張志輝,王淑勛

(石家莊四藥有限公司,河北 石家莊 052165)

作為研究糖蛋白N-連接寡糖合成的工具藥物—苦馬豆素(Swainsonine,SW)由澳大利亞學者COLEGATE等從灰苦馬豆中分離得到[1]。研究發(fā)現(xiàn),苦馬豆素具有抗腫瘤、抗病毒的作用[2-3],國外已經(jīng)將其作為新抗腫瘤藥物進行三期臨床實驗[4-6]。但苦馬豆素在體內(nèi)組織分布不均勻,且濃度超過一定值就會產(chǎn)生毒性,致使使用劑量難以控制。將卟啉類化合物與具有抗腫瘤活性的化合物拼合成卟啉-抗癌藥物,如卟啉-硼中子俘獲(BNCT)[7-8]、卟啉-順鉑[9-10]、卟啉-氮芥[11-12]、卟啉-氟脲嘧啶[13]和4-氨基苯基三苯基卟啉-齊多夫定[14]等,可以使抗癌藥物選擇性地富集于腫瘤組織中,減少其在正常組織中的分布,降低其毒副作用[15]。

本文將氨基卟啉或羥基卟啉與苦馬豆素經(jīng)磷酰化反應,合成了7個新型卟啉苦馬豆素衍生物,并對其抗腫瘤活性進行了測試,希望獲得新型高效的抗腫瘤藥物。衍生物1a～1g的合成路線如圖1。

圖1 1a～1g的合成路線

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

Brucker Avance DMX500型核磁共振儀(CDCl3為溶劑,TMS為內(nèi)標,NMR,德國Bruker公司);Autopol IV 型旋光儀(美國魯?shù)婪蚬?;LCQ型質(zhì)譜儀(賽默飛世爾公司);EA 2400 II型元素分析儀(美國珀金埃爾默公司);二氧化碳培養(yǎng)箱(上海STIK公司); Labsystems型酶標儀(賽默飛世爾公司);苦馬豆素(上海懋康生物科技有限公司);人胃癌(SGC-7901)細胞和人食管癌(Eca-109)細胞(上海復祥生物科技有限公司);氨基卟啉、羥基卟啉2a～2g按文獻[16-18]制備,其它試劑均為分析純。

1.2 衍生物1a～1g的合成

N2氛圍下,在1000 mL圓底燒瓶中加入氨基卟啉或羥基卟啉(2a～2g)(1.0 mmol)和400 mL無水二氯甲烷,控制溫度-20 ℃,加入新蒸三氯氧磷(n×1.2 mmol,n為卟啉分子上氨基或羥基的個數(shù)),用恒壓滴液漏斗緩慢滴加50 mL無水三乙胺的二氯甲烷溶液(n×1.5 mmol),反應4 h后,加入苦馬豆素(3,n×1.1 mmol)和無水三乙胺(n×3.0 mmol),自然升至室溫,反應8 h,反應完畢,用質(zhì)量分數(shù)為5%的NaHCO3溶液(3×150 mL)洗滌,然后水洗至中性。減壓蒸干溶劑,以二氯甲烷∶乙酸乙酯=5∶2,V∶V(濃氨水調(diào)pH=9)作為淋洗液,快速硅膠層析,得到衍生物1a～1g。

1a:收率51%,m.p.>300 ℃;1H NMR(400 MHz,CDCl3)δ:8.94(d,J=4.8 Hz,2H),8.84(s,6H),8.21(d,J=8.0 Hz,6H),7.99(d,J=8.4 Hz,2H),7.77～7.73(m,9H),7.04(d,J=8.4 Hz,2H),4.25～4.23(m,1H),4.14(dd,J=5.6 Hz,3.7 Hz,1H),4.11(s,1H),3.69(td,J=10.2 Hz,4.2 Hz,1H),2.83～2.78(m,2H),2.50(t,J=9.4 Hz,1H),2.0(s,1H),1.95～1.88(m,3H),1.61(br,d,J=13.8 Hz,1H),1.40(qt,J=13.3 Hz,4.3Hz,1H),1.13(qd,J=12.4 Hz,4.3 Hz,1H),-2.76(s,2H);31P(161.7 MHz,CDCl3),δ:-7.11,HR-MS(ESI)m/z:846.3[M]+,C52H43N6O4P元素分析計算值(實測值)/%:C,73.75(73.87); H,5.12(5.10); N,9.92(9.88); P,3.66(3.62)。

1b:收率46%,m.p.>300 ℃;1H NMR(400 MHz,CDCl3)δ:8.93(d,J=2.8 Hz,4H),8.82(s,4H),8.22～8.20(m,4H),7.99(d,J=8.0 Hz,4H),7.75～7.71(m,6H),7.06(d,J=8.0 Hz,4H),4.25～4.23(m,2H),4.14(dd,J=5.6 Hz,3.7 Hz,2H),4.10(s,2H),3.69(td,J=10.2 Hz,4.2 Hz,2H),2.83～2.78(m,4H),2.50(t,J=9.4 Hz,2H),2.0(s,2H),1.95～1.88(m,6H),1.61(br,d,J=13.8 Hz,2H),1.40(qt,J=13.3 Hz,4.3 Hz,2H),1.13(qd,J=12.4 Hz,4.3 Hz,2H),-2.74(s,2H);31P(161.7 MHz,CDCl3),δ:-7.07; HR-MS(ESI)m/z:1078.3[M]+; C60H56N8O8P2元素分析計算值(實測值)/%:C,66.78(66.70); H,5.23(5.21); N,10.38(10.35); P,5.74(5.71)。

1c:收率47%,m.p.>300 ℃;1H NMR(400 MHz,CDCl3)δ:8.92(d,J=4.8 Hz,4H),8.82(d,J=4.8 Hz,4H),8.22～8.20(m,4H),7.98(d,J=8.4 Hz,4H),7.75～7.69(m,6H),7.04(d,J=8.4 Hz,4H),4.24～4.22(m,2H),4.15(dd,J=5.6 Hz,3.7 Hz,2H),4.13(s,2H),3.69(td,J=10.2 Hz,4.2 Hz,2H),2.82～2.77(m,4H),2.51(t,J=9.4 Hz,2H),2.0(s,2H),1.95～1.88(m,6H),1.61(br,d,J=13.8 Hz,2H),1.41(qt,J=13.3 Hz,4.3 Hz,2H),1.13(qd,J=12.4 Hz,4.3 Hz,2H),-2.74(s,2H);31P(161.7 MHz,CDCl3),δ:-7.08; HR-MS(ESI)m/z:1078.3[M]+; C60H56N8O8P2元素分析計算值(實測值)/%:C,66.78(66.72); H,5.23(5.20); N,10.38(10.34); P,5.74(5.70)。

1d:收率45%,m.p.>300 ℃;1H NMR(400 MHz,CDCl3)δ:9.08(d,J=4.8 Hz,4H),8.82(d,J=4.8 Hz,4H),8.40～7.75(m,8H),7.50～6.82(m,8H),4.24～4.22(m,4H),4.15(dd,J=5.6 Hz,3.7Hz,4H),4.12(s,4H),3.69(td,J=10.2 Hz,4.2 Hz,4H),2.83～2.77(m,8H),2.50(t,J=9.4 Hz,4H),2.1(s,4H),1.95～1.89(m,12H),1.60(br,d,J=13.8 Hz,4H),1.40(qt,J=13.3 Hz,4.3 Hz,4H),1.13(qd,J=12.4 Hz,4.3 Hz,4H),-2.74(s,2H);31P(161.7 MHz,CDCl3),δ:-7.09; HR-MS(ESI)m/z:1542.5[M]+; C76H82N12O16P4元素分析計算值(實測值)/%:C,59.14(59.09); H,5.36(5.32); N,10.89(10.83); P,8.03(8.01)。

1e:收率42%,m.p.>300 ℃;1H NMR(400 MHz,CDCl3)δ:8.89(d,J=4.8 Hz,2H),8.83～8.81(m,6H),8.07～8.05(m,8H),7.88(dd,J=7.6 Hz,2.8 Hz,6H),7.16(d,J=8.0 Hz,2H),4.25～4.23(m,1H),4.13(dd,J=5.6 Hz,3.7 Hz,1H),3.68(td,J=10.2 Hz,4.2 Hz,1H),2.83～2.78(m,2H),2.50(t,J=9.4 Hz,1H),2.0(s,1H),1.96～1.89(m,3H),1.60(br,d,J=13.8 Hz,1H),1.41(qt,J=13.3 Hz,4.3 Hz,1H),1.14(qd,J=12.4 Hz,4.3 Hz,1H),-2.86(s,2H);31P(161.7 MHz,CDCl3),δ:-3.87; HR-MS(ESI)m/z:1083.0[M]+; C52H39Br3N5O5P元素分析計算值(實測值)/%:C,57.58(57.60); H,3.62(3.60); Br,22.10(22.12); N,6.46(6.44); P,2.86(2.82)。

1f:收率43%,m.p.>300 ℃;1H NMR(400 MHz,CDCl3)δ:8.87(m,8H),8.09(d,J=8.2 Hz,8H),7.20(d,J=8.0 Hz,8H),4.25～4.23(m,4H),4.13(dd,J=5.6 Hz,3.7 Hz,4H),3.68(td,J=10.2 Hz,4.2 Hz,4H),2.83～2.78(m,8H),2.50(t,J=9.4 Hz,4H),2.0(s,4H),1.96～1.89(m,12H),1.60(br,d,J=13.8 Hz,4H),1.41(qt,J=13.3 Hz,4.3 Hz,4H),1.14(qd,J=12.4 Hz,4.3 Hz,4H),-2.71(s,2H);31P(161.7 MHz,CDCl3)δ:-5.67; HR-MS(ESI)m/z:1546.4[M]+; C76H78N8O20P4元素分析計算值(實測值)/%:C,58.99(58.93); H,5.08(5.05); N,7.24(7.22); P,8.01(8.02)。

1g:收率48%,m.p.>300 ℃;1H NMR(400 MHz,CDCl3)δ:9.04～8.94(m,8H),8.33(t,J=4.0 Hz,6H),8.13(m,2H),7.96～7.91(m,9H),7.33(d,J=8.0 Hz,2H),4.24～4.23(m,1H),4.13(dd,J=5.6 Hz,3.7 Hz,1H),3.69(td,J=10.2 Hz,4.2 Hz,1H),2.83～2.78(m,2H),2.51(t,J=9.4 Hz,1H),

2.0(s,1H),1.95～1.89(m,3H),1.61(br,d,J=13.8 Hz,1H),1.41(qt,J=13.3 Hz,4.3 Hz,1H),1.14(qd,J=12.4 Hz,4.3 Hz,1H),-2.79(s,2H);31P(161.7 MHz,CDCl3)δ:-5.66; HR-MS(ESI)m/z:895.3[M]+; C52H42N5O8P元素分析計算值(實測值)/%:C,69.71(69.73); H,4.73(4.70); N,7.82(7.79); P,3.46(3.43)。

1.3 1a～1g的抗腫瘤活性測試

選對數(shù)生長期的人胃癌(SGC-7901)細胞和人食管癌(Eca-109)細胞,分別將它們的濃度調(diào)整為5×105/mL,按每孔100 μL接種于96孔培養(yǎng)板中。置37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h后,分別加入10 μmol/L的苦馬豆素(SW,陽性對照組)和卟啉苦馬豆素衍生物(1a～1g),空白對照組加等量的培養(yǎng)液。將培養(yǎng)板移入CO2孵箱中,在37℃,5% CO2及飽和濕度條件下,培養(yǎng)20 h。在96孔培養(yǎng)板中每孔加入20 μL MTT溶液(5 g/L),再將培養(yǎng)板移入CO2孵箱中,在37 ℃,5% CO2及飽和濕度條件下,繼續(xù)培養(yǎng)4 h,終止培養(yǎng),吸棄孔內(nèi)上清液。每孔加入100 μL二甲基亞砜,震搖10 min,使紫藍色結晶物充分溶解。用酶標儀以570 nm波長測定各組的吸光度A值。以Mosmann法計算IC50值。

2 結果與討論

2.1 1a～1g的合成

采用一鍋法合成衍生物1a～1g,反應過程應保持隔絕空氣無水狀態(tài),氨基卟啉或羥基卟啉與POCl3反應溫度為-20 ℃,生成卟啉磷酰二氯后,再緩慢升溫至室溫,與苦馬豆素進行酯化反應。該反應中,升高溫度對反應有利,室溫為最佳,高于室溫,苦馬豆素可能出現(xiàn)消旋化現(xiàn)象,副產(chǎn)物增多?；衔锝Y構經(jīng)核磁共振、質(zhì)譜和元素分析得到確證。

2.2 1a～1g的抗腫瘤活性

在10 μmol/L用量條件下,測試1a～1g對人胃癌(SGC-7901)細胞和人食管癌(Eca-109)細胞的抗腫瘤活性(表1)。由表1看出,1a～1g均顯示出一定的抗腫瘤活性。其中,1c對SGC-7901的IC50為1.77±0.14 μM、對Eca-109細胞的IC50為3.32±0.13,抑制活性強于母藥苦馬豆素。1a的抗腫瘤活性與1g相當,說明卟啉以氨基與磷?；噙B接或以羥基與磷?；噙B接對抗腫瘤活性影響不大。1a和1g的抗腫瘤活性強于母藥SW,說明卟啉起到了帶動抗癌藥物SW選擇性地富集于腫瘤組織,減少其在正常組織中的分布作用。1a～1g的抗腫瘤活性顯示出較大的差異,1c的抗腫瘤活性顯著優(yōu)于1a和1g,說明卟啉分子連接的苦馬豆素的數(shù)量與抗腫瘤活性成正相關,但是,雖然異構體1b與1c都連有2個SW分子,但1b的活性卻較差,說明衍生物分子結構的位阻大小也影響其抗腫瘤活性,1d與1f的IC50值與抑制活性的大小也進一步證明了這個觀點。總之,卟啉苦馬豆素衍生物的藥理測試結果表明:磷酸酯和磷酰胺均可以作為卟啉與苦馬豆素的連接臂;位阻小的順式卟啉連接SW分子,抗腫瘤活性好;在適宜的結構位阻情況下,連接苦馬豆素分子數(shù)量越多,抗腫瘤活性越強。

表1 1a～1g的抗腫瘤活性(ˉχ±s,n=6)

3 結論

設計合成了7個新型卟啉苦馬豆素衍生物并確證了其結構。1a～1g對人胃癌(SGC-7901)細胞和人食管癌(Eca-109)細胞均表現(xiàn)出了一定的抑制活性,1c對SGC-7901和Eca-109的抑制活性強于母藥苦馬豆素,有望獲得一種新的抗癌藥物。