高天翔，張浩博，王曉艷，陳 治

(1.浙江海洋大學水產(chǎn)學院，浙江 舟山 316022；2.浙江海洋大學，國家海洋設(shè)施養(yǎng)殖工程技術(shù)研究中心，浙江 舟山 316022；3.海南熱帶海洋學院水產(chǎn)與生命學院，海南 三亞 572022)

生物都通過產(chǎn)生糞便、尿液、唾液、皮膚細胞的方式將DNA 排出或脫落到周圍環(huán)境中，這類大量存在于環(huán)境中的DNA 片段總和稱之為環(huán)境DNA(environmental DNA,eDNA)[1]。eDNA 技術(shù)即以此為基礎(chǔ)，通過適當?shù)难芯渴侄螌崿F(xiàn)對環(huán)境中的目標物種或生物群落進行監(jiān)測。該技術(shù)具有低成本[2]，高靈敏度[3]，非侵入性等優(yōu)勢[4]，能夠有效克服傳統(tǒng)水生生物調(diào)查方法的弊端，已成為監(jiān)測水生生物物種多樣性、生物量及其時空分布的重要手段[5-6]。目前，eDNA 分析技術(shù)已被證明可以有效地對目標物種進行定性和定量檢測。例如，Parsons 等[7]利用eDNA 在阿拉斯加東南部內(nèi)陸水域中檢測到難以監(jiān)測的鼠海豚(Phocoena phocoena)；Goutte 等[8]的研究表明，eDNA 方法與電魚調(diào)查結(jié)果中各個物種豐度相差無幾，eDNA 在水生生物定量研究方面具有可靠性；Wang 等[9-11]使用TaqMan 探針在東海成功監(jiān)測到大黃魚(Larimichthys crocea)、小黃魚(L.polyactis)以及入侵物種——眼斑擬石首魚(Sciaenops ocellatus)的分布。總體而言，eDNA 分析既可以用于單個物種，如入侵物種或稀有物種的調(diào)查[12]，也可以與高通量測序技術(shù)結(jié)合，研究整個群落的物種組成和多樣性[13]。研究表明，單一物種特異性PCR 方法可能比多物種高通量測序方法更為敏感和準確[14-15]。熒光定量PCR(qPCR)是目前基于eDNA 樣本分析物種特異性最常見的方式。然而，最近的研究表明，與qPCR 技術(shù)相比，微滴式數(shù)字PCR (ddPCR)技術(shù)對環(huán)境樣本中eDNA 的檢出率更高[16-17]、對反應(yīng)抑制物的耐受能力也更強[18-19]。目前，ddPCR技術(shù)已成功應(yīng)用于魚類eDNA 檢測[16-17,20]。

中國團扇鰩(Platyrhina sinensis)隸屬于軟骨魚綱(Chondrichthyes)鲼目(Myliobatiformes)團扇鰩科(Platyrhinidae)團扇鰩屬(Platyrhina)，為小型底層軟骨魚類，主要分布于北太平洋西部，我國東海南部(臺灣海峽)及南海海域，是近海底拖網(wǎng)的重要漁獲物之一。目前，已有不少關(guān)于中國團扇鰩生長特性、肌肉水分、灰分與能值、年齡結(jié)構(gòu)、生長特性、肝臟的生化組成以及鰩類的系統(tǒng)進化等研究報道[21-23]。2018 年，Chen 等[24]對采自浙江舟山近海的中國團扇鰩進行了詳細的形態(tài)描述和DNA 條形碼分析，這是目前關(guān)于中國團扇鰩在中國境內(nèi)的最北記錄。中國團扇鰩系暖溫性沿岸魚類，在臺灣海峽以北分布數(shù)量并不多。由于其活動力差，僅能利用其強壯尾部左右擺動前進，故常蟄伏于近海底層，通過傳統(tǒng)漁業(yè)調(diào)查方式采集樣品存在較大難度。因此，使用eDNA 分析技術(shù)能夠更加有效地探測中國團扇鰩的潛在分布區(qū)及生物量。目前，國內(nèi)外尚未見關(guān)于中國團扇鰩eDNA 分析方面的研究報道。本研究嘗試使用eDNA 定量檢測技術(shù)，探討該技術(shù)用于中國團扇鰩監(jiān)測方面的可行性。通過建立和檢驗中國團扇鰩的特異性引物和TaqMan 探針，以監(jiān)測舟山近海中國團扇鰩的分布與生物量。本研究將為其他海域的中國團扇鰩資源eDNA 追蹤監(jiān)測奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

采樣地點位于浙江省舟山市朱家尖東沙海灘附近(圖1)。中國團扇鰩樣品主要委托當?shù)貪O民采集。采集方式為定置網(wǎng)(采樣位點處于朱家尖東沙風景區(qū)，該海域禁止拖網(wǎng)作業(yè))。eDNA 水樣主要由作者采集完成。采樣時間分別為2017 年12 月19 日、2018 年4 月13 日 和2018 年7 月14 日。使用6 個體積為5 L 的礦泉水瓶進行取樣，采樣前用濃度為0.1%的次氯酸鈉溶液對礦泉水瓶進行消毒處理，并取等量的純凈水作為陰性對照。水樣采集過程中測量海水表層溫度，并觀測取樣點的底質(zhì)。實驗過程中操作人員嚴格遵守浙江海洋大學動物實驗倫理規(guī)范，并按照浙江海洋大學動物實驗倫理委員會制定的規(guī)章制度執(zhí)行。

圖1 中國團扇鰩采樣站位圖Fig.1 Stations of P.sinensis and water samples

1.2 DNA 提取及PCR 擴增驗證

采用苯酚-氯仿方法從中國團扇鰩肌肉中提取DNA。使用硬骨魚類細胞色素c 氧化酶亞基I基因(COI)通用引物F1(5′-TCAACCAACCACA AAGACATTGGCAC-3 ′)、R1(5 ′-TAGACTTCTG GGTGGCCAAAGAATCA-3′)進行PCR 擴增[25]。反應(yīng)體系：DNTPs 2 μL (2.5 μmol/L)，10×buffer(含Mg2+) 2.5 μL，rTaq0.15 μL(5 U/μL)，上下游引物各1 μL(10 μmol/L)，DNA 模板1 μL(50 ng)，超純水補齊總體積至25 μL。反應(yīng)程序：95 °C 預(yù)變性5 min;40 次循環(huán)過程為95 °C 變性30 s，58 °C退火30 s，72 °C 延伸30 s，最終在72 °C 延伸10 min 后于4 °C 保存。PCR 產(chǎn)物質(zhì)量采用1%瓊脂糖凝膠電泳法來檢測，挑選電泳條帶單一且明亮的PCR 產(chǎn)物送至生工生物工程(上海)股份有限公司進行雙向測序。測得的序列使用SeqMan 軟件進行拼接、比對及人工手動校對，得到準確的中國團扇鰩COI 基因片段序列。

1.3 中國團扇鰩特異性引物及探針的設(shè)計和驗證

在中國近海，中國團扇鰩的科內(nèi)近緣種僅湯氏團扇鰩(P.tangi)一種，因此本實驗采用湯氏團扇鰩作為驗證物種。使用Primer Express 3.0 軟件基于中國團扇鰩標準COI 片段進行特異性引物與TaqMan 探針的設(shè)計。設(shè)計好的引物和探針由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。TaqMan 探針5′端使用FAM (熒光素) 進行標記，3′端用TAMRA進行修飾。使用實時熒光定量PCR (quantitative real-time PCR,qPCR)驗證引物和探針的特異性。

qPCR 反應(yīng)體系采用20 μL 體系：Premix ExTaq10 μL，正反向引物各0.4 μL (10 μmol/L)，DNA模板2 μL (50 ng)，探針0.4 μL(10 μmol/L)，超純水補齊至20 μL。擴增反應(yīng)程序：預(yù)變性94 °C 10 s；94 °C 5 s，60 °C 23 s，45 個循環(huán)。qPCR 擴增儀器為ThermoFisher 7300 Plus Real-Time PCR System。

1.4 eDNA 提取及定量檢測

由于舟山近海水體較為渾濁，因此使用優(yōu)化后的方案提取eDNA。具體提取步驟：使用直徑47 mm、孔徑0.45 μm 的醋酸纖維素濾膜(上海興亞)抽濾，將eDNA 富集到濾膜表面。將濾膜使用錫箔紙包裹后放入凍存管，置于-80 °C 保存。同時抽濾等體積的純凈水作為陰性對照。使用DNeasy Blood and Tissue Kit 試劑盒進行eDNA 提取，隨后用酶標儀及iQuantTM BR dsDNA Quantitation Kit (0.05～1 000 ng/μL)核酸定量檢測試劑盒測定其質(zhì)量濃度。對提取的eDNA 樣品使用QuantStudioTM3D 數(shù)字PCR 儀進行eDNA 定量分析。反應(yīng)體系與“中國團扇鰩特異性引物及探針的設(shè)計和驗證”中qPCR 驗證相同。熱循環(huán)條件：50 °C 孵育2 min 進行UNG 酶激活，95 °C 預(yù)變性2 min，45 次循環(huán)過程為95 °C 變性5 s，60 °C 退火/延伸23 s。對于濃度極低的水樣，模板eDNA量加倍(由2 μL 增加到4 μL)后進行擴增。將反應(yīng)體系加入電子芯片后進行油封并壓緊，隨后放入反應(yīng)箱進行PCR 擴增，最后直接用芯片讀取eDNA 濃度。

1.5 數(shù)據(jù)分析

使用SPSS 18.0 軟件對水樣eDNA 濃度與采樣點、采樣時間進行差異顯著性分析。

2 結(jié)果

2.1 中國團扇鰩定置網(wǎng)樣品采集情況

“2018 年4 月14 日—2018 年7 月14 日”期間共采集到中國團扇鰩21 尾，日均采集樣品數(shù)最高，為0.228 2 尾/d?！?017 年10 月1 日—2017 年12月19 日”期間共采集到12 尾樣品，日均樣品數(shù)約為0.104 3 尾?！?017 年12 月20 日—2018 年4 月13 日”期間僅采集中國團扇鰩5 尾，在3 個時間段中漁獲尾數(shù)最少 (表1)。

表1 中國團扇鰩樣品采集信息Tab.1 Sampling information of P.sinensis

多數(shù)采樣點底質(zhì)為礁石和細沙。A、D 兩點較為特殊，分別為碎礫、礁石與細沙(圖1)。7 月水溫最高且均大于26 °C，12 月和4 月水溫差異不大，在15～16 °C 波動。采樣水溫及采樣點底質(zhì)具體信息如表2 所示。

表2 采樣時的水溫及采樣點質(zhì)地Tab.2 Water temperature and sediment information of sampling stations

2.2 中國團扇鰩特異性引物和探針及其驗證

通過中國團扇鰩與湯氏團扇鰩COI 基因片段序列比對，設(shè)計的特異性引物和探針位于中國團扇鰩線粒體基因組2 636～2 769 bp 位置處 (圖2)。包括引物在內(nèi)的擴增片段大小為134 bp，其引物為ZF-F-2636: 5 ′-GCAGGAGCTTCTGTGGACT-TAACTATT-3′、ZR-F-2769: 5′-ACATCTAGCGGGAGTCTCTTCCATTCTG-3′，探針為Zpro-2671:FAM-ACATCTAGCGGGAGTCTCTTCCATTCTGTAMRA (表3)。

表3 中國團扇鰩特異性引物、探針信息Tab.3 Information of specific primers and probe of P.sinensis

圖2 中國團扇鰩引物、探針序列與湯氏團扇鰩堿基差異情況Fig.2 Nucleotide variation of primers and probe between P.sinensis and P.tangi

經(jīng)qPCR 擴增驗證，中國團扇鰩特異性引物和探針僅對中國團扇鰩樣品出現(xiàn)強熒光信號，表現(xiàn)為陽性擴增，而其近緣種湯氏團扇鰩和空白對照均未獲得擴增，表現(xiàn)為陰性。qPCR 驗證的Ct值見表4。上述結(jié)果表明，本研究所設(shè)計的引物與探針具有高度的特異性，可用于舟山近海中國團扇鰩的檢測和區(qū)分。

表4 基于熒光定量PCR 的中國團扇鰩引物、探針特異性驗證結(jié)果Tab.4 Specificity verification results of primers and probes of P.sinensis by qPCR

2.3 數(shù)字PCR 定量結(jié)果

數(shù)字PCR 監(jiān)測結(jié)果顯示，于2018 年7 月14日采集的水樣中檢測到的eDNA 濃度最高，其次是2017 年12 月19 日采集的水樣(表5)。于2018年4 月13 日期間采集的水樣中，僅在少數(shù)站位檢出中國團扇鰩eDNA，且濃度較低(圖3)。

表5 不同采樣點的中國團扇鰩eDNA 濃度Tab.5 eDNA concentration of P.sinensis from different stations

圖3 不同時間、不同地點的中國團扇鰩eDNA 濃度橫坐標數(shù)字代表采樣位點：1.A，2.B1，3.B2，4.C1，5.C2，6.D。Fig.3 eDNA concentration of P.sinensis at different time and stationsThe numbers in the horizontal coordinates represent the sampling sites:1.A,2.B1,3.B2,4.C1,5.C2,6.D.

2.4 顯著性分析

同一時間不同采樣點對中國團扇鰩eDNA濃度的影響 單因子方差分析結(jié)果顯示，2017年12 月19 日、2018 年4 月13 日、2018 年7 月14 日A、B1、B2、C1、C2、D 等6 個采樣點之間的eDNA 分子拷貝數(shù)之間皆存在極顯著差異(表6)。

表6 各采樣點間eDNA 濃度差異顯著性分析Tab.6 Significance analysis of eDNA concentration difference among each sampling stations

同一采樣點在不同采樣時間內(nèi)的差異使用單因素方差分析同一采樣點在不同采樣時間內(nèi)的差異結(jié)果如表7 所示。除A 采樣點外，其余4 個采樣點在3 個采樣時間組間均存在極顯著差異。上述顯著性分析表明，季節(jié)和采樣點底質(zhì)可能是影響中國團扇鰩eDNA 濃度的因素。

表7 不同采樣時間eDNA 濃度差異顯著性分析Tab.7 Significance analysis of eDNA concentration difference among different sampling date

3 討論

3.1 中國團扇鰩的特異性引物和探針

使用特異性引物和探針監(jiān)測單一物種是eDNA 技術(shù)重要的應(yīng)用之一。相比于擴增序列非特異性檢測方法(如SYBR green I 染料法)，特異性檢測方法(如使用TaqMan 探針)具有更強的特異性和更高的穩(wěn)定性，能夠更好地排除假陽性結(jié)果的產(chǎn)生[26]。目前基于TaqMan 探針的eDNA 檢測技術(shù)已被廣泛應(yīng)用于各類水生生物。Ficetola 等[27]對入侵物種美國牛蛙(Rana catesbeiana)的研究表明，即使目標水域內(nèi)的牛蛙數(shù)量很少，亦可通過eDNA 方式將其檢測出來，并且首次證明了eDNA 方法在水生生態(tài)系統(tǒng)進行研究的可行性。Tillotson 等[28]使用TaqMan 探針在小溪中發(fā)現(xiàn)了eDNA 濃度與紅鮭(Oncorhynchus nerka)豐度之間存在強烈的定量關(guān)系。Knudsen 等[29]針對大西洋鯡(Clupea harengus)、大西洋鱈(Gadus morhua)、歐洲比目魚(Platichthys flesus)、歐洲鰈(Pleuronectes platesa)和大西洋鯖(Scomber scombrus)開發(fā)和測試了TaqMan 探針，并成功應(yīng)用于這些物種在波羅的海的檢測。李苗等[30]在建立和優(yōu)化使用eDNA 檢測技術(shù)評估中國明對蝦 (Fenneropenaeus chinensis) 生物量時也建議采用TaqMan 探針法。最近，Wang 等[9-11]使用TaqMan 探針在東海成功監(jiān)測到大黃魚、小黃魚以及入侵物種—眼斑擬石首魚(Sciaenops ocellatus)的分布。本研究中，將中國團扇鰩和湯氏團扇鰩的COI 序列進行比對，設(shè)計了中國團扇鰩的特異性引物和TaqMan 探針。在引物探針的特異性驗證過程中，僅有中國團扇鰩樣品檢測出陽性信號。表明所設(shè)計的引物和TaqMan 探針有效，可用于舟山近海中國團扇鰩資源的定性與定量檢測。

3.2 eDNA 檢測技術(shù)的高靈敏度

本實驗使用eDNA 定量檢測技術(shù)，證明了該技術(shù)用于中國團扇鰩資源監(jiān)測的可行性。根據(jù)中國團扇鰩定置網(wǎng)樣品采集情況，推測舟山近海中國團扇鰩資源量較少。定置網(wǎng)A、B、C 等3 個采樣點的最大捕獲量為92 d21 尾，平均每天0.228 3尾。但eDNA 定量分析結(jié)果仍成功檢測出了中國團扇鰩陽性信號。eDNA 定量檢測技術(shù)在目標物種密度較低的情況下具有很高的靈敏度。這與已有的eDNA 定量檢測結(jié)果一致[31-34]。然而，eDNA定量檢測技術(shù)的高靈敏度是有限度的。2018 年7月14 日，定置網(wǎng)A 中出現(xiàn)一尾重量為370.6 g 的中國團扇鰩，ddPCR 檢測卻并沒有檢出中國團扇鰩eDNA 的存在。水體中的eDNA 分子可能受到了水體體積、水體流速、水樣采集點與定置網(wǎng)距離等諸多因素的影響，導致水樣中未能采集到中國團扇鰩eDNA 分子。

3.3 棲息環(huán)境對中國團扇鰩分布的影響分析

底質(zhì)對中國團扇鰩的分布影響顯著。本次實驗進行了3 個時間點的樣品采集。A 點3 次取樣都未能檢測到水體中存在中國團扇鰩eDNA，該點是中國團扇鰩的一個“盲區(qū)”。單因子方差分析結(jié)果顯示，A、B1、B2、C1、C2、D 6 個采樣點之間的eDNA 分子拷貝數(shù)存在極顯著差異。造成A 點中國團扇鰩數(shù)量較少的原因，可能是因為A點的底質(zhì)以“礁石、碎礫”為主(肉眼可見)，而其他采樣點雖有礁石，但卻有面積較大的細沙。表明中國團扇鰩對棲息環(huán)境存在不同喜好，這與已報道的中國團扇鰩的“喜沙”生態(tài)習性相一致[35]。

水深對中國團扇鰩的分布亦有影響。B1、B2、C1、C2、D 5 個采樣點中，以D 點的泥沙數(shù)量最多、粒徑最細，但該點的eDNA 分子拷貝數(shù)卻并非最高—B2、C2 2 處的eDNA 濃度都高于或略高于該點。造成這種現(xiàn)象的原因，很可能是D 點的水深較淺(30～50 cm)，而B2、C2 采樣點由于離沙灘較遠，導致水下坡度急劇增大，說明中國團扇鰩會尋找泥沙和水深的最適點。有研究表明，中國團扇鰩主要棲息于水深60 m 的海底[33-34]。本研究雖然在近岸水域發(fā)現(xiàn)并捕撈到中國團扇鰩個體，但并未對其他水深區(qū)域進行eDNA 調(diào)查，離岸較遠的深水區(qū)可能有更多數(shù)量的中國團扇鰩分布。

中國團扇鰩具有喜溫性。同一采樣點不同采樣時間內(nèi)的差異分析表明，除A 點外，其余5 個eDNA 采樣點中的任意一點在2017 年12 月19 日、2018 年4 月13 日、2018 年7 月14 日3 個時間組間均存在顯著差異。這意味著季節(jié)對中國團扇鰩的分布具有極顯著的影響。該特點在C2 點表現(xiàn)得尤為典型：4 月海水表面溫度最低時(15.7 °C)，其eDNA 濃度低于檢測極限；而7 月水溫較高時(26.6 °C)時，其eDNA 濃度高達(122.0 ± 14.1) 個/4 μL。定置網(wǎng)結(jié)果與eDNA 結(jié)果比較相似，均表明在“2017 年12 月20 日—2018年4 月13 日”冬季到初春期間海水溫度的降低，造成了中國團扇鰩數(shù)量的減少。

近年來，全球變暖影響了許多魚種原有的棲息環(huán)境[36-38]，使得許多魚類的分布范圍發(fā)生變動[39-42]。此外，黑潮暖流也是影響中國近海魚類分布的重要因素[43-45]，不同的水流和水團具有不同的溫度和鹽度特征，從而影響魚類的洄游[46]。這些因素可能是中國團扇鰩向北遷移的重要原因。本研究中，基于樣品采集和環(huán)境DNA 兩種調(diào)查方式，證實了中國團扇鰩在舟山海域3 個季節(jié)的存在，表明舟山海域環(huán)境適合于該魚種棲息。盡管舟山是目前為止記錄中國團扇鰩分布的最北界[35]，但由于中國團扇鰩對棲息環(huán)境具有偏好性以及其他環(huán)境因素的存在，長江徑流、蘇北淺灘[47-49]等水流、底質(zhì)環(huán)境因素是否會影響中國團扇鰩在舟山以北的分布尚不得而知，需要進一步研究。

感謝舟山朱家尖東荷嘉園賀敏光先生幫助采樣。

（作者聲明本文無實際或潛在的利益沖突）