蘇 芳,付之光,方文燦,王 瑩,賀明娟,張永彬

非酒精性脂肪肝病與炎癥反應、胰島素抵抗等密切相關[1,2],目前對于非酒精性脂肪肝病尚缺乏有效的治療手段[3]。骨髓作為成人的造血器官對于維持人類生存健康發(fā)揮重要作用,近年發(fā)現(xiàn)骨髓組織也具有內(nèi)分泌功能,例如骨髓單核巨噬細胞分泌的髓源性生長因子(myeloid-derived growth factor,MYDGF)具有改善糖脂代謝紊亂的作用[4,5]。因此,本研究進一步探索MYDGF對2型糖尿病小鼠胰島素抵抗及肝臟炎性反應的影響及其信號機制。

1 材料與方法

1.1 主要材料、試劑與儀器 4周齡雄性SPF級C57小鼠30只(北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司),高脂飼料(北京華阜康生物科技有限公司),普通維持飼料(蘇州雙獅實驗動物飼料科技有限公司)。蘇木素伊紅(HE)染色試劑盒(索萊寶,北京);腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α, TNF-α)與白細胞介素6(interleukin-6, IL-6)試劑盒(達科維生物,上海);超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD),谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase, GSH-Px)與過氧化氫酶(Catalase)試劑盒(建成生物,南京);磷酸化(p)-IKKβ(Ser176/180)一抗(稀釋比例,1∶1000;#2697),IKKβ一抗(稀釋比例,1∶1000;#2684),p-IkBα(Ser32)(稀釋比例,1∶1000;#2859),IkBα一抗(稀釋比例,1∶1000;#9242)與GAPDH 一抗(稀釋比例,1∶3000;#5174)均購自美國Cell Signaling Technology公司。

7160 型全自動生化儀(日立,日本);340型酶聯(lián)儀(BDSL,英國);r-911型全自動放免儀(中國科技大學實業(yè)總公司,中國);DYY-7C型電泳儀、DYCZ-40型轉(zhuǎn)膜儀(六一儀器,北京);ZPJ-1A型展片機、KPJ-1A 型烤片機(天利航空機電,天津)。

1.2 方法

1.2.1 重組MYDGF蛋白腺相關病毒載體構(gòu)建 以pHBAAV-CMV-MCS-3flag-T2A-ZsGreen質(zhì)粒作為 MYDGF基因的載體(基因序列NM_080837.2),然后與pAAV-RC和pHelper共轉(zhuǎn)染至AAV-293細胞。rAAV的大規(guī)模制備、純化、鑒定、滴度測定等參照文獻[5]。

1.2.2 糖尿病建模與標本取材 20只C57小鼠給予高脂飼料喂養(yǎng)4周,按照文獻[6]方法進行糖尿病造模,其中10只接受AAV-GFP(1×1012VP)骨髓腔注射,為糖尿病組(DM);10只接受AAV-MYDGF(1×1012VP[6])骨髓腔注射,為MYDGF干預糖尿病組(MYDGF)。另取10只C57小鼠,普通維持飼料喂養(yǎng),4周后骨髓腔注射等量生理鹽水,定義為對照組。所有小鼠繼續(xù)采用相應飼料喂養(yǎng)12周后,腹腔注射戊巴比妥鈉溶液(60 mg/kg)麻醉取材。(1)血清標本:體式顯微鏡下使用BD針抽盡小鼠后腔靜脈血液,注入一次性黃蓋促凝采血管,取上層血清,-80 ℃凍存?zhèn)溆谩?2)肝臟標本:肝組織分別裝入4 ℃預冷的試管、-80 ℃凍存、4%多聚甲醛溶液常溫固定。

1.2.3 血液學指標檢測 -80 ℃凍存的血清,全自動生化儀檢測血糖(fasting blood glucose, FBG)水平,放射免疫法檢測胰島素水平,胰島素抵抗指數(shù)(homeostasis model assessment-insulin resistance,HOMA-IR)= FBG×胰島素水平/22.5。酶聯(lián)免疫吸附試驗檢測TNF-α和IL-6。

1.2.4 肝臟抗氧化酶檢測 取新鮮肝臟組織低溫磨碎,按試劑盒要求檢測SOD,GSH-Px和Catalase的酶量。

1.2.5 HE染色 肝臟組織固定1 周,經(jīng)過脫水、透明、浸蠟、包埋,制作成石蠟切片后進行HE染色。

1.2.6 IKKβ/IκBα信號途徑的Western blot檢測 取出凍存的肝臟組織(50 mg),加入500 μl RIPA裂解液(含PMSF),勻漿,充分裂解后離心(4 ℃,12000 g,15 min),取上清液,測定總蛋白濃度,Western blot常規(guī)方法[7-9],以GAPDH為內(nèi)參,測定各組小鼠肝臟中的目的蛋白水平。所有實驗步驟至少重復3次。

2 結(jié) 果

2.1 MYDGF對糖尿病小鼠胰島素抵抗指數(shù)的影響 與對照組比較,DM組小鼠空腹血糖、胰島素與胰島素抵抗指數(shù)均顯著升高,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。而MYDGF干預明顯降低小鼠空腹血糖、胰島素與胰島素抵抗指數(shù),與DM組相比差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05,表1)。

表1 MYDGF對糖尿病小鼠胰島素抵抗指數(shù)的影響

2.2 MYDGF對糖尿病小鼠血清炎性因子濃度的影響 小鼠血清炎性因子濃度如表2所示:與對照組比較,DM組小鼠血清中TNF-α與IL-6濃度均顯著升高,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。而MYDGF干預可以在某種程度上降低血清炎性因子的濃度,與DM組相比差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

表2 MYDGF對糖尿病小鼠血清炎性因子濃度的影響

2.3 MYDGF對糖尿病小鼠肝臟抗氧化酶含量的影響 小鼠肝臟抗氧化酶系如表3所示:與對照組比較,DM組小鼠肝臟SOD、GSH-Px與Catalase酶含量均顯著降低,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。而MYDGF干預能不同程度地升高糖尿病小鼠肝臟抗氧化酶的含量,與DM組相比差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

表3 MYDGF對糖尿病小鼠肝臟抗氧化酶含量的影響

2.4 MYDGF對糖尿病小鼠肝臟病理解剖結(jié)構(gòu)的影響 HE染色結(jié)果如圖1所示:對照組小鼠肝臟細胞排列整齊、質(zhì)核結(jié)構(gòu)清晰,極少炎性細胞浸潤;DM組肝臟大量炎性細胞浸潤,肝細胞排列紊亂、脂肪變性;而MYDGF干預減輕肝細胞脂肪變性,減少肝臟炎性細胞浸潤。

2.5 MYDGF對肝臟IKKβ/IκBα信號通路的影響 Western blot結(jié)果如圖2所示,與對照組比較,DM組肝細胞IKKβ[ p-IKKβ: IKKβ, (1.39±0.11)vs.(1.00±0.09)]和IκBα[p-IκBα:IκBα, (1.44±0.06)vs.(1.00±0.08)]磷酸化水平明顯升高,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。而MYDGF干預顯著降低IKKβ[ p-IKKβ:IKKβ,(0.97±0.10)vs.(1.39±0.11)]和IκBα[p-IκBα:IκBα,(0.93±0.07)vs.(1.44±0.06)]的磷酸化水平。以上實驗結(jié)果說明,IKKβ/IκBα信號通路至少部分介導了MYDGF緩解糖尿病小鼠肝臟炎性反應的作用。

圖2 MYDGF對糖尿病小鼠肝臟IKKβ/IκBα信號通路的影響

3 討 論

炎癥反應在非酒精性脂肪肝病的發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮著重要作用[10, 11],炎癥反應促進肝臟脂質(zhì)合成,加速非酒精性脂肪肝病的惡化[12],而抑制炎癥反應可有效延緩非酒精性脂肪肝病的進展[13]。因此,抗炎治療越來越受到重視。本研究發(fā)現(xiàn),無論全身整體炎癥標志物TNF-α與IL-6,還是肝臟局部炎性細胞浸潤在糖尿病狀態(tài)下都明顯加重,而MYDGF干預緩解全身與局部的炎癥反應。

對于炎癥相關信號通路,本研究探究了經(jīng)典的NF-κB信號途徑。當炎癥因子與細胞受體結(jié)合后可引起后者構(gòu)型發(fā)生改變,進而磷酸化激活IκBα激酶IKK,可使IκBα磷酸化并進一步被蛋白酶體識別降解。于是NF-κB得以從胞質(zhì)中的NF-κB/IκBα復合體中釋放出來并活化[14]、暴露核定位域,迅速進行核轉(zhuǎn)位,NF-κB入核后即啟動炎癥基因的轉(zhuǎn)錄表達。本研究探究了NF-κB信號的上游途徑IKK/IκBα通路,結(jié)果發(fā)現(xiàn)高糖狀態(tài)磷酸化激活IKK/IκBα信號通路,而MYDGF干預抑制IKK/IκBα信號通路,從而間接證明了MYDGF干預抑制糖尿病小鼠肝臟NF-κB炎癥信號。肝臟NF-κB炎癥信號途徑介導合成NO,TNF-α和IL-6等炎癥因子,級聯(lián)放大的炎癥信號可導致產(chǎn)生或者加重胰島素抵抗[15]。本研究表明,MYDGF干預抑制糖尿病小鼠炎癥反應并緩解胰島素抵抗。最近有研究發(fā)現(xiàn),蛋白激酶PKCθ與肝細胞IKKβ磷酸化密切相關[7],MYDGF對糖尿病小鼠肝臟PKCθ蛋白的調(diào)節(jié)作用值得深入研究。

與炎癥反應一樣,氧化應激是非酒精性脂肪肝病發(fā)生、發(fā)展的另一重要病理基礎[16-18]。而炎癥反應與氧化應激之間存在密切關系,炎癥反應可導致肝臟抗氧化酶SOD、GSH-Px和Catalase酶含量降低,而氧化應激會進一步加重炎癥反應[19]。本研究發(fā)現(xiàn),MYDGF干預升高糖尿病小鼠肝臟抗氧化酶SOD、GSH-Px和Catalase酶含量,降低的肝臟氧化應激可能有助于間接緩解炎癥反應。

MYDGF緩解肝臟炎癥反應及胰島素抵抗,此作用可能與抑制肝臟IKK/IκBα信號通路有關。骨髓作為造血器官亦能通過內(nèi)分泌MYDGF調(diào)節(jié)肝臟糖脂代謝,MYDGF有望成為治療非酒精性脂肪肝病、糖尿病等疾病的潛在靶點。