何裕良,鄭嘉琪,劉秋裕,莫雅通,梁惠婷,袁安琪,史 蕾*,張 召

(1.廣東第二師范學(xué)院 化學(xué)與材料科學(xué)學(xué)院,廣東 廣州 510800; 2.江西師范大學(xué) 國家單糖化學(xué)合成工程技術(shù)研究中心,江西 南昌 330022 3.廣東醫(yī)科大學(xué) 生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室,廣東 湛江 524023;)

光動力療法(Photodynamic therapy,PDT)是一種新興的治療方法,其原理是在特定光源的激發(fā)下,光敏劑從基態(tài)躍遷至第一激發(fā)態(tài),通過系間躍遷至三重激發(fā)態(tài),從而產(chǎn)生具有強(qiáng)氧化性的活性氧(ROS)或單線態(tài)氧(1O2),進(jìn)而殺死腫瘤細(xì)胞[1-2]。研究發(fā)現(xiàn):PDT主要通過直接殺傷、使血管閉合進(jìn)而使腫瘤細(xì)胞缺氧、激活T細(xì)胞引發(fā)免疫反應(yīng)3種方式來對腫瘤細(xì)胞進(jìn)行殺傷[3]。PDT有著組織選擇性良好、創(chuàng)傷小、毒性低和靈活性好等優(yōu)點(diǎn),成為治療惡性腫瘤和微生物感染的新型療法[4]。

卟啉類化合物是一種具有18π電子的大共軛骨架的大環(huán)分子,π電子易在環(huán)內(nèi)流動,因而表現(xiàn)出獨(dú)特的物理化學(xué)及光化學(xué)性質(zhì)[5],有著分子催化[6]、光捕捉[7]和電子轉(zhuǎn)移[8]等功能,在催化化學(xué)、分析化學(xué)[9]、藥學(xué)[10]、光電化學(xué)[11]和分子器件[12]等領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用前景,是一種理想的光敏劑。

KELLY等[13]在1976年首次用一種血卟啉衍生物成功治療5例膀胱癌。經(jīng)過近半個世紀(jì)的發(fā)展,卟啉類化合物已經(jīng)在臨床上得到應(yīng)用。2001年,美國食品與藥品監(jiān)管局批準(zhǔn)維替泊芬(苯并卟啉衍生物單酸環(huán)A)用于治療黃斑變性[14],由我國第二軍醫(yī)大學(xué)研制的血卟啉單甲醚已應(yīng)用于腦膠質(zhì)瘤和鮮紅斑痣的臨床治療[15]。華卟啉鈉(DVDMS)可用于治療晚期食管癌,是我國最早進(jìn)入光動力抗腫瘤治療臨床研究的光敏劑,目前已經(jīng)到了III期臨床試驗階段[16-17]。雖然PDT已經(jīng)得到了學(xué)術(shù)界的廣泛關(guān)注,但光敏劑數(shù)量較少的問題對PDT的發(fā)展造成了很大的限制[18],因此,需要開發(fā)更多的光敏劑以推動PDT的基礎(chǔ)研究和臨床應(yīng)用。

目前,光敏劑已經(jīng)發(fā)展到了第三代,其設(shè)計思路主要是引入具有生物活性的分子,如糖、蛋白質(zhì)和納米粒子等,從而增強(qiáng)光敏劑的生物相容性、水溶性和靶向性等性能,進(jìn)而增強(qiáng)其PDT效力[19]。張海元等[20]通過熱收縮高分子[P(NIPAM-co-AM)]將鋅卟啉(ZP)連接于Bi2S3納米棒表面,形成BPZP和ZP可削弱細(xì)胞抗氧化的能力,進(jìn)而增強(qiáng)PDT效力。劉筱陽等[21]將一種凋亡蛋白酶—半胱氨酸蛋白酶-3(Caspase-3)的多肽底物DEVD與卟啉結(jié)合,提升了光敏劑的光敏活性,能誘導(dǎo)細(xì)胞更深度的凋亡。同時,因為凋亡蛋白的存在,在經(jīng)過光/藥物誘導(dǎo)后,卟啉光敏劑能更為集中地聚集在線粒體的周圍,組織選擇性得到改善,實現(xiàn)對口腔癌細(xì)胞的協(xié)同殺滅。姜建壯等[22]設(shè)計了一種具有良好生物相容性和光活性的納米粒子(NPs),其由氨基卟啉(m-TAPP)與短肽(Fomc-L3-OMe)共組裝形成,NPs在低pH值的腫瘤微環(huán)境中帶正電,可與帶負(fù)電的癌細(xì)胞核糖體靶向結(jié)合,從而在腫瘤干細(xì)胞(CSC)中擴(kuò)散,在光照條件下實現(xiàn)對CSCs的靶向殺傷。

羧甲基殼聚糖(CMC)是一種天然的兩性聚電解質(zhì)多糖,有著良好的生物相容性、生物降解性和低毒性[23-25],其羧基和氨基賦予了其接枝其它分子的可能,通過化學(xué)修飾等手段,可在保留其良好的生物相容性等優(yōu)點(diǎn)的同時賦予其新的性能,是一種理想的藥物載體[26],在藥物研發(fā)方面有著可觀的發(fā)展前景。

基于第三代光敏劑的設(shè)計思路,本文采用1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)和N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)組成的EDC/NHS體系,催化5,10,15,20-四(4-氨基苯基)卟啉(TAPP)與CMC通過酰胺鍵結(jié)合,使二者發(fā)揮各自的優(yōu)勢,以增強(qiáng)PDT效力。采用UV-Vis、IR、XRD與TGA表征化合物的結(jié)構(gòu),采用SEM觀察化合物的微觀結(jié)構(gòu),并測試了其光動力抗腫瘤性能。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

島津UV-Vis 2450型紫外可見分光光度計;布魯克Aensor 27型傅里葉紅外光譜儀;布魯克Advance型X射線衍射儀;鉑金埃爾默TGA 4000型熱重分析儀;泰思肯mira 3型場發(fā)射掃描電鏡;光照培養(yǎng)箱(LED光源,光照度4000 Lux)。

1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽、N-羥基琥珀酰亞胺(98%),阿拉丁;羧甲基殼聚糖,源葉生物;5,10,15,20-四(4-氨基苯基)卟啉(98%),吉林中科研伸科技有限公司;N,N-二甲基甲酰胺、無水乙醇、二甲基亞砜,分析純,天津市大茂化學(xué)試劑廠;肝癌HepG2細(xì)胞、肝癌MHCC-97L細(xì)胞,American Type Culture Collection。

1.2 合成

稱取0.0011 g的CMC于50 mL離心管中,加入0.016 mmol·L-1的EDC溶液和0.004 mmol·L-1的NHS溶液各1 mL,待CMC充分溶解后,磁力攪拌30 min進(jìn)行活化。稱取0.0067 g的TAPP,用1 mL的DMF溶解后滴入活化完成的CMC溶液中,然后在避光條件下磁力攪拌反應(yīng)48 h,得到難溶于水、DMF和乙醇的絮狀物。用無水乙醇洗滌絮狀物,在4000 r/min的轉(zhuǎn)速下離心,再吸出上層洗液,直至上清液呈淺黃色,且洗液在365 nm的紫外燈照射下僅存淡淡熒光,用紫外可見光譜檢測,直至不出現(xiàn)TAPP的吸收峰。最后在真空干燥箱中常溫且避光去除殘余洗液[27-28]。合成路線如圖1所示。UV-Vis(DMF∶EtOH=1∶1,V∶V)λmax:432,524,570,600 nm; IR(KBr)ν:3421,3354,3215,2950,1670,1610,1400,736 cm-1。

圖1 TAPP-CMC的合成路線

1.3 光動力抗腫瘤活性測試

實驗細(xì)胞為HePG2細(xì)胞,MHCC-97L細(xì)胞,以及HK2細(xì)胞?？装逯蟹植加?×105個細(xì)胞,將其置于培養(yǎng)箱中培育12 h。吸取培養(yǎng)基,加入TAPP-CMC懸濁液,在5 W、625 nm的紅光下照射1 h,光照距離為15.5 cm。對照組細(xì)胞不做處理。培養(yǎng)23 h后棄去培養(yǎng)基,用PBS洗滌細(xì)胞3次,最后于倒置熒光顯微鏡中觀察并對比細(xì)胞形態(tài)。

2 結(jié)果與討論

2.1 化合物的表征分析

(1) 紫外光譜分析

如圖2所示,卟啉類化合物在300～400 nm會出現(xiàn)明顯的Soret吸收,500～700 nm的Q帶也有較弱的吸收。用(EtOH∶DMF=1∶1,V∶V)作為溶劑,觀察TAPP和TAPP-CMC的紫外譜圖可發(fā)現(xiàn),TAPP-CMC的最大吸收峰出現(xiàn)在432 nm處,在500～700 nm處也出現(xiàn)了Q帶的吸收,相對于TAPP未發(fā)生顯著變化,但吸收強(qiáng)度大幅降低,這表明CMC的引入沒有破壞卟啉環(huán)的共軛結(jié)構(gòu),二者結(jié)合后可能發(fā)生了電子轉(zhuǎn)移。

λ/nm

(2) 紅外光譜分析

采用KBr壓片法對CMC、TAPP和TAPP-CMC進(jìn)行紅外光譜表征,結(jié)果如圖3所示。CMC的-NH2中的N—H鍵的伸縮振動峰出現(xiàn)在3400 cm-1,1606 cm-1、1419 cm-1和1060 cm-1分別對應(yīng)-COOH的C=O鍵、C—O鍵和O—H鍵的伸縮振動峰[29-30]。TAPP的-NH2的對稱和不對稱伸縮振動峰分別出現(xiàn)在3448 cm-1和3427 cm-1,卟啉環(huán)的N—H鍵的特征峰出現(xiàn)在3300 cm-1和966 cm-1,N—H鍵的彎曲振動峰和搖擺振動峰分別出現(xiàn)在1604 cm-1,804 cm-1處對應(yīng)-NH2的搖擺振動峰[31-33]。

ν/cm-1

在TAPP-CMC的紅外譜圖中,原本出現(xiàn)在1060 cm-1處的-COOH的伸縮振動峰消失,在3421～3354 cm-1出現(xiàn)了酰胺I帶伸縮振動峰,3215 cm-1處為N—H鍵的伸縮振動峰,1670～1610 cm-1出現(xiàn)了酰胺II帶的伸縮振動峰,1400 cm-1附近出現(xiàn)了C—N鍵的伸縮振動吸收帶,在736 cm-1附近出現(xiàn)了伯酰胺的搖擺振動吸收寬峰。由此可推斷,CMC與TAPP通過酰胺鍵結(jié)合。

(3) 熱重分析

通過熱重分析來表征化合物的熱穩(wěn)定性。圖4為CMC、TAPP和TAPP-CMC的TG和DTG曲線。CMC的熱穩(wěn)定性較差,其熱重分析過程存在3個失重過程,第1個階段是30～240 ℃,對應(yīng)吸附水和結(jié)合水的散失;第2個階段是240～320 ℃,其失重速率和失重均為最大,應(yīng)為分解階段;第3個階段是320～530 ℃,失重較為緩慢。530 ℃時基本不再失重。800 ℃下的失重率為35.30%。TAPP具有較好的熱穩(wěn)定性,僅在450～690 ℃出現(xiàn)了明顯的失重,800 ℃的失重率為40.00%。

Temperature/℃

2θ/(°)

TAPP-CMC的熱穩(wěn)定性介乎TAPP和CMC之間,熱失重行為與TAPP相似,出現(xiàn)在330～510 ℃。結(jié)果表明:TAPP與CMC通過酰胺鍵結(jié)合,CMC的引入沒有破壞卟啉的大環(huán)結(jié)構(gòu)。

(4) XRD分析

對CMC、TAPP和TAPP-CMC進(jìn)行X射線粉末衍射表征,結(jié)果如圖5所示。CMC在2θ為21.8°、17.3°、20.0°、20.09°和34.7°分別出現(xiàn)了特征峰。TAPP在20°時出現(xiàn)了較寬的特征峰,這表明二者均有一定的晶體結(jié)構(gòu)。TAPP-CMC的衍射峰不僅保留了CMC的特征峰,也保留了TAPP20°的較寬的特征峰,說明TAPP與CMC的結(jié)合均保留了各自的規(guī)整結(jié)構(gòu),二者的結(jié)合通過酰胺鍵的生成來實現(xiàn)[32]。

(5) SEM分析

圖6為CMC和TAPP-CMC的掃描電鏡圖。CMC主要呈現(xiàn)出不規(guī)則的碎片形貌,粒徑尺寸為100 μm～700 μm。TAPP-CMC主要呈現(xiàn)不規(guī)則的塊狀碎片,粒徑尺寸為4.5 μm～350 μm。

圖6 CMC(a,b,c)和TAPP-CMC(d,e,f,g)的SEM照片

2.2 光動力抗腫瘤活性分析

圖7為加藥后HePG2、MHCC-97L以及HK2的細(xì)胞形態(tài)變化圖。在加藥后,細(xì)胞形狀變得不規(guī)則,開始逐漸皺縮,說明細(xì)胞呈現(xiàn)出凋零的態(tài)勢。結(jié)果表明:TAPP-CMC對肝癌HePG2和MHCC-97L細(xì)胞均具有光動力抗腫瘤的活性。此外,TAPP-CMC對肝正常細(xì)胞HK2也具有一定的光動力抗腫瘤的活性,說明其光敏副作用也存在。

圖7 加入TAPP-CMC藥液并給予光照培養(yǎng)后HePG2、MHCC-97L以及HK2的細(xì)胞形態(tài)變化

3 結(jié)論

基于第三代光敏劑的設(shè)計思路,本課題設(shè)計了一種卟啉-殼聚糖共聚物,用UV-Vis、FT-IR、XRD和TGA表征化合物的結(jié)構(gòu),用SEM觀察了其微觀形貌,通過觀察腫瘤細(xì)胞形態(tài)圖研究了該化合物的光動力抗腫瘤活性。結(jié)果表明:設(shè)計出了一套可行的卟啉-殼聚糖共聚物的合成方案,利用相關(guān)表征證明該合成方案能合成出目標(biāo)化合物;首次發(fā)現(xiàn)TAPP-CMC共聚物具有一定的光動力抗腫瘤活性;通過對比發(fā)現(xiàn),TAPP與CMC的結(jié)合保持了二者的主要結(jié)構(gòu),有利于二者發(fā)揮各自的優(yōu)點(diǎn)?；痉戏肿釉O(shè)計的初衷,為新一代光敏劑的開發(fā)提供實驗依據(jù)和理論參考。