馬紅艷,王立強(qiáng)

(1.深圳市龍華區(qū)中心醫(yī)院 藥學(xué)部,廣東 深圳 518110; 2.華僑大學(xué) 生物醫(yī)學(xué)學(xué)院,福建 泉州 362021)

姜黃素(curcumin)是具有β-二酮的庚二烯與兩個(gè)鄰甲基化的酚相連組成的對(duì)稱分子結(jié)構(gòu)的多酚類化合物,為天然植物姜黃(Curcuma Longa L.)、莪術(shù)(Curcuma zedoaria(Christm.)Rosc.)、郁金(Curcuma aromatica Salisb.)等姜黃屬植物中的有效成分之一。具有抗炎、抗氧化、抗腫瘤等廣泛藥理活性作用[1-4]。研究表明,姜黃素在體內(nèi)有一定耐受性,對(duì)胃腸道刺激小,且毒性較低,對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖有一定抑制作用,因此被國(guó)內(nèi)外學(xué)者作為抗腫瘤天然藥物的候選藥物[5-9]。但由于姜黃素存在:生物體內(nèi)環(huán)境中溶解性差[10-11]、體內(nèi)代謝快和生物利用度低[12]等不足,在臨床應(yīng)用中受到一定限制。因此通過(guò)對(duì)姜黃素進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾來(lái)提高其生物活性、改善其溶解性,為姜黃素類新藥研發(fā)提供參考依據(jù)。

生物素(Biotin)又稱維生素H、輔酶R,在自然界來(lái)源廣泛且較容易制備,屬于水溶性的B族維生素。腫瘤細(xì)胞表面的生物素受體含量明顯高于其他正常組織,開(kāi)發(fā)具有生物素及其衍生物的配體可以選擇親和該受體部位,減少抗腫瘤藥物在非靶部位的蓄積和滯留,使藥物具有靶向特異性[13-15]。本文考慮將姜黃素酚羥基進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾改造,制成一系列中間體,并將具有一定腫瘤細(xì)胞靶向特征的生物素通過(guò)酯鍵或酰胺鍵偶聯(lián),制備合成一系列姜黃素-生物素偶聯(lián)物。最后通過(guò)MTT法分別評(píng)價(jià)目標(biāo)化合物(2、4和5)對(duì)KB細(xì)胞增殖的抑制作用,以期為相關(guān)領(lǐng)域進(jìn)一步研究提供參考依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

DF-101S型集熱式電磁攪拌器(鞏義市予華儀器有限公司);R202型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海申勝生物技術(shù)有限公司);CCL-170B-8型二氧化碳培養(yǎng)箱(新加坡藝思高科技有限公司);AC2-4S1型生物安全柜(新加坡藝思高科技有限公司);TS100-F型倒置顯微鏡(尼康株式會(huì)社)。

姜黃素(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司);其余試劑均為分析純;KB:人口腔表皮樣癌細(xì)胞(中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù));澳洲特級(jí)胎牛血清(以色列BioInd公司);RPMI1640(Gibco公司)。

1.2 中間體化合物的合成

(1) 化合物6的合成

如圖1所示,將0.30 g(0.81 mmol)姜黃素溶于45 mL丙酮溶液中,依次向溶液中加入0.23 g(1.66 mmol)碳酸鉀和0.15 g(0.77 mmol)溴乙酸叔丁酯,反應(yīng)加熱回流8 h,反應(yīng)結(jié)束后,冷卻過(guò)濾,濾液減壓濃縮,殘余物經(jīng)硅膠柱色譜分離純化[16],得0.15 g黃色固體化合物6,產(chǎn)率36.90%; m.p.86.2～89.4 ℃,分子式C27H30O8; HR-MS(ESI)(CH3CN,ES-API):m/z483.3{[M+H+]};1H NMR(400 MHz,CDCl3),δ:7.60(d,J=15.7 Hz,2H),7.16～7.08(m,3H),7.06(s,1H),6.94(d,J=8.3 Hz,1H),6.77(d,J=8.5 Hz,1H),6.51(d,J=5.7 Hz,1H),6.47(d,J=5.9 Hz,1H),5.84(d,J=18.4 Hz,2H),4.63(s,2H),3.95(d,J=5.1 Hz,6H),1.48(s,9H);13C NMR(100MHz,CDCl3),δ:183.7,182.9,167.558,149.7,149.3,148.0,146.8,140.7,140.1,129.2,127.7,122.9,122.5,122.0,121.8,114.9,113.3,110.8,109.7,101.3,82.6,66.3,56.0,55.9,28.1; IR(KBr),ν:3412,3060,2980,2930,1750,1627,1586,1464,1425,1509,1140,1032,968,848,817 cm-1。

圖1 中間體化合物6、7、8和 9的合成路線

(2) 化合物7的合成

如圖1所示,將1.0g(2.72 mmol)姜黃素溶于80 mL丙酮中,依次向溶液中加入3.0 g(21.71 mmol)碳酸鉀和1.05 g(5.38 mmol)溴乙酸叔丁酯,加熱回流反應(yīng)12 h,反應(yīng)結(jié)束后,冷卻過(guò)濾,濾液減壓濃縮,殘余物經(jīng)硅膠柱色譜分離純化[16],得0.70 g黃色固體化合物7,產(chǎn)率43.36%; m.p.120.8～124.5 ℃,分子式C33H40O10; HR-MS(ESI)(CH3CN,APCI):m/z597.3{[M+H+]};1H NMR(400 MHz,CDCl3),δ:7.60(d,J=15.7 Hz,2H),7.11(d,J=7.0 Hz,4H),6.77(d,J=8.7 Hz,2H),6.51(d,J=15.8 Hz,2H),5.82(s,1H),4.63(s,4H),3.94(s,6H),1.48(s,18H);13C NMR(100MHz,CDCl3),δ:183.2,167.6,149.2,149.1,140.2,128.3,122.4,113.1,111.2,101.4,81.5,65.4,55.7,27.7; IR(KBr),ν:2980,2936,1754,1630,1586,1464,1420,1509,1032,968,846,805 cm-1。

(3) 化合物8的合成

如圖1所示,將0.14g(0.29 mmol) 化合物6溶于10 mL DCM中,加入1 mL(1.54g,13.51 mmol)三氟乙酸,室溫反應(yīng)12 h,減壓濃縮得粗品,粗品經(jīng)硅膠柱色譜分離純化[17]得0.08g黃色固體化合物8,產(chǎn)率64.83%; m.p.90.3～93.5℃,分子式C23H22O8;HR-MS(ESI)(CH3CN,APCI)m/z:428.2{[M+H+]};1H NMR(400 MHz,DMSO-d6),δ:13.05(s,1H),9.68(s,1H),7.57(d,J=15.8 Hz,2H),7.34(t,J=14.8 Hz,2H),7.23(d,J=8.6 Hz,1H),7.16(d,J=8.0 Hz,1H),6.92(t,J=13.4 Hz,1H),6.86～6.81(m,2H),6.77(d,J=15.8 Hz,1H),6.09(s,1H),5.76(s,1H),4.73(d,J=14.0 Hz,2H),3.83(t,J=8.6 Hz,6H);13C NMR(100 MHz,DMSO-d6),δ:183.8,182.5,167.5,149.4,149.1,148.0,141.0,139.9,128.4,126.3,123.2,122.4,121.1,115.7,113.1,111.4,111.2,101.0,81.5,65.4,55.7,55.6,27.7; IR(KBr),ν:3396,2946,1742 1627,1586,1425,1509,1029,968,848,817 cm-1。

(4) 化合物9的合成

如圖1所示,將0.70g(1.18 mmol)化合物7溶于35 mL DCM中,加入7 mL(1.54 g,94.56 mmol) 三氟乙酸,室溫反應(yīng)約12 h,減壓濃縮,經(jīng)硅膠柱色譜分離純化[17],得0.08 g黃色固體化合物9。產(chǎn)率78.10%; m.p.201.3～203.7℃,分子式C25H24O10; HR-MS(ESI)(CH3OH,ES-API)m/z:483.2{[M-H]+};1H NMR(400 MHz,DMSO-d6,δ:13.06(s,2H),7.95(s,1H),7.59(d,J=15.8 Hz,2H),7.38(s,2H),7.24(d,J=8.4 Hz,2H),6.88(dd,J=21.4,12.1 Hz,4H),6.12(s,1H),4.75(s,4H),3.85(s,6H);13C NMR(100MHz,DMSO-d6),δ:183.2,169.9,149.3,149.1,140.3,128.2,122.5,122.4,112.9,111.1,101.0,64.9,55.7; IR(KBr),ν:3396,2946,1742,1627,1586,1425,1509,1029,968,848,817 cm-1。

(5) 化合物10的合成

如圖2所示,冰浴下,將40 mL含Boc2O的THF溶液緩慢加到60 mL含有4.44 g 1,8-二氨基-3,6-二氧雜辛烷和1.40 mL三乙胺的THF溶液中,室溫反應(yīng)24 h。反應(yīng)液減壓濃縮加入40 mL水,并用75 mL正己烷洗水層,經(jīng)100 mL DCM萃取后,有機(jī)層減壓濃縮,經(jīng)過(guò)硅膠柱色譜分離純化,得2.02 g無(wú)色液體化合物10,產(chǎn)率80.70%;分子式C11H24N2O4; IR(KBr),ν:3355,2982,2936,2874,1696,1520,1177,1131 cm-1。

圖2 中間體化合物10、11和12及目標(biāo)化合物4和5的合成路線

(6) 化合物11的合成

(7) 化合物12的合成

如圖2所示,將0.50 mL三氟乙酸加入到2.50 mL含0.10 g化合物11的DCM溶液中,室溫反應(yīng)24 h,減壓濃縮至干的粗品,粗品經(jīng)過(guò)硅膠柱色譜分離純化,得到0.07 g化合物12,無(wú)色油狀液體,產(chǎn)率81.33%;分子式C16H30N4O4S,1H NMR(400 MHz,DMSO-d6),δ:7.86(t,J=5.5 Hz,1H),6.42(s,1H),6.38(s,1H),4.37～4.26(m,1H),4.13(s,1H),3.63～3.48(m,5H),3.40(t,J=6.0 Hz,4H),3.19(q,J=5.8 Hz,2H),3.09(t,J=9.3 Hz,1H),2.97(t,J=5.2 Hz,2H),2.82(dd,J=12.4 Hz,5.0 Hz,1H),2.58(d,J=12.3 Hz,1H),2.07(t,J=7.4 Hz,2H),1.50(ddd,J=27.9 Hz,20.2 Hz,7.7 Hz,4H),1.29(dd,J=20.9 Hz,14.5 Hz,2H);13C NMR(101 MHz,DMSO-d6),δ:172.2,162.7,69.6,69.4,69.1,66.8,61.0,59.2,55.4,38.7,38.3,35.1,28.1,25.2.IR(KBr),ν:3366,2982,2936,2864,1698,1520,1456,1392,1177 cm-1。

1.3 目標(biāo)化合物的合成

(1) 化合物2的合成

如圖3所示,將0.36 g(1.48 mmol)生物素溶于10 mL DMF中,室溫?cái)嚢柚寥?依次加入0.39 g(1.89 mmol)DCC、0.30g(2.46 mmol)DMAP和0.63 g(1.63 mmol)姜黃素,室溫反應(yīng)24～36 h。反應(yīng)結(jié)束后,過(guò)濾,溶液減壓濃縮后加入適量二氯甲烷,有機(jī)層依次用飽和NH4Cl、水、飽和食鹽水洗滌,有機(jī)層經(jīng)無(wú)水硫酸鈉干燥,濃縮得粗品,粗品經(jīng)硅膠柱色譜分離純化,得0.39 g化合物2:黃色固體,產(chǎn)率44.37%; m.p.182～183 ℃,分子式C31H34N2O8S; HR-MS(ESI)(CH3CN,ES-API)m/z:298.2{[(M+2H)/2]+};1H NMR(400 MHz,DMSO-d6),δ:9.71(s,1H),7.60(dd,J=15.8,3.6 Hz,2H),7.50(s,1H),7.37～7.27(m,2H),7.16(t,J=9.9 Hz,2H),6.96(d,J=16.0 Hz,1H),6.81(t,J=12.8 Hz,2H),6.47(s,1H),6.38(s,1H),6.13(s,1H),4.31(d,J=5.2 Hz,1H),4.17(s,1H),3.84(s,6H),3.15(s,1H),2.85(dd,J=12.4 Hz,4.7 Hz,1H),2.61(d,J=4.3 Hz,1H),2.58(s,2H),1.74～1.30(m,6H);13C NMR(101 MHz,DMSO-d6),δ:184.9,181.4,171.0,162.7,151.2,149.5,148.0,141.5,140.8,139.0,133.8,126.2,124.5,123.3,121.2,115.7,111.9,111.4,101.3,61.0,59.2,56.0,55.7,55.4,33.0,28.0,24.5; IR(KBr),ν/cm-1:3361,3304,2931,2865,1760,1690,1630,1640,1586,1509,1029,973。

圖3 目標(biāo)化合物2的合成路線

(2) 化合物4的合成

如圖2所示,向18 mL 含0.08 g(0.21 mmol)化合物12和0.08 g(0.19 mmol)化合物8的DMF溶液中依次加入0.05 g(0.26 mmol)DCC,0.03 g(0.26 mmol)NHS和0.03 g(0.26 mmol)DMAP,室溫反應(yīng)24 h。反應(yīng)結(jié)束后,減壓濃縮,加入40 mL二氯甲烷,依次用HCl(0.1M)、飽和食鹽水洗滌有機(jī)層,干燥濃縮得粗品,粗品經(jīng)硅膠柱色譜分離純化,得0.12 g化合物4:黃色固體,產(chǎn)率81.56%; m.p.95.2～98.3℃,分子式C39H50N4O11S,HR-MS(ESI)(CH3OH,ES-API):m/z392.2{[(M+2H)/2]+},1H NMR(400 MHz,DMSO-d6),δ:9.68(s,1H),7.95(t,J=5.5 Hz,1H),7.82(s,1H),7.56(d,J=15.8 Hz,2H),7.38(s,1H),7.32(s,1H),7.28～7.18(m,1H),7.17～7.08(m,1H),6.94(d,J=8.3 Hz,1H),6.83(ddd,J=33.4 Hz,18.1 Hz,9.7 Hz,3H),6.41(s,1H),6.35(s,1H),6.08(s,1H),4.52(d,J=13.6 Hz,2H),4.31～4.24(m,1H),4.10(s,2H),3.82(dd,J=15.1 Hz,9.8 Hz,6H),3.53～3.40(m,8H),3.21～3.11(m,4H),3.06(t,J=9.4 Hz,1H),2.79(dd,J=12.4 Hz,5.1 Hz,1H),2.56(d,J=12.4 Hz,1H),2.05(t,J=7.3 Hz,2H),1.59～1.25(m,6H);13C NMR(100 MHz,DMSO-d6),δ:184.0,182.4,172.1,167.5,162.7,149.4,149.3,149.2,148.0,141.1,139.8,128.7,126.3,123.2,122.6,122.4,121.1,115.7,114.0,111.4,111.0,101.0,69.5,69.2,68.8,68.0,63.1,61.0,59.2,55.7,55.6,55.4,48.6,38.4,38.3,35.1,28.2,28.0,25.2; IR(KBr),ν:3290,2931,2862,1690,1627,1586,1509,1272,1137,1029,968,848,815 cm-1。

(3) 化合物5的合成

如圖2所示,向18 mL含0.11 g(0.30 mmol)化合物12的DMF溶液中依次加入0.07 g(0.14 mmol)化合物9,0.07 g(0.35 mmol)DCC,0.04g(0.35 mmol)NHS,0.04 g(0.35 mmol)DMAP,室溫反應(yīng)24 h。反應(yīng)結(jié)束后,減壓濃縮,加入40 mL二氯甲烷,依次用HCL(0.1 M)、飽和食鹽水洗滌有機(jī)層,有機(jī)層濃縮得粗產(chǎn)品,粗品經(jīng)硅膠柱色譜分離純化,得0.08 g化合物5:黃色固體,產(chǎn)率44.56%; m.p.135.3～136.1 ℃,分子式C57H80N8O16S2,HR-MS(CH3OH,ES-API)m/z:599.3 {[(M+2H)/2]+};1H NMR(400 MHz,DMSO-d6),δ:7.98(s,2H),7.85(s,2H),7.59(d,J=15.9 Hz,2H),7.45～7.19(m,4H),6.99～6.73(m,4H),6.42(s,2H),6.36(s,2H),6.13(s,1H),4.54(d,J=11.1 Hz,4H),4.34～4.25(m,2H),4.12(s,2H),3.87(s,6H),3.56～3.45(m,12H),3.39(d,J=6.0 Hz,8H),3.18(dd,J=11.3 Hz,5.6 Hz,4H),3.08(t,J=9.3 Hz,2H),2.81(dd,J=12.4 Hz,4.9 Hz,2H),2.57(d,J=12.4 Hz,2H),2.06(t,J=7.3 Hz,4H),1.63～1.42(m,8H),1.26(dd,J=15.4 Hz,7.8 Hz,4H);13C NMR(100 MHz,DMSO-d6),δ:183.2,172.1,167.5,162.7,149.3,149.4,140.2,128.7,122.6,122.5,114.0,111.1,101.1,69.5,69.2,68.8,68.0,61.0,59.2,55.7,55.4,38.4,38.3,35.1,28.1,28.0,25.2; IR(KBr),ν/cm-1:3290,3084,2926,2870,1670,1553,1509,1272,1137,1029,968,848,815。

1.4 生物素類姜黃素衍生物的初步藥理活性分析

(1) 細(xì)胞培養(yǎng)

KB細(xì)胞的培養(yǎng)條件為含體積分?jǐn)?shù)為10%的胎牛血清RPMI 1640、青霉素(100 IU·mL-1)和鏈霉素(100 μg·mL-1),在37 ℃,5% CO2孵育箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞密度長(zhǎng)到70%～90%,取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞用于抑制率測(cè)定實(shí)驗(yàn)。

(2) MTT法評(píng)價(jià)姜黃素衍生物對(duì)KB細(xì)胞增殖的抑制作用

在96孔板上,接種KB細(xì)胞,接種量5000個(gè)/孔,每孔200 μL;待細(xì)胞貼壁后,實(shí)驗(yàn)組分別加入不同濃度的姜黃素衍生物(100 μmol/L,50 μmol/L,25 μmol/L,12.50 μmol/L,6.25 μmol/L),對(duì)照組加入含相同體積DMSO的新鮮培養(yǎng)基,每組設(shè)5個(gè)復(fù)孔,37 ℃培養(yǎng)24 h;去除含藥培養(yǎng)基,每孔用PBS洗滌2次,加入180 μL新鮮培養(yǎng)基,避光加入20 μL MTT; 37 ℃培養(yǎng)4 h后,取出并棄去上清液,加入150 μL DMSO,振蕩10 min,酶標(biāo)儀570 nm檢測(cè)OD值,通過(guò)下面的公式,得到不同濃度下的抑制率;以濃度為橫坐標(biāo),以抑制率為縱坐標(biāo),繪制生長(zhǎng)抑制曲線,求出該藥物對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率為50%的濃度即IC50值。

細(xì)胞抑制率%=(對(duì)照組OD值-加藥組OD值)/對(duì)照組OD值×100%。

2 結(jié)果與討論

2.1 目標(biāo)化合物的化學(xué)合成

(1) 通過(guò)連接水溶性連接臂得到的姜黃素雜合物

該方法對(duì)具有較好水溶性的商品化1,8-二氨基-3,6-二氧雜辛烷進(jìn)行單邊Boc保護(hù),得到化合物10,再與帶有羧基的生物素在碳二亞胺類化合物(DCC或EDCI)和DMAP催化下以較高的產(chǎn)率得到化合物11?；衔?1在含有20%TFA的二氯甲烷溶液中脫除N-Boc保護(hù)基,獲得含氨基官能團(tuán)的化合物12,與經(jīng)NHS活化的化合物8和9在DCC、DMAP條件下縮合,最后得到了生物素標(biāo)記的姜黃素衍生物4和5。

(2) 姜黃素衍生物合成過(guò)程副反應(yīng)的控制

姜黃素中2個(gè)酚羥基和一個(gè)亞甲基在堿性條件下都可以和鹵代烷反應(yīng),但由于酚羥基比酮的α-位碳的反應(yīng)活性更強(qiáng),采用二碳酸二叔丁酯將酚羥基保護(hù)成碳酸叔丁酯,產(chǎn)率高,產(chǎn)品純度好,而且脫保護(hù)的產(chǎn)率也較高。另外,采用NHS/DMAP/DCC活化姜黃素羧基時(shí)間過(guò)長(zhǎng),可能會(huì)引起羧基化合物的自身縮合等副反應(yīng)的發(fā)生,因此控制羧基活化時(shí)間成為反應(yīng)的關(guān)鍵。而反應(yīng)物溶劑的選擇是反應(yīng)能否順利進(jìn)行和提高產(chǎn)率的重要因素,采用DMF溶劑可以使反應(yīng)物持續(xù)向目標(biāo)反應(yīng)物順利進(jìn)行,從而提高產(chǎn)率。

2.2 抗腫瘤活性分析

采用MTT法初步研究了合成的相關(guān)目標(biāo)化合物(2、4、5)的抗腫瘤活性,結(jié)果見(jiàn)表1。隨著化合物2作用時(shí)間的延長(zhǎng),其對(duì)KB細(xì)胞的IC50值逐漸減少,初步表明其細(xì)胞毒作用具有一定時(shí)間依賴性且抗腫瘤活性優(yōu)于原藥姜黃素。化合物4作用時(shí)間為24～48 h,IC50值逐漸增大,表明其抑制作用隨著時(shí)間逐漸減弱,其作用效果大致與原藥姜黃素相同。而雙生物素修飾的姜黃素衍生物BIO-PB-CUR-PB-BIO則在100 μmol/L濃度內(nèi)沒(méi)有觀察到抗腫瘤活性。

表1 目標(biāo)化合物不同時(shí)間下的IC50值

3 結(jié)論

本研究制備得到生物素標(biāo)記姜黃素衍生物。首先將生物素羧基在氯化亞砜作用下制備成酰氯,再與姜黃素酚羥基進(jìn)行酯化反應(yīng),得化合物2。另外以姜黃素2端酚羥基為修飾位點(diǎn),合成姜黃素羧基化衍生物;同時(shí)合成了具有游離氨基的寡聚乙二醇-生物素中間體,將其與將姜黃素羧基化衍生物DCCDMAP條件下進(jìn)行酰胺化反應(yīng),得到化合物4和5。通過(guò)MTT法初對(duì)所制備化合物進(jìn)行初步細(xì)胞活性考察,顯示化合物2在作用24 h及48 h時(shí)對(duì)KB細(xì)胞的IC50分別是40.82 μmol/L和26.23 μmol/L,提示其抑優(yōu)于抗腫瘤活性藥姜黃素?；衔?在作用24 h及48 h時(shí)對(duì)KB細(xì)胞的IC50分別是39.83 μmol/L和51.24 μmol/L,初步認(rèn)為將姜黃素與生物素進(jìn)行偶聯(lián)生成酯化與酰胺化產(chǎn)物具有較姜黃素本身更強(qiáng)的抗腫瘤細(xì)胞活性,為姜黃素類新藥在抗腫瘤臨床應(yīng)用開(kāi)發(fā)提供依據(jù)。