雷嘉輝，羅 斌，孫小慶，張宇佳，胡筱琴，藍(lán) 芳，吳 堯

（1. 四川大學(xué)國(guó)家生物醫(yī)學(xué)材料工程技術(shù)研究中心，2. 分析測(cè)試中心, 成都 610064）

隨著現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的進(jìn)步，鈦種植體由于能恢復(fù)牙齒美觀(guān)與咀嚼功能，已成為牙齒缺失患者的首選治療方法之一，因此對(duì)于鈦種植體置換的需求也日益增加. 當(dāng)鈦種植體植入牙床后，宿主蛋白能夠非特異性吸附在鈦種植體表面并引發(fā)異物反應(yīng). 同時(shí)，異物植入引起的過(guò)度炎癥反應(yīng)會(huì)導(dǎo)致骨融合不良和鈦種植體失效［1～4］. Li等［5］將納米二氧化鈰涂覆在鈦種植體表面，通過(guò)調(diào)控納米二氧化鈰的微觀(guān)形貌來(lái)消除鈦種植體引發(fā)的炎癥反應(yīng). Chen等［6］將硅烷化抗菌肽GL13K固定在鈦片表面，發(fā)現(xiàn)其對(duì)M1型巨噬細(xì)胞有抑制作用，能有效降低炎癥反應(yīng). Yang 等［7］將超支化聚L-賴(lài)氨酸共價(jià)接枝在鈦基種植體表面，發(fā)現(xiàn)種植體在早期具有良好的抗炎能力，并能有效促進(jìn)骨融合. 因此，在鈦種植體表面進(jìn)行生物功能化改性對(duì)促進(jìn)骨融合和防止鈦種植體失效至關(guān)重要. 由于磷脂雙分子層中豐富的兩性離子以及糖蛋白的空間位阻，細(xì)胞膜可提供優(yōu)良的防生物污染性能［8］. 此外，特定的細(xì)胞膜表面標(biāo)記物可提供特有的生物學(xué)功能，如紅細(xì)胞膜表面豐富的CD47受體與巨噬細(xì)胞表面的信號(hào)調(diào)節(jié)蛋白α受體的相互作用能夠有效減輕炎癥反應(yīng)［9］. 巨噬細(xì)胞是參與免疫調(diào)控過(guò)程最重要的免疫細(xì)胞之一，其中M2型巨噬細(xì)胞在抗炎、 組織重塑和前愈合過(guò)程中扮演著重要角色［10～13］. 因此，開(kāi)發(fā)M2型巨噬細(xì)胞膜涂層的鈦種植體有望解決生物污染和消除炎癥反應(yīng)等問(wèn)題.

最近，有報(bào)道通過(guò)反復(fù)浸入干燥的方法將細(xì)胞膜簡(jiǎn)單地包覆于植入電極表面，植入電極可展現(xiàn)出良好的生物相容性［14］. Tao等［15］直接將豬源透明軟骨浸入細(xì)胞膜溶液中，制得細(xì)胞膜包被的軟骨，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示其可顯著消除炎癥反應(yīng). 然而，上述細(xì)胞膜涂層制備技術(shù)存在效率低和穩(wěn)定性差等問(wèn)題. 鈦種植體的骨融合是一個(gè)長(zhǎng)期的過(guò)程，需要鈦種植體涂層具有良好的穩(wěn)定性和生物相容性以滿(mǎn)足愈合的需要［16］. 因此，急需開(kāi)發(fā)穩(wěn)定、 均勻且簡(jiǎn)便的細(xì)胞膜涂層的制備方法，這將有利于細(xì)胞膜包覆的鈦種植體的長(zhǎng)期有效性［17］.

受貽貝啟發(fā)，多巴胺在弱堿性環(huán)境下發(fā)生自聚，生成含有大量鄰苯二酚結(jié)構(gòu)的聚多巴胺，使其可以吸附在幾乎任何固體物質(zhì)的表面，形成聚多巴胺層. 其可作為反應(yīng)“橋梁”，通過(guò)邁克爾加成或希夫堿反應(yīng)在材料表面引入其它功能性基團(tuán). 石墨烯因其在材料科學(xué)和生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的重要應(yīng)用前景，被認(rèn)為是一種革命性的材料［18～21］. 研究發(fā)現(xiàn)，石墨烯納米片與磷脂分子間存在極強(qiáng)的相互作用力，石墨烯納米片可以直接從活細(xì)胞中剝離出細(xì)胞膜. 在本課題組的前期工作中，采用層層自組裝技術(shù)將石墨烯納米片固定在磁性納米粒子表面，然后通過(guò)納米粒子與白細(xì)胞共孵育，將白細(xì)胞膜修飾于納米粒子表面［22］. 因此，結(jié)合聚多巴胺和石墨烯的優(yōu)勢(shì)，有望在鈦種植體表面制備出理想的細(xì)胞膜涂層［23，24］.

基于此，本文提出了一種在鈦種植體表面簡(jiǎn)便制備穩(wěn)定且均勻的細(xì)胞膜涂層的策略（Scheme 1）.首先，通過(guò)聚多巴胺將石墨烯納米片均勻地修飾在鈦種植體表面，然后借助氧化石墨烯層剝離M2型巨噬細(xì)胞膜，制得M2型巨噬細(xì)胞膜包覆的鈦種植體. 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，聚多巴胺和石墨烯的有機(jī)結(jié)合可在宏觀(guān)水平上顯著提高M(jìn)2型巨噬細(xì)胞膜涂層的穩(wěn)定性和均勻性. 與傳統(tǒng)的細(xì)胞膜涂層制備方法相比，該策略具有簡(jiǎn)便、 高效和穩(wěn)定等優(yōu)勢(shì). 所制備的M2型巨噬細(xì)胞膜涂層具有細(xì)胞膜的生物功能，包括良好的生物相容性和抗蛋白非特異性吸附能力. 同時(shí)，在微觀(guān)層面上，可以調(diào)控巨噬細(xì)胞極化為M2型，在免疫調(diào)控方面具有消除炎癥和促進(jìn)組織修復(fù)的潛力. 本文提出的石墨烯介導(dǎo)的巨噬細(xì)胞膜涂層的制備策略有望成為一個(gè)在宏觀(guān)水平上擴(kuò)展細(xì)胞膜功能的材料制備平臺(tái)，并在植入材料領(lǐng)域展現(xiàn)出廣闊的應(yīng)用前景.

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑與儀器

鹽酸多巴胺（純度≥98%），上海麥克林生化科技有限公司； 丙酮（純度≥99.8%）、 三羥甲基氨基甲烷（Tris，化學(xué)純）、 多聚甲醛（化學(xué)純）、 乙二醇辛基苯基醚（TritonX-100）和脂多糖（LPS），成都默克有限公司； 無(wú)水乙醇（分析純），成都市科隆化學(xué)有限公司； 單層氧化石墨烯（分析純），蘇州碳豐石墨烯科技有限公司； 白介素4（IL-4），蘇州派普泰克生物科技有限公司； 高糖培養(yǎng)基（DMEM）、 胎牛血清（FBS）、 青霉素與鏈霉素（Penicillin-Streptomycin）和磷酸鹽緩沖液（PBS），上海賽默飛世爾科技有限公司； 綠色細(xì)胞膜熒光染料（Dio），上海碧云天生物科技有限公司； 一抗（Anti-Mannose Receptor），鹽城市菲亞生物科技有限公司； 羊抗小鼠二抗（Goat Anti-Mouse IgG H＆L）、 羊抗兔二抗（Goat Anti-Rabbit IgG H＆L），成都正能生物科技有限公司； 牛血清白蛋白（FITC-BSA）和人血清白蛋白（FITC-HAS），西安瑞禧生物科技有限公司； SYBR Green Pro Taq HS 預(yù)混型qPCR 試劑盒，揚(yáng)州艾瑞克生物科技有限公司；FDA/PI雙染細(xì)胞毒性檢測(cè)試劑盒，貝博生物科技有限公司.

Zeiss ZS880型激光共聚焦顯微鏡（LSCM），德國(guó)Zeiss公司； Leica DMi8型倒置熒光顯微鏡，上海徠卡顯微系統(tǒng)貿(mào)易有限公司； HORIBA S-4800 型掃描電子顯微鏡（SEM），蘇州塞恩斯儀器有限公司；TY-SDJ80 型水接觸角測(cè)量?jī)x，濰坊天研儀器有限公司； VERTEX 70v 型傅里葉變換紅外光譜儀，上海爾迪儀器科技有限公司； Nexsa G2 型X 射線(xiàn)光電子能譜儀（XPS），上海硅儀生化科技有限公司；CIENTZ型超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)，寧波新芝生物科技股份有限公司； MILLI-Q超純水制備儀，成都默克有限公司； Centrifuge 5424R型低溫離心機(jī)，上海土森視覺(jué)科技有限公司.

1.2 實(shí)驗(yàn)過(guò)程

1.2.1 M2型巨噬細(xì)胞膜涂層的制備 攪拌條件下將21 mL去離子水（RO水）與9 mL無(wú)水乙醇混合，制得體積分?jǐn)?shù)為30%的乙醇溶液. 將90 mg氧化石墨烯分散在30 mL 30%乙醇溶液中，制得分散均勻的石墨烯分散液. 將裸鈦片（直徑14.5 mm，厚度2 mm）依次用240#，400#，800#，1000#和1200#砂紙拋光，然后在超純水（UP 水）、 丙酮、 無(wú)水乙醇和UP 水中依次超聲10 min. 將鈦片浸泡在多巴胺溶液（5 mg/mL）中，然后置于搖床上，以200 r/min的頻率振蕩反應(yīng)24 h. 用RO水洗滌2次，室溫下晾干. 將石墨烯分散液（3 mg/mL）滴加在鈦片表面，于60 ℃烘箱中烘干. 再重復(fù)一次上述過(guò)程，得到均勻的氧化石墨烯層. 采用IL-4（20 ng/mL）刺激RAW264.7細(xì)胞24 h后，用PBS緩沖溶液離心（1200 r/min）洗滌3次； 隨后將M2型巨噬細(xì)胞懸液與Ti-PDA-GO材料共振蕩孵育2 h，靜置0.5 h后用PBS緩沖溶液洗滌，最后在Ti-PDA-GO材料表面得到一層致密、 均勻且穩(wěn)定的M2型巨噬細(xì)胞膜涂層.

1.2.2 材料理化性能表征 采用掃描電子顯微鏡在20 kV 電壓下分別觀(guān)察Ti，Ti-PDA-GO 和Ti-PDAGO-M 材料的微觀(guān)形貌（觀(guān)察前需進(jìn)行噴金處理）. 使用水接觸角測(cè)量?jī)x分別測(cè)量Ti，Ti-PDA-GO 和Ti-PDA-GO-M材料的水接觸角，分析各修飾涂層的親疏水性. 采用傅里葉紅外光譜和X射線(xiàn)光電子能譜分析各修飾涂層的化學(xué)成分和結(jié)構(gòu).

1.2.3 蛋白非特異性吸附實(shí)驗(yàn) 將Ti，Ti-PDA-GO 和Ti-PDA-GO-M材料分別與0.5 mg/mL 的異硫氰酸熒光素標(biāo)記的牛血清白蛋白（FITC-BSA）和人血清白蛋白（FITC-HAS）在25 ℃下避光振蕩孵育24 h. 隨后用PBS緩沖溶液洗滌，在倒置熒光顯微鏡下觀(guān)察各材料表面的熒光信號(hào).

1.2.4 細(xì)胞培養(yǎng) 采用高糖培養(yǎng)基、 青霉素-鏈霉素（雙抗）和胎牛血清培養(yǎng)RAW264.7 細(xì)胞，所用RAW264.7 細(xì)胞代數(shù)均在2～10 代以?xún)?nèi)，置于培養(yǎng)箱中培育. 培養(yǎng)箱條件參數(shù)為37 ℃，含5% CO2的空氣，培養(yǎng)條件皆滿(mǎn)足無(wú)菌要求.

1.2.5 細(xì)胞增殖 將Ti，Ti-PDA-GO 和Ti-PDA-GO-M 材料分別與RAW264.7 在24 孔板中培養(yǎng)1，3，5和7 d（初始接種量為104個(gè)RAW264.7細(xì)胞）. 在1，3，5和7 d時(shí)，分別取出各材料，用PBS緩沖溶液洗滌后，在37 ℃下用二乙酸熒光素（FDA）染色15 min，再用PBS緩沖溶液洗滌，在共聚焦顯微鏡下觀(guān)察各材料表面的熒光信號(hào).

1.2.6 M2型巨噬細(xì)胞膜涂層穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 采用Dio 對(duì)M2型巨噬細(xì)胞進(jìn)行預(yù)染色. 用預(yù)染后的M2型巨噬細(xì)胞膜制備Ti-PDA-GO-M材料，然后在PBS緩沖溶液中浸泡14 d. 分別在1，5和14 d時(shí)取出，用PBS緩沖溶液洗滌后，在倒置熒光顯微鏡下觀(guān)察Ti-PDA-GO-M材料表面的熒光信號(hào).

1.2.7 實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) 將RAW264.7 細(xì)胞接種到24 孔板中（初始接種量為5×105個(gè)RAW264.7細(xì)胞），分別與Ti，Ti-PDA-GO和Ti-PDA-GO-M材料共孵育24 h（處于100 ng/mL的LPS環(huán)境中）. 利用TRIZOL法提取每個(gè)樣品表面細(xì)胞總RNA，隨后逆轉(zhuǎn)錄為cDNA. 根據(jù)設(shè)計(jì)的引物，按照試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，采用實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)檢測(cè)細(xì)胞表面促炎因子和抗炎因子的表達(dá).

1.2.8 免疫熒光蛋白實(shí)驗(yàn) 將RAW264.7 細(xì)胞接種到24 孔板中（初始接種量為5×105個(gè)RAW264.7 細(xì)胞），分別與Ti，Ti-PDA-GO 和Ti-PDA-GO-M 材料共孵育24 h. 其中一組處于含100 ng/mL 脂多糖的環(huán)境中，另一組則處于2 mg/mL 脂多糖的環(huán)境中. 隨后，在4 ℃下使用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4%的多聚甲醛固定20 min，然后用PBS 緩沖溶液洗滌2 次，再在4 ℃下用體積分?jǐn)?shù)為0.1% 的triton X-100（免疫染色通透液）透膜，用PBS緩沖溶液洗滌2次，置于質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4%的牛血清白蛋白溶液中，室溫下孵育10 min，在4 ℃下采用一抗孵育12 h，用PBS 緩沖溶液洗滌. 在37 ℃下采用二抗孵育1 h 后用 PBS 緩沖溶液洗滌，隨后在室溫下用細(xì)胞核染料（DAPI）染色5 min，用PBS緩沖溶液洗滌，在共聚焦顯微鏡下觀(guān)察各個(gè)材料表面的熒光信號(hào).

2 結(jié)果與討論

2.1 M2型巨噬細(xì)胞膜涂層的制備與表征

首先，經(jīng)拋光處理得到表面光滑、 潔凈的Ti片； 然后，通過(guò)多巴胺在Ti片表面自聚，形成一層聚多巴胺層，得到Ti-PDA材料； 隨后，將石墨烯分散液滴加在Ti-PDA材料表面，烘干后得到Ti-PDA-GO材料. 同時(shí)，利用IL-4 刺激RAW264.7 細(xì)胞，使其極化成M2型. 再利用石墨烯層對(duì)磷脂的強(qiáng)相互作用力，將M2型巨噬細(xì)胞膜修飾到Ti-PDA-GO 材料表面，得到Ti-PDA-GO-M 材料. 如圖1所示，首先根據(jù)側(cè)向角散射（SSC）與前向角散射（FSC）排除細(xì)胞碎片部分確定RAW264.7細(xì)胞范圍P1，隨后排除黏連體得到范圍P2，以正常培養(yǎng)RAW264.7 細(xì)胞作為空白對(duì)照組. 流式細(xì)胞術(shù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，IL-4 刺激24 h 后的RAW264.7 細(xì)胞表面蛋白CD206 有接近92.16%的陽(yáng)性率，表明超過(guò)92%的RAW264.7 細(xì)胞已極化成M2型［25，26］.

Fig.1 Flow cytometry results of RAW264.7 cells(A) and RAW264.7 cells stimulated by IL-4 for 24 h(B)

采用Dio對(duì)M2型巨噬細(xì)胞進(jìn)行預(yù)染色，將染色后的M2型巨噬細(xì)胞分別與Ti，Ti-PDA和Ti-PDA-GO材料振蕩孵育后，通過(guò)倒置熒光顯微鏡觀(guān)察各材料表面的熒光信號(hào). 由圖2（A）～（C）可見(jiàn)，與Ti-M和Ti-PDA-M材料相比，Ti-PDA-GO-M材料的綠色熒光信號(hào)最強(qiáng)，說(shuō)明石墨烯可以有效剝離M2型巨噬細(xì)胞膜并包覆在材料表面. 同時(shí)，整個(gè)視野均存在綠色熒光且熒光相對(duì)均勻，表明制備的M2型巨噬細(xì)胞膜涂層具有良好的均勻性. Image J的熒光半定量結(jié)果［圖2（D）］給出同樣的結(jié)論. 而細(xì)胞膜涂層的穩(wěn)定性是另一個(gè)關(guān)鍵因素，將Dio 預(yù)染的Ti-PDA-GO-M 材料放置在PBS 緩沖溶液中，并分別在1，5 和14 d考察其表面M2型巨噬細(xì)胞膜涂層的穩(wěn)定性. 由圖3（A）～（C）可見(jiàn)，即使在14 d時(shí)Ti-PDA-GO-M材料表面依然有均勻的綠色熒光. Image J的熒光半定量結(jié)果［圖3（D）］給出同樣的結(jié)論. 這說(shuō)明材料表面的M2型巨噬細(xì)胞膜涂層具有良好的穩(wěn)定性，在鈦種植體表面生物改性方面展現(xiàn)出一定的應(yīng)用前景.

Fig.2 Fluorescence images(A—C) and semi-quantitative analysis of the fluorescence images(D)of Ti-M(A, a), Ti-PDA-M(B, b) and Ti-PDA-GO-M(C, c)（D） Error bars represent standard deviation（n=3）； *P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001，****P＜0.0001） vs. Ti-M group.

Fig.3 Fluorescence images(A—C), semi-quantitative analysis(D) of the stability of M2 macrophages coating at 1(A), 5(B), and 14 day(C)（D） Error bars represent standard deviation（n=3）； *P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001，****P＜0.0001） vs. 1 d group.

由圖4（A）可見(jiàn)，Ti片表面可觀(guān)察到清晰的拋光劃痕. 修飾聚多巴胺和石墨烯后，Ti-PDA-GO材料表面可見(jiàn)明顯相對(duì)褶皺的石墨烯層. 而包覆M2型巨噬細(xì)胞膜后，Ti-PDA-GO-M材料表面的石墨烯層明顯變厚，并且由粗糙變?yōu)楣饣?，說(shuō)明氧化石墨烯層與細(xì)胞膜之間的相互作用能夠促進(jìn)界面結(jié)合，從而成功修飾M2型巨噬細(xì)胞膜涂層. 進(jìn)一步對(duì)材料表面的化學(xué)成分和結(jié)構(gòu)進(jìn)行了分析. 由圖4（B）可見(jiàn)，Ti-PDA-GO材料的紅外光譜圖在3300～2500 cm-1處出現(xiàn)羧基O—H鍵的伸縮振動(dòng)峰，在1750～1700 cm-1處出現(xiàn)羧基C=O鍵的伸縮振動(dòng)峰，這些特征峰均歸屬于氧化石墨烯，證明以聚多巴胺作為橋梁修飾了氧化石墨烯層. 而在Ti-PDA-GO-M 材料的紅外光譜圖中出現(xiàn)PO2-的特征峰（1068 cm-1），側(cè)面證明Ti-PDA-GO-M材料表面存在磷脂雙分子層結(jié)構(gòu). 采用X射線(xiàn)光電子能譜考察了材料表面元素組成，進(jìn)一步確定材料表面細(xì)胞膜涂層的存在. 由圖4（C）可見(jiàn)，Ti片的X射線(xiàn)光電子能譜中主要有O1s（529.35 eV），C1s（285.20 eV）和Ti2p（458.27 eV）的信號(hào)峰； 而在Ti-PDA-GO材料的能譜中C1s的信號(hào)峰強(qiáng)度發(fā)生了顯著增強(qiáng)，同時(shí)Ti2p的信號(hào)峰消失，證明聚多巴胺和石墨烯層完全將Ti片表面覆蓋. 修飾M2型巨噬細(xì)胞膜涂層后，在Ti-PDA-GO-M材料的能譜中可觀(guān)察到O1s信號(hào)峰強(qiáng)度顯著下降，而N1s信號(hào)峰強(qiáng)度顯著增加，同時(shí)能譜中出現(xiàn)P2p（133.25 eV）的信號(hào)峰，證明M2型巨噬細(xì)胞膜已修飾在Ti-PDA-GO 材料表面.

Fig.4 SEM images(A—C), IR spectra(D) and X-ray photoelectron energy spectra(E) of Ti(A),Ti-PDA-GO(B) and Ti-PDA-GO-M(C)Insets of （A—C）： magnification SEM images of Ti，Ti-PDA-GO and Ti-PDA-GO-M.

2.2 M2型巨噬細(xì)胞膜涂層的防污性能研究

材料的防污能力與其表面的親疏水性質(zhì)密切相關(guān). 由水接觸角表征結(jié)果（圖5）可見(jiàn)，Ti 片的水接觸角約為95°，呈現(xiàn)顯著的疏水性質(zhì). 修飾聚多巴胺和石墨烯后，Ti-PDA-GO材料的水接觸角下降到約50°，疏水性有所改善. 而包覆了親水性的細(xì)胞膜涂層后，Ti-PDA-GO-M材料的水接觸角繼續(xù)下降至約28°，呈現(xiàn)良好的親水性.親水性的表面能在鈦種植體周?chē)纬梢粋€(gè)水合層，從而使其具備一定的防污性能［27，28］.

Fig.5 Water contact angle of Ti, Ti-PDA-GO and Ti-PDA-GO-MError bars represent standard deviation（n=3）； *P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001，****P＜0.0001） vs. Ti group.

對(duì)于植入材料而言，宿主蛋白的非特異性吸附會(huì)促進(jìn)血小板的黏附，進(jìn)而引發(fā)炎癥反應(yīng)，甚至導(dǎo)致植入材料失效［29］. 因此，評(píng)價(jià)鈦種植體抗蛋白非特異性吸附性能至關(guān)重要. 實(shí)驗(yàn)采用FITC-BSA和FITC-HSA作為典型的模型蛋白，評(píng)估了材料的抗蛋白非特異性吸附性能. 將熒光標(biāo)記的模型蛋白分別與Ti，Ti-PDA-GO和Ti-PDA-GO-M材料避光振蕩孵育24 h，通過(guò)倒置熒光顯微鏡觀(guān)察了各材料表面的熒光信號(hào). 由圖6（A）～（F）可見(jiàn)，Ti片表面可觀(guān)察到極強(qiáng)的熒光信號(hào)，說(shuō)明Ti片對(duì)牛血清白蛋白和人血清白蛋白均有較強(qiáng)的吸附性. Image J的熒光半定量分析結(jié)果如圖6（G）和（H）所示，Ti-PDA-GO和Ti-PDA-GO-M材料表面的熒光強(qiáng)度很低，說(shuō)明其幾乎不吸附牛血清白蛋白和人血清白蛋白. 由圖6（I）可見(jiàn)，Ti-PDA-GO材料表面的氧化石墨烯層使材料帶負(fù)電，牛血清白蛋白和人血清白蛋白在PBS緩沖溶液中也帶負(fù)電. 根據(jù)電磁理論，同極相互排斥. 因此，Ti-PDA-GO材料可以抵抗帶負(fù)電蛋白的非特異性吸附. Ti-PDA-GO-M材料由于表面修飾了均勻的M2型巨噬細(xì)胞膜涂層，使其同樣帶負(fù)電，再加上其磷脂雙分子層中豐富的兩性離子，呈現(xiàn)出幾乎不吸附牛血清白蛋白和人血清白蛋白的性質(zhì)，表現(xiàn)出更優(yōu)異的抗蛋白非特異性吸附性能.

Fig.6 Fluorescence images(A—F) and semi-quantitative analysis of the fluorescence images(G, H)of BSA(A—C, G) and HAS(D—F, H) and zeta potential(I) on Ti(A, D, a), Ti-PDA-GO(B, E,b) and Ti-PDA-GO-M(C, F, c)（G—I） Error bars represent standard deviation（n=3）； *P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001，****P＜0.0001） vs. Ti group.

2.3 M2型巨噬細(xì)胞膜涂層的生物相容性

在實(shí)際臨床應(yīng)用中評(píng)估鈦種植體對(duì)周?chē)?xì)胞活力的影響至關(guān)重要. 本文選擇RAW 264.7細(xì)胞作為研究對(duì)象. 將其分別與Ti，Ti-PDA-GO 和Ti-PDA-GO-M 材料共孵育7 d. 分別在1，3，5 和7 d 采用FDA 對(duì)RAW 264.7 細(xì)胞骨架染色，利用共聚焦顯微鏡觀(guān)察了材料表面的熒光信號(hào)并分析細(xì)胞增殖狀態(tài). 由圖7可見(jiàn)，從1 d到7 d，Ti，Ti-PDA-GO和Ti-PDA-GO-M材料表面的熒光信號(hào)均呈現(xiàn)由低到高的趨勢(shì)，但Ti-PDA-GO材料的熒光信號(hào)增幅較小，Ti-PDA-GO-M材料的熒光信號(hào)增幅最大. 由圖8可見(jiàn)，Image J 的半定量分析給出相同的結(jié)論，說(shuō)明Ti-PDA-GO-M 材料的M2型巨噬細(xì)胞膜涂層有利于RAW264.7細(xì)胞的增殖，為鈦種植體提供了優(yōu)異的生物相容性.

Fig.7 Fluorescence images of RAW264.7 cell proliferation on Ti(A—D), Ti-PDA-GO(E—H) and Ti-PDA-GO-M(I—L) at 1(A, E, I), 3(B, F, J), 5(C, G, K), and 7 d(D, H, L)

2.4 M2型巨噬細(xì)胞膜涂層的免疫調(diào)控性能

巨噬細(xì)胞的極化對(duì)調(diào)節(jié)鈦種植體周?chē)难装Y至關(guān)重要. 選擇RAW264.7細(xì)胞為研究對(duì)象，在炎癥環(huán)境下分別分析了Ti，Ti-PDA-GO和Ti-PDA-GO-M材料對(duì)RAW264.7細(xì)胞極化的影響，探究了M2型巨噬細(xì)胞膜涂層是否具有優(yōu)異的免疫調(diào)控性能. 首先，利用LPS刺激RAW264.7細(xì)胞構(gòu)建炎癥環(huán)境，再分別將Ti，Ti-PDA-GO 和Ti-PDA-GO-M 材料與細(xì)胞共孵育24 h，探究RAW264.7 細(xì)胞表型的變化. 利用RT-qPCR分析了典型的M2型巨噬細(xì)胞相關(guān)標(biāo)記物白細(xì)胞介素10（IL-10）和白細(xì)胞介素受體-1受體拮抗劑（IL-1ra）以及M1型巨噬細(xì)胞相關(guān)標(biāo)記物腫瘤壞死因子α（TNF-α）和誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（iNOS）的表達(dá)情況［30］.

由圖9 可見(jiàn)，與Ti 和Ti-PDA-GO 材料相比，Ti-PDA-GO-M 材料中M2型巨噬細(xì)胞標(biāo)記物IL-10 和IL-1ra的表達(dá)量均顯著上升，而M1型巨噬細(xì)胞標(biāo)記物TNF-α和iNOS的表達(dá)量則顯著下降，表明在炎癥環(huán)境下Ti-PDA-GO-M材料可有效促進(jìn)RAW264.7細(xì)胞向M2型極化. 同時(shí)，與Ti片相比，Ti-PDA-GO材料中TNF-α和iNOS 的表達(dá)量明顯升高，表明在炎癥環(huán)境下氧化石墨烯層會(huì)在一定程度上促進(jìn)RAW 264.7 細(xì)胞向M1型極化. 通過(guò)免疫熒光蛋白實(shí)驗(yàn)，進(jìn)一步分析了Ti，Ti-PDA-GO 和Ti-PDA-GO-M 材料分別與RAW 264.7 細(xì)胞共孵育24 h 后抗炎因子與促炎因子的變化. 由圖10 可見(jiàn)，與Ti 和Ti-PDA-GO材料相比，Ti-PDA-GO-M材料中M2型巨噬細(xì)胞標(biāo)記物CD206的紅色熒光最強(qiáng)，而代表M1型巨噬細(xì)胞標(biāo)記物iNOS的綠色熒光最弱，表明M2型巨噬細(xì)胞膜涂層賦予了鈦種植體優(yōu)異的免疫調(diào)控能力.

Fig.9 The relative mRNA expression levels of iNOS and TNF-α(A), IL-10 and IL-1ra(B)in Ti, Ti-PDA-GO and Ti-PDA-GO-M after 24 hError bars represent standard deviation（n=3）； *P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001，****P＜0.0001） vs. Ti group.

Fig.10 Fluorescence images of iNOS(A—C) and CD206(D—F) in Ti(A, D), Ti-PDA-GO(B, E) and Ti-PDA-GO-M(C, F) after 24 h

3 結(jié) 論

建立了一種以聚多巴胺和石墨烯層作為“橋梁”，在鈦種植體表面構(gòu)建天然細(xì)胞膜涂層的策略. 在聚多巴胺和石墨烯的共同作用下，保證了M2型巨噬細(xì)胞膜涂層的均勻性和穩(wěn)定性. 由于M2型巨噬細(xì)胞膜獨(dú)特的性質(zhì)，采用M2型巨噬細(xì)胞膜涂層包覆鈦種植體表面進(jìn)行生物功能化改性. 此涂層賦予鈦種植體優(yōu)異的生物相容性、 抗生物污染以及免疫調(diào)控性能. 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，M2型巨噬細(xì)胞膜涂層修飾的鈦種植體可有效阻止蛋白非特異性的吸附. 同時(shí)，在炎癥環(huán)境下能有效促進(jìn)RAW264.7細(xì)胞極化至M2型并分泌抗炎因子，降低植入物感染炎癥的風(fēng)險(xiǎn). 這種簡(jiǎn)單且通用的細(xì)胞膜涂層制備策略可應(yīng)用于不同的生物材料以在宏觀(guān)水平上實(shí)現(xiàn)細(xì)胞膜的物化，在鈦種植體表面改性工程中具有較大的應(yīng)用前景.