A）、分生孢子（C）、附著胞（D），標(biāo)尺=20 μm；致病性測(cè)定（E）。

Note: Strain BB001ES11: front and back colony (B, A), conidia (C) and appressoria (D), Bar=20 μm; pathogenicity test (E).

圖1 BB001ES11菌株的形態(tài)學(xué)鑒定和致病性測(cè)定

Fig. 1 Morphological identification and pathogenicity test of the BB001ES11 strain

對(duì)于形態(tài)學(xué)上鑒定為復(fù)合種的BB001ES11菌株，分別擴(kuò)增、、、、和ITS序列，以（CBS123755）作為外群（outgroup），進(jìn)行多基因系統(tǒng)發(fā)育分析。結(jié)果表明，BB001ES11菌株與3株模式菌株（CBS125397、ICMP18581、ICMP18727）聚在一起；而與同屬?gòu)?fù)合種的（ICMP12567、ICMP18121）、（ICMP17816）相距較遠(yuǎn)（圖2）。

圖2 基于ACT、CHS-1、CAL、TUB2、GAPDH和ITS序列的BB001ES11菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)

將BB001ES11菌株接種云煙87葉片，進(jìn)行了致病性試驗(yàn)（圖1 E）。結(jié)果表明BB001ES11可引起健康煙草葉片產(chǎn)生褐色病斑，病斑大?。ㄩL(zhǎng)×寬）為20 mm2，在葉背面觀察到明顯穿孔癥狀。按照柯赫氏法則，將上述發(fā)病煙草葉片進(jìn)行組織分離、病原菌純化，鑒定其病原菌為，與最初接種的病原菌相同。

2.2 RNA-Seq數(shù)據(jù)質(zhì)量統(tǒng)計(jì)與分析

對(duì)原始數(shù)據(jù)過(guò)濾后，獲得超過(guò)40 M的Clean reads數(shù)據(jù)，Clean reads數(shù)據(jù)占Raw reads的比例在94%以上，Q20和Q30的比例分別在97%和92%以上，表明RNA-seq的測(cè)序結(jié)果質(zhì)量較好，可用作分析（表2）。

將RNA-seq的Clean reads數(shù)據(jù)與參考基因組進(jìn)行比對(duì)，對(duì)照組（CK）和處理組（T）比對(duì)到參考基因組的讀長(zhǎng)（Total map）占比分別為91.99%～96.91%和97.03%～97.16%，比對(duì)到參考基因組唯一分布的讀長(zhǎng)（Unique map）占比分別為91.80%～96.68%和96.82%～96.96%，表明轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果較好（表1）。對(duì)同組樣品間的相關(guān)性進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)各組內(nèi)樣品間的2（皮爾遜相關(guān)系數(shù)的平方）均大于0.8，表明處理組（T）和對(duì)照組（CK）組內(nèi)具有較高的重復(fù)性（圖3）。

表2 測(cè)序數(shù)據(jù)質(zhì)量統(tǒng)計(jì)

Tab.2 Statistics of sequencing data quality

圖3 樣本間相關(guān)性分析

2.3 qRT-PCR驗(yàn)證

圖4 RNA-seq和qRT-PCR基因表達(dá)結(jié)果比較

2.4 差異表達(dá)基因分析

對(duì)處理組（T）和對(duì)照組（CK）進(jìn)行了差異表達(dá)基因（DEGs）篩選。結(jié)果表明（圖5 A），與CK對(duì)比，處理組（T）共有2870個(gè)DEGs，其中1524個(gè)基因上調(diào)表達(dá)，1346個(gè)基因下調(diào)表達(dá)。聚類熱圖分析表明，處理組（T）和對(duì)照組（CK）的基因表達(dá)譜具有顯著差異（圖5 B）。

注：log2Fold Change中Fold change表示處理組（T）的表達(dá)量/對(duì)照組（CK）的表達(dá)量。表3、表4同。

Note: Fold change in log2Fold Change represents the expression level of treatment group (T)/ the expression level of control group (CK). The same for table 3 and table 4.

圖5 火山圖（A）和熱圖（B）分析經(jīng)F85無(wú)菌發(fā)酵液處理后的差異表達(dá)基因

Fig.5 Volcano map (A) and heat map (B) of differential expressed genes oftreated with F85 sterile fermentation filtrate

2.5 差異表達(dá)基因功能富集分析

2.5.1 GO富集分析

對(duì)差異表達(dá)基因（DEGs）進(jìn)行了GO功能富集分析（前30個(gè)條目），結(jié)果表明（圖6），在分子功能（Molecular function）中，DEGs主要富集在輔酶結(jié)合（coenzyme binding）、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)活性（transcription regulator activity）等條目上；在生物學(xué)進(jìn)程（Biological process）中，DEGs主要富集在細(xì)胞生物合成過(guò)程調(diào)控（regulation of cellular biosynthetic process）、生物合成過(guò)程調(diào)控（regulation of biosynthetic process）、高分子生物合成過(guò)程調(diào)控（regulation of macromolecule biosynthetic process）等條目上；富集到細(xì)胞組成（Cellular component）各條目中的DEGs數(shù)量較少。

注：橫軸表示注釋到GO條目上的差異基因數(shù)與差異基因總數(shù)的比值，縱軸表示富集的GO條目。數(shù)字表示富集到該GO條目的基因數(shù)目。

Note: The horizontal axis represents the ratio of the number of DEGs annotated to this GO term to the total number of DGEs, and the vertical axis represents the enriched GO terms. The number represents the number of DEGs enriched to this GO term.

圖6經(jīng)F85無(wú)菌發(fā)酵濾液處理后差異表達(dá)基因的GO富集分析

Fig.6 GO enrichment analysis of the differential expressed genes oftreated with F85 sterile fermentation filtrate

2.5.2 KEGG富集分析

對(duì)差異表達(dá)基因（DEGs）進(jìn)行了KEGG富集分析（前20個(gè)通路），結(jié)果表明（圖5），DEGs主要富集在苯丙氨酸代謝（Phenylalanine metabolism，=0.0001），β-丙氨酸代謝（beta-Alanine metabolism，=0.0038），纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸降解（Valine, leucine and isoleucine degradation，=0.0038），甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸代謝（Glycine, serine and threonine metabolism，=0.0045）等通路上。

注：橫軸表示注釋到KEGG通路編號(hào)上的差異基因數(shù)與差異基因總數(shù)的比值，縱軸表示富集的KEGG通路。圓點(diǎn)從藍(lán)色到紅色表示-adj值從大到小，圓點(diǎn)的大小表示注釋到該通路的基因數(shù)目。

Note: The horizontal axis represents the ratio of the number of DEGs annotated to this KEGG pathway to the total number of DEGs, and the vertical axis represents the enriched KEGG pathways. The dots from blue to red indicate the-adj value from large to small, and the size of the dots indicates the number of DEGs annotated to this KEGG pathway.

圖7經(jīng)F85無(wú)菌發(fā)酵濾液處理后差異表達(dá)基因的KEGG富集分析

Fig.7 KEGG enrichment analysis of the differential expressed genes oftreated with F85 sterile fermentation filtrate

2.6 煙草炭疽菌響應(yīng)貝萊斯芽孢桿菌拮抗的關(guān)鍵通路及基因分析

2.6.1 苯丙氨酸代謝通路

與對(duì)照（CK）相比，經(jīng)貝萊斯芽孢桿菌無(wú)菌發(fā)酵液處理后的煙草炭疽菌（）（T）的苯丙氨酸代謝通路中共有21個(gè)差異表達(dá)基因（表3）。5個(gè)上調(diào)基因主要編碼芳香族-L-胺基酸脫羧酶（Aromatic- L-amino-acid decarboxylase）、酰胺酶（Amidase）等，上調(diào)倍數(shù)為1.21～5.32倍；16個(gè)下調(diào)基因主要編碼過(guò)氧化物酶體伯胺氧化酶（Peroxisomal primary amine oxidase）、過(guò)氧化氫酶-過(guò)氧化物酶（Catalase- peroxidase）、醛脫氫酶（Aldehyde dehydrogenase）、乙酸苯酯 2-羥化酶（Phenylacetate 2-hydroxylase）等，下調(diào)倍數(shù)為1.20～7.84倍。

表3 煙草炭疽菌KEGG富集中苯丙氨酸代謝通路中相關(guān)的差異表達(dá)基因

Tab.3 Related differentially expressed genes in phenylalanine metabolic pathways in KEGG enrichment of C. fructicola

續(xù)表3

基因號(hào)Gene numberlog2 FoldChangeP-adj功能注釋Function annotation CGMCC3_g2215-4.302.85E-45過(guò)氧化物酶體伯胺氧化酶Peroxisomal primary amine oxidase CGMCC3_g2217-4.996.13E-21醛脫氫酶樣蛋白（推定）putative aldehyde dehydrogenase-like protein CGMCC3_g13319-5.017.14E-21銅胺氧化酶1 Copper amine oxidase 1 CGMCC3_g5844-3.844.36E-19過(guò)氧化氫酶-過(guò)氧化物酶Catalase-peroxidase CGMCC3_g16916-1.967.66E-10過(guò)氧化氫酶-過(guò)氧化物酶Catalase-peroxidase CGMCC3_g16353-7.846.19E-08醛脫氫酶Aldehyde dehydrogenase CGMCC3_g184-1.991.24E-05酰胺酶（推定）putative amidase CGMCC3_g7692-1.806.70E-05銅胺氧化酶1 Copper amine oxidase 1 CGMCC3_g12329-4.403.96E-03酰胺酶Amidase CGMCC3_g3954-3.699.12E-03乙酰胺酶Acetamidase CGMCC3_g7323-4.102.88E-02酰胺酶（推定）putative amidase CGMCC3_g17030-1.203.48E-02醛脫氫酶樣蛋白（推定）putative aldehyde dehydrogenase-like protein CGMCC3_g9051-6.073.51E-02乙酸苯酯2-羥化酶Phenylacetate 2-hydroxylase CGMCC3_g13257-2.087.26E-06胺氧化酶Amine oxidases CGMCC3_g1351-5.373.18E-13未經(jīng)鑒定的蛋白質(zhì)uncharacterized protein CGMCC3_g4344-3.941.49E-03酰胺酶Amidase

2.6.2 纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸降解通路

與對(duì)照（CK）相比，經(jīng)貝萊斯芽孢桿菌無(wú)菌發(fā)酵液處理后的煙草炭疽菌（）（T）的纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸降解通路中共有17個(gè)差異表達(dá)基因（表4）。3個(gè)上調(diào)基因主要編碼轉(zhuǎn)氨酶（Aminotrans- ferases）和纖連蛋白（Fibronectin），上調(diào)倍數(shù)為1.25～5.90倍；14個(gè)下調(diào)基因主要編碼甲基丙二酸-半醛脫氫酶（Methylmalonate-semialdehyde dehydrogena- se）、4-氨基丁酸轉(zhuǎn)氨酶（4-aminobutyrate aminotransf- erase）、短/支鏈特異性?；o酶A脫氫酶（Short/branched chain specific acyl-CoA dehydrogen- ase）、2-氧異戊酸酯脫氫酶亞基α（2-oxoisovalerate dehydrogenase subunit alpha）、羥甲基戊二酰輔酶A合酶（Hydroxymethylglutaryl-CoA synthase）等，下調(diào)倍數(shù)為1.01～2.73倍。

表4 煙草炭疽菌KEGG富集中纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸降解通路中的相關(guān)差異表達(dá)基因

Tab.4 Related differentially expressed genes in valine, leucine and isoleucine degradation pathways in KEGG enrichment of C. fructicola

3 討論

將貝萊斯芽孢桿菌作為生防菌應(yīng)用于植物病害的生物防治，已成為目前微生物生態(tài)防控的研究熱點(diǎn)?；谵D(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)，研究生防菌-植物病原微生物互作系統(tǒng)中植物病原微生物的基因表達(dá)變化有助于進(jìn)一步解析貝萊斯芽孢桿菌對(duì)病原微生物的直接作用。高雪等[30]發(fā)現(xiàn)貝萊斯芽孢桿菌HN-2正丁醇提取物主要影響稻黃單胞桿菌水稻致病變種（）的核糖體途徑、淀粉和蔗糖代謝途徑、細(xì)菌趨化性途徑。張國(guó)俊[31]研究表明貝萊斯芽孢桿菌無(wú)菌發(fā)酵液對(duì)太子參根腐病菌（）的代謝途徑、次生代謝產(chǎn)物合成及ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白合成途徑進(jìn)行調(diào)節(jié)，從而抑制的正常生長(zhǎng)。為進(jìn)一步明確貝萊斯芽孢桿菌對(duì)炭疽菌的抑菌機(jī)制，本研究將F85無(wú)菌發(fā)酵液處理后的進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，為合理利用貝萊斯芽孢桿菌防治煙草炭疽病奠定了理論基礎(chǔ)。

轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析發(fā)現(xiàn)F85無(wú)菌發(fā)酵液處理后的差異表達(dá)基因主要富集在苯丙氨酸代謝及纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸降解等通路上，表明貝萊斯芽孢桿菌很可能通過(guò)影響炭疽菌的這些代謝途徑而發(fā)揮抑菌能力。其中，苯丙氨酸代謝通路富集最顯著。在苯丙氨酸代謝通路中，過(guò)氧化物酶體可參與多種生化過(guò)程，在病菌損傷時(shí)它們阻塞菌絲細(xì)胞膜上的破損孔洞，具有防止胞質(zhì)外流的作用[32]。研究表明，瓜類植物炭疽病菌（）中編碼過(guò)氧化物酶的基因參與過(guò)氧化物酶體的形成和增殖[33]。本研究結(jié)果顯示，受F85無(wú)菌發(fā)酵液處理后，編碼過(guò)氧化物酶體如Peroxisomal primary amine oxidase、Catalase-peroxidase（KatGs）等的基因表達(dá)顯著下調(diào)，表明菌絲過(guò)氧化物酶體的形成過(guò)程受阻。同時(shí)，Bhambra等[34]研究表明，過(guò)氧化物酶體的缺陷可阻礙幾丁質(zhì)的合成，從而影響菌絲細(xì)胞壁的完整性。因此推測(cè)貝萊斯芽孢桿菌通過(guò)抑制炭疽菌過(guò)氧化物酶體的形成從而抑制菌絲細(xì)胞膜的修復(fù)、幾丁質(zhì)合成等過(guò)程，進(jìn)而影響細(xì)胞壁的完整性，造成菌絲生長(zhǎng)的缺陷。其他的酶體，如Aldehyde dehydrogenase（ALDH）能將醛脫氫氧化為相應(yīng)的羧酸，其在生物體中具有脫毒（醛類物質(zhì)）、參與代謝、滲透保護(hù)和NAD(P)H再生的4種主要功能[35-36]。經(jīng)F85無(wú)菌發(fā)酵液處理后，編碼這些酶類的基因也表現(xiàn)為顯著下調(diào)，表明F85可以阻斷中的滲透調(diào)節(jié)、多胺代謝等過(guò)程，進(jìn)而對(duì)菌絲生長(zhǎng)產(chǎn)生影響。

纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸降解通路中的物質(zhì)多與能量代謝、轉(zhuǎn)化有關(guān)。在三羧酸循環(huán)中，必須不斷補(bǔ)充草酰乙酸才能維持循環(huán)正常進(jìn)行，琥珀酰CoA是草酰乙酸回補(bǔ)反應(yīng)中重要的物質(zhì)原料，纈氨酸、異亮氨酸等可形成琥珀酰CoA而補(bǔ)充三羧酸循環(huán)[37]，從而保持能量形成。在該通路中，甲基丙二酸半醛脫氫酶（Methylmalonate-semialdehyde dehydrogenase，Mo Msdh）是醛基脫氫酶超級(jí)家族中一種重要的酶。據(jù)報(bào)道[38]，它在稻瘟病菌（）的孢子形成、極化萌發(fā)、氧化還原穩(wěn)態(tài)和致病機(jī)制中發(fā)揮著重要的作用。本研究中，受F85無(wú)菌發(fā)酵液處理后，纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸降解通路上的大部分基因下調(diào)，表明F85一方面可以阻斷菌絲的能量形成過(guò)程，另一方面也可能對(duì)菌絲的形成產(chǎn)生抑制作用，這有待于進(jìn)一步驗(yàn)證。

4 結(jié)論

轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析發(fā)現(xiàn)貝萊斯芽孢桿菌拮抗條件下煙草炭疽菌的差異表達(dá)基因主要富集在苯丙氨酸代謝（Phenylalanine metabolism）、纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸降解（Valine, leucine and isoleucine degradation）等通路上，貝萊斯芽孢桿菌可能影響菌絲過(guò)氧化物酶體的調(diào)控、能量形成過(guò)程等。本研究結(jié)果為進(jìn)一步研究貝萊斯芽孢桿菌抑制煙草炭疽病的機(jī)制提供了依據(jù)。

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Transcriptomic analysis ofF85 antagonizing

LIU Hanfei1, LI Xihong2, XU Tingting1, XU Rubing2, ZHENG Lu1, HUANG Junbin1, LI Yanyan2*

1 College of Plant Science and Technology, Huazhong Agriculture University, Key Laboratory of Plant Pathology of Hubei Province，Wuhan 430207, China;2 Tobacco Research Institute of Hubei Province, Wuhan 430030, China

This study aims to explore the molecular mechanism ofspp. in response to the antagonism effect ofF85.Taking Colletotrichum fructicola, which causes tobacco anthracnose, as the research object, we set up a C. fructicola strain (T) treated with Bacillus velezensis F85 sterile fermentation broth and a normally growing C. fructicola strain (CK). We used transcriptome sequencing to explore the differentially expressed genes (DEGs) and the enrichment of metabolic pathways in the mycelium of tobacco anthracnose fungus under the antagonistic conditions of Bacillus velezensis..2870 DEGs were found between CK and T, including 1524 up-regulated genes and 1346 down-regulated genes. KEGG enrichment analysis showed that some pathways such as Phenylalanine metabolism, Valine, leucine and isoleucine degradation were significantly enriched by DEGs. Some genes coding KatGs, ALDH, CuAO, MoMsdh were down-expressed significantly.Under the antagonism of B. velezensis F85, the characteristics ofhyphae at transcriptomes level were significantly changed, and theF85 significantly affected the regulation of peroxisome and energy formation process ofmycelium.

;; transcriptome analysis; biological control

. Email：yanyanli0025@126.com

10.16472/j.chinatobacco.2023.T0010

湖北省煙草公司科技項(xiàng)目（027Y2021-004）；中國(guó)煙草總公司重大科技項(xiàng)目（110202201019（LS-03））

劉涵斐（1994—），碩士研究生，主要從事作物病害研究，Email：2286743452@qq.com

黎妍妍（1982—），博士，研究員，主要從事煙草綠色防控技術(shù)創(chuàng)新與推廣，Email：yanyanli0025@126.com

2023-01-31；

2023-08-04

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