邱宇馳 韓紅偉 張家瑋 付伊萌

腸易激綜合征(irritable bowel syndrome,IBS)是影響著全世界高達(dá)10%的人口的功能性胃腸道疾病[1]。在我國(guó),主要以腹瀉型腸易激綜合征(irritable bowel syndrome with predominant diarrhea,IBS-D)亞型發(fā)病為主。針灸在防治IBS顯現(xiàn)出獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)[2],整體調(diào)護(hù)且綠色安全。研究發(fā)現(xiàn),IBS主要的發(fā)病機(jī)制之一是腸道低度黏膜炎性反應(yīng)[3]。目前已有研究指出IBS模型大鼠結(jié)腸組織出現(xiàn)病理學(xué)改變[4-6]。研究證實(shí)電針可改善IBS-D體重增長(zhǎng)率,亦可降低結(jié)腸黏膜組織炎性因子含量亦有一定的功用[7-8],但內(nèi)在機(jī)制仍不明確。

代謝組學(xué)技術(shù)屬于系統(tǒng)生物學(xué),能夠?qū)⑷俗鳛橐粋€(gè)整體,研究疾病的發(fā)生發(fā)展和治療作用的內(nèi)在機(jī)制,其分析思維與中醫(yī)的整體思維極度相似?，F(xiàn)已有研究者通過(guò)代謝組學(xué)技術(shù)分析IBS模型大鼠的糞便、腸道微生物從而探究中醫(yī)藥防治IBS的內(nèi)在效應(yīng)機(jī)制[9]。前期本團(tuán)隊(duì)的研究發(fā)現(xiàn)針灸能通過(guò)調(diào)節(jié)血清代謝物,影響代謝通路從而抑制炎癥反應(yīng),發(fā)揮防治IBS的作用[10]?；诖?本實(shí)驗(yàn)將從結(jié)腸代謝模式為切入點(diǎn),采用代謝組學(xué)技術(shù),分析篩選結(jié)腸組織代謝物及其代謝途徑,探究針灸抑制IBS腸道炎癥反應(yīng)的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及實(shí)驗(yàn)環(huán)境

從三峽大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心購(gòu)進(jìn)的SPF級(jí)3月齡雄性SD大鼠45只,體質(zhì)量(300±20)g,許可證號(hào):SCXK(鄂)2017-0012。在武漢體育學(xué)院飼養(yǎng),SPF級(jí)環(huán)境條件控制為溫度(22±2)℃、濕度(50±10)%,光照明/暗周期為12/12小時(shí)[11]。適應(yīng)性喂養(yǎng)1周,期間自由飲食、飲水。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理審核批準(zhǔn)號(hào):00287500。本研究所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)流程嚴(yán)格按照國(guó)家科技部2006年發(fā)布的《關(guān)于做好實(shí)驗(yàn)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)操作工作的指導(dǎo)意見(jiàn)》執(zhí)行。

1.2 主要儀器與試劑

戊巴比妥鈉(Sigma),多聚甲醛(國(guó)藥集團(tuán)),異氟醚(阿拉丁),PBS溶液(ASPEN),一次性針灸針(0.30 mm×13mm,華佗牌),Rat TNF-α ELISA Kit (ELK Biotechnology,ELK1396),Rat IL-6 ELISA Kit(ELK Biotechnology,ELK1158),Rat IL-1β ELISA Kit(ELK Biotechnology,ELK1272),甲醇(Merck),乙腈(Merck),甲酸(Aladdin),二氯苯丙氨酸(BioBioPha/Sigma-Aldrich),蘇木素(Sigma),伊紅Y(水溶性)(國(guó)藥集團(tuán)),包埋石蠟(國(guó)藥集團(tuán)),中性樹(shù)膠(國(guó)藥集團(tuán))。

酶標(biāo)儀(Diatek公司,DR-200Bs),冷凍離心機(jī)(湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器,TGL-16),制冰機(jī)(常熟市雪科電器有限公司,IMS-20),臺(tái)式離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠,TGL-16c),水浴鍋(金壇市江南儀器廠,HH-W-600),石蠟切片機(jī)(德國(guó)Leica RM 2016輪轉(zhuǎn)式切片機(jī)),光學(xué)顯微鏡(奧林巴斯BX53型生物顯微鏡),超高效液相色譜(Ultra Performance Liquid Chromatography,UPLC)(ExionLC AD),四級(jí)桿飛行時(shí)間質(zhì)譜(Quadrupole-Time of Flight)(TripleTOF 6600, AB SCIEX),串聯(lián)質(zhì)譜(Tandem mass spectrometry,MS/MS)(QTRAP?),離心機(jī)(Eppendorf),恒溫金屬混勻儀(杭州米歐儀器有限公司),顯微鏡(奧林巴斯BX53型生物顯微鏡)。

1.3 模型制備

45只SD大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、模型組、針灸組,每組15只。對(duì)照組大鼠不做任何的處理。模型組、針灸組大鼠通過(guò)急、慢性應(yīng)激相結(jié)合方法進(jìn)行IBS-D模型制備[6]。采取缺水24小時(shí)、剝奪食物24小時(shí)、痛苦的夾尾巴1分鐘、45℃水中接觸5分鐘、在4℃水中游泳3分鐘、晝夜倒置12/12小時(shí)、水平振動(dòng)(120 r/min)45分鐘等7種不同壓力源,以抓鬮的方式,每天隨機(jī)選擇2種壓力源進(jìn)行造模,持續(xù)3周,其中連續(xù)2天保證無(wú)重復(fù)特定的壓力源,若抓鬮的壓力源重復(fù)則重新抓取,共21天。1周的休息之后,在第28天采取急性束縛應(yīng)激方法,包裹大鼠的肩部、上肢前肢和胸廓1小時(shí)。當(dāng)天測(cè)定內(nèi)臟疼痛閾值,若模型組大鼠內(nèi)臟疼痛閾值高于對(duì)照組(P<0.05),則提示造模成功[12]。

1.4 干預(yù)方法

針灸組大鼠在每日造模前,穿上自制合身的鼠衣,采用針灸干預(yù)“內(nèi)關(guān)”“足三里”“關(guān)元”三穴,參照《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物常用穴位名稱與定位》[13]。使用0.30 mm×13mm華佗牌毫針直刺,針刺得氣后進(jìn)行手法行針,平補(bǔ)平瀉,頻率120次/分鐘,每隔4分鐘行針1分鐘;懸掛并進(jìn)行艾灸,自制艾條長(zhǎng)12 cm,直徑7 mm,用支架固定,置于穴位旁2～3 cm,保證大鼠在平靜的狀態(tài)下,留針及艾灸時(shí)間為15分鐘,每日1次,共28日。

1.5 檢測(cè)指標(biāo)

1.5.1 稀便率測(cè)定 三組大鼠在造模前和干預(yù)后均進(jìn)行稀便率測(cè)定比較。測(cè)定方法如下:將各組大鼠單獨(dú)放置在籠底為不銹鋼網(wǎng)格的籠具中飼養(yǎng),墊有濾紙的托盤(pán)放置在網(wǎng)格下,每隔1小時(shí)更換濾紙,記錄大鼠糞便總粒數(shù)、稀便粒數(shù),以濾紙上有無(wú)污跡區(qū)分干稀便,總時(shí)長(zhǎng)為6小時(shí)。稀便率(%)=稀便粒數(shù)/糞便總粒數(shù)×100%[14]。

1.5.2 ELISA法檢測(cè)血清、結(jié)腸黏膜腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、白介素(interleukin,IL)-6、IL-1β含量 實(shí)驗(yàn)第29天,對(duì)大鼠腹腔注射2%戊巴比妥鈉(0.2 mL/100 g)[15]進(jìn)行麻醉,然后打開(kāi)腹腔,采集5 mL大鼠腹主動(dòng)脈血,標(biāo)本血放置在4℃離心機(jī)上,3 000 r/min,離心20分鐘,然后取上層血清,-20℃保存,待測(cè)。取血后,找到大鼠結(jié)腸段并進(jìn)行分離,用生理鹽水洗去內(nèi)容物,剝離并洗凈腸道黏膜,-20℃保存,待測(cè)。按照ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)測(cè)定血清、結(jié)腸黏膜TNF-α、IL-6、IL-1β含量。

1.5.2 結(jié)腸病理學(xué)觀察 麻醉后,打開(kāi)腹腔,找到大鼠結(jié)腸段并進(jìn)行分離,用生理鹽水洗去內(nèi)容物,清理腸道黏膜,4%多聚甲醛中固定、石蠟包埋、切片烤片(厚度一般為4 μm)、脫蠟、蘇木素—伊紅(hematoxylin-eosin,HE)染色,最后風(fēng)干鏡檢,用奧林巴斯BX53型生物顯微鏡進(jìn)行觀察大鼠結(jié)腸組織的病理學(xué)改變。

1.5.3 結(jié)腸轉(zhuǎn)運(yùn)功能的測(cè)定 實(shí)驗(yàn)第28天,三組大鼠各隨機(jī)取6只在干預(yù)結(jié)束后給予24小時(shí)禁食,再予以異氟醚進(jìn)行麻醉處理,在大鼠距肛門(mén)3 cm直腸內(nèi)放入直徑3 mm的玻璃小球。待大鼠蘇醒后,立即放入籠內(nèi)墊有干凈濾紙的籠具,然后喂食飲水。記錄從大鼠蘇醒至玻璃小球排出的時(shí)間[16]。

1.5.4 結(jié)腸代謝組學(xué)檢測(cè) (1)樣本處理:從三組大鼠各隨機(jī)取6只用于結(jié)腸組織代謝組學(xué)檢測(cè)。同1.5.2步驟取結(jié)腸組織,用PBS洗干凈,液氮淬滅并存入-80℃冰箱中。檢測(cè)時(shí),先從-80℃冰箱中取出樣品,在冰上解凍并進(jìn)行后續(xù)操作,取出樣本,用濾紙吸掉樣本表面的血液,用手術(shù)刀切下一塊樣本,用鑷子夾到去皮后的EP管中,稱量(50±2)mg,并記錄重量;向稱量好的樣本中加入一粒鋼珠,在30 Hz的條件下勻漿4次,每次30秒;在勻漿好的離心管中滴入1 mL70%甲醇內(nèi)標(biāo)提取液;振蕩5分鐘,冰上靜置15分鐘;在4℃條件下,12 000 r/min離心10分鐘;離心后吸取上清液400 μL,放入對(duì)應(yīng)的EP管中;靜置于-20℃冰箱,過(guò)夜;在4℃條件下,12 000 r/min再離心3分鐘;離心后,取上清200 μL裝到對(duì)應(yīng)的樣瓶?jī)?nèi)襯管中。然后上機(jī)分析。

(2)TM廣靶檢測(cè)技術(shù):TM廣靶是將非靶(高分辨、廣覆蓋)與廣靶(高靈敏、精定量)結(jié)合。首先用高分辨四級(jí)桿飛行時(shí)間質(zhì)譜(Quadrupole-Time of Flight)對(duì)樣本進(jìn)行二級(jí)譜掃描,提取MRM離子對(duì)信息,再整合廣靶庫(kù),例如邁維自建庫(kù),公共數(shù)據(jù)庫(kù)HMDB、MoNA、MassBank、METLIN、NIST、MetDNA,對(duì)高分辨中的物質(zhì)進(jìn)行定性,隨后對(duì)定性的物質(zhì)離子對(duì)和RT(Retention time)轉(zhuǎn)移到LC-MS上進(jìn)行數(shù)據(jù)采集,得到峰面積,構(gòu)建樣本的特異性數(shù)據(jù)庫(kù),最后利用三重四極線性離子阱質(zhì)譜儀(QTRAP)對(duì)庫(kù)中物質(zhì)開(kāi)展MRM精準(zhǔn)檢測(cè)[10]。

(3)數(shù)據(jù)處理與分析:采用軟件R進(jìn)行PCA分析,軟件MetaboAnalyst R (R)進(jìn)行偏最小二乘判別分析(partial least squares discrimination analysis,OPLS-DA),分析代謝物,并通過(guò)京都基因組百科全書(shū)(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)數(shù)據(jù)庫(kù)找到富集代謝通路。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 大鼠稀便率比較

造模前,各組大鼠之間稀便率無(wú)明顯差異。造模后,模型組與對(duì)照組比較,稀便率顯著升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);針灸組與模型組比較,稀便率顯著降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表1。

表1 各組IBS-D模型大鼠造模前后稀便率情況

2.2 大鼠血清、結(jié)腸黏膜TNF-α、IL-6、IL-1β含量比較

模型組與對(duì)照組比較,血清TNF-α、IL-6、IL-1β含量均顯著升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01);針灸組與模型組比較,血清TNF-α、IL-6、IL-1β含量均顯著下降,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,P<0.05,P<0.01),見(jiàn)表2。

表2 各組IBS-D模型大鼠血清TNF-α、IL-6、IL-1β含量比較

模型組與對(duì)照組比較,結(jié)腸黏膜TNF-α、IL-1β含量均顯著升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);模型組與對(duì)照組比較,結(jié)腸黏膜IL-6含量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。針灸組與模型組比較,結(jié)腸黏膜TNF-α、IL-6、IL-1β含量差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表3。

表3 各組IBS-D模型大鼠結(jié)腸黏膜TNF-α、IL-6、IL-1β含量比較

2.3 大鼠結(jié)腸組織病理學(xué)情況

鏡下觀察可見(jiàn)對(duì)照組大鼠結(jié)腸黏膜層有少量炎癥浸潤(rùn),腺體數(shù)量豐富,輕微損傷(藍(lán)色箭頭);模型組大鼠結(jié)腸可見(jiàn)明顯黏膜層厚度變薄,較多腺體消失,局部可見(jiàn)明顯腺體損傷,同時(shí)可見(jiàn)較多細(xì)胞核固縮胞體消失,空洞明顯(紅色箭頭);針灸組大鼠結(jié)腸有較多炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)于黏膜層頂端,少量腺體損傷(黃色箭頭)。見(jiàn)圖1。

注:A 對(duì)照組;B 模型組;C 針灸組。

2.4 大鼠結(jié)腸動(dòng)力結(jié)果比較

模型組與對(duì)照組比較,玻璃小球排出時(shí)間顯著縮短,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);針灸組與模型組比較,玻璃小球排出時(shí)間顯著延長(zhǎng),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表4。

表4 各組IBS-D模型大鼠結(jié)腸動(dòng)力結(jié)果比較

2.5 結(jié)腸代謝組學(xué)多元化分析

2.5.1結(jié)腸PCA分析 將對(duì)照組、模型組、針灸組樣品中的所有代謝物的含量采用PCA進(jìn)行分析,如圖2。對(duì)照組、針灸組組內(nèi)聚集情況良好,模型組有少量離散值,說(shuō)明三組數(shù)據(jù)較為穩(wěn)定。模型組與對(duì)照組比較結(jié)果顯示第一主成分(PC1)可以解釋原始數(shù)據(jù)24.81%特征,可以發(fā)現(xiàn)在第一主成分發(fā)生分離;模型組與針灸組比較顯示第二主成分(PC2)可以解釋原始數(shù)據(jù)15.31%特征,可以發(fā)現(xiàn)在第二主成分發(fā)生分離,但是組間差異不明顯,可能受取樣的不確定因素,還有個(gè)體差異的影響,因此進(jìn)一步做OPLS-DA進(jìn)行模型評(píng)價(jià)。

注:A 對(duì)照組與模型組比較的PCA得分圖;B 模型組與針灸組比較的PCA得分圖。

2.5.2 結(jié)腸OPLS-DA分析 正交偏最小二乘法判別分析(OPLS-DA)結(jié)合了正交信號(hào)矯正(OSC)和PLS-DA方法,能夠?qū)矩陣信息分解成與Y相關(guān)和不相關(guān)的兩類信息,通過(guò)去除不相關(guān)的差異來(lái)篩選差異變量。根據(jù)OPLS-DA模型分析代謝組數(shù)據(jù),去除不相關(guān)的差異來(lái)篩選差異變量,評(píng)價(jià)模型的穩(wěn)定性。模型組與對(duì)照組、針灸組與模型組比較分析為有效的模型。結(jié)果顯示模型組與對(duì)照組、針灸組分離明顯。見(jiàn)圖3。

注:A 對(duì)照組與模型組比較的OPLS-DA得分圖及模型評(píng)價(jià);B 模型組與針灸組比較的OPLS-DA得分圖及模型評(píng)價(jià)。

2.5.3 差異代謝物篩選 從PCA、OPLS-DA分析對(duì)照組、模型組、針灸組樣本比較所測(cè)的代謝物,然后進(jìn)行單變量統(tǒng)計(jì)分析,比較兩組樣本代謝物的差異性,選取fold change≥2和fold change≤0.5且VIP≥1的代謝物,為差異顯著。模型組與對(duì)照組比較,差異代謝物有1183個(gè),下調(diào)37個(gè),上調(diào)69個(gè);針灸組與模型組比較,差異代謝物有1260個(gè),下調(diào)13個(gè),上調(diào)15個(gè)。通過(guò)火山圖(Volcano Plot)進(jìn)行可視化展示如圖4。

注:A 對(duì)照組與模型組比較差異代謝物;B 模型組與標(biāo)本配穴組比較差異代謝物?；鹕綀D中的每一個(gè)點(diǎn)表示一種代謝物,橫坐標(biāo)表示某代謝物在兩樣品中定量差異倍數(shù)的對(duì)數(shù)值;縱坐標(biāo)表示VIP值。圖中綠色的點(diǎn)代表下調(diào)差異表達(dá)代謝物,紅色的點(diǎn)代表上調(diào)差異表達(dá)代謝物,黑色代表檢測(cè)到但差異不顯著的代謝物。

2.5.4 篩選相同差異代謝物 對(duì)照組與模型組、模型組與針灸組共有6個(gè)相同的差異代謝物。與對(duì)照組比較,模型組的代謝物肉堿C13:0上調(diào),肉堿C7:DC水平下調(diào),L-苯丙氨酸-L-亮氨酸水平上調(diào),環(huán)(酪氨酸-亮氨酸)水平上調(diào),甘油2-磷酸水平下調(diào);與模型組比較,針灸組代謝物肉堿C13:0水平下調(diào),肉堿C7:DC水平上調(diào),L-苯丙氨酸-L-亮氨酸水平下調(diào),環(huán)(酪氨酸-亮氨酸)水平下調(diào),甘油2-磷酸水平上調(diào)。見(jiàn)表5。

表5 三組IBS-D模型大鼠對(duì)比相同的差異代謝物

2.5.5 代謝通路分析 將差異顯著代謝物按照KEGG中通路類型進(jìn)行分類及富集,其中模型組與對(duì)照組對(duì)比差異代謝通路有2條(P<0.05),分別是色氨酸代謝、類固醇激素生物合成。針灸組與模型組對(duì)比差異代謝通路有1條(P<0.05),是卟啉與葉綠素代謝。見(jiàn)圖5。

注:A 對(duì)照組與模型組比較差異代謝物KEGG富集圖;B 模型組與針灸組比較差異代謝物KEGG富集圖。橫坐標(biāo)為每個(gè)通路對(duì)應(yīng)的Rich factor,縱坐標(biāo)為通路名稱,點(diǎn)的顏色代表p-value,越紅表示富集越顯著。點(diǎn)的大小代表富集到的差異代謝物的數(shù)量。

3 討論

研究證明,無(wú)論是結(jié)腸的神經(jīng)叢神經(jīng)元的改變[17],還是微生物的變化[18],或是基因的改變[19]等多個(gè)層面,均參與了IBS的發(fā)病機(jī)制。本研究通過(guò)觀察稀便率、炎性因子含量、結(jié)腸動(dòng)力,發(fā)現(xiàn)針灸后,大鼠稀便率降低,血清炎性因子TNF-α、IL-6、IL-1β含量降低,結(jié)腸組織黏膜層僅見(jiàn)少量的炎癥細(xì)胞,提示針灸能夠改善腹瀉癥狀并抑制炎癥反應(yīng)。有趣的是,針灸并未通過(guò)降低大鼠結(jié)腸黏膜TNF-α、IL-6、IL-1β含量發(fā)揮抗炎作用,因此本團(tuán)隊(duì)進(jìn)一步利用代謝組學(xué)技術(shù)分析結(jié)腸的差異代謝物及代謝通路。本研究發(fā)現(xiàn)三組對(duì)比相同的差異代謝物中除曲二糖之外,其他代謝物在模型組與針灸組的趨勢(shì)相反。說(shuō)明針灸能夠通過(guò)調(diào)節(jié)肉堿C13:0、肉堿C7:DC、L-苯丙氨酸-L-亮氨酸、環(huán)(酪氨酸-亮氨酸)、甘油2-磷酸的水平,發(fā)揮抗炎的作用。

據(jù)研究報(bào)道,肉堿穩(wěn)態(tài)與糖尿病、慢性腎功能衰竭、乳糜瀉、心血管疾病、炎癥性腸病等疾病的發(fā)生發(fā)展有關(guān)[20]。在不同的研究中也證實(shí)了肉堿與抑郁癥、雙相情感障礙和其他精神疾病的相關(guān)性[21-22]。提示針灸可能通過(guò)調(diào)節(jié)肉堿穩(wěn)態(tài)在抑制炎癥反應(yīng)和改善情感狀態(tài)兩個(gè)方面發(fā)揮防治IBS的作用。對(duì)冠心病心血瘀阻證的研究發(fā)現(xiàn),隨著L-苯丙氨酸和L-異亮氨酸含量的下降,氨基酸的轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝將會(huì)受到影響[23-24]。氨基酸代謝異常是IBS發(fā)病機(jī)制“腦—腸”軸異常的重要影響因素,關(guān)乎著外周和中樞的神經(jīng)反應(yīng),影響IBS臨床癥狀。此外,L-苯丙氨酸-L-亮氨酸水平還可以影響血管新生[25]。提示針灸可能通過(guò)調(diào)節(jié)L-苯丙氨酸和L-異亮氨酸含量影響氨基酸代謝,維持血管穩(wěn)態(tài),調(diào)節(jié)神經(jīng)反應(yīng),改善IBS臨床癥狀。研究發(fā)現(xiàn),甘油2-磷酸也多與血管的鈣化有關(guān)[26]。因此,本團(tuán)隊(duì)推測(cè)針灸可能是通過(guò)調(diào)節(jié)肉堿C13:0、肉堿C7:DC、L-苯丙氨酸-L-亮氨酸、環(huán)(酪氨酸-亮氨酸)、甘油2-磷酸的水平,影響肉堿穩(wěn)態(tài)和氨基酸代謝,從而調(diào)節(jié)神經(jīng)反應(yīng),維持血管穩(wěn)態(tài),抑制炎癥反應(yīng)。

通過(guò)KEGG代謝通路分析發(fā)現(xiàn),IBS-D大鼠結(jié)腸的代謝通路主要涉及色氨酸代謝通路和類固醇激素生物合成。針灸干預(yù)后,發(fā)現(xiàn)差異代謝物主要是參與了卟啉與葉綠素代謝通路。卟啉與葉綠素代謝參與人體很多生理功能,但對(duì)卟啉與葉綠素代謝代謝與消化系統(tǒng)疾病相關(guān)性的研究報(bào)道不多。Khaled等報(bào)道卟啉代謝紊亂可能會(huì)干擾與自閉癥神經(jīng)系統(tǒng)表型相關(guān)的病理學(xué),糞卟啉和前丙哌啉可用作自閉癥患兒可能的生物標(biāo)志物[27]。Katarzyna等報(bào)道褪黑激素對(duì)24日齡苜蓿幼苗在百草枯誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激期間會(huì)影響葉綠素代謝[28]。提示針灸可能通過(guò)調(diào)節(jié)卟啉與葉綠素代謝通路,影響神經(jīng)系統(tǒng),抑制氧化應(yīng)激反應(yīng),從而改善IBS臨床癥狀。

精神心理因素是IBS的重要病因之一,已被專家達(dá)成共識(shí)[29]。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為IBS屬于“腸郁”范疇。筆者分析該病的病機(jī)為心神失調(diào),腸腑失司。在中醫(yī)治病求本思想和標(biāo)本理論的指導(dǎo)下,采用標(biāo)本配穴法,選擇“關(guān)元”“足三里”固護(hù)先天、后天之氣,固護(hù)腸腑;選擇“內(nèi)關(guān)”祛除邪氣,調(diào)養(yǎng)心神,標(biāo)本兼治。由于針刺聯(lián)合艾灸療效高于單純的針灸或者艾灸[30],因此本研究采用的針灸并用防治IBS。本研究證實(shí)了針灸能夠通過(guò)調(diào)節(jié)結(jié)腸組織卟啉與葉綠素代謝通路,調(diào)節(jié)肉堿C13:0、肉堿C7:DC、L-苯丙氨酸-L-亮氨酸、環(huán)(酪氨酸-亮氨酸)、甘油2-磷酸代謝物含量,抑制炎癥反應(yīng)。推測(cè)針灸抑制炎癥反應(yīng)可能是通過(guò)參與神經(jīng)傳導(dǎo)反應(yīng),改善精神狀態(tài),從而調(diào)節(jié)炎性因子。

不同于前期采用代謝組學(xué)技術(shù)分析標(biāo)本配穴針灸對(duì)IBS-D大鼠血清代謝物及代謝通路的研究結(jié)果,此次的研究從結(jié)腸的角度初步發(fā)現(xiàn)了針灸防治IBS的重要靶標(biāo)。針灸不僅能夠通過(guò)這些靶標(biāo)調(diào)節(jié)免疫,抑制炎癥反應(yīng),從而減輕IBS腹瀉腹痛的臨床癥狀,更有可能這些靶標(biāo)參與結(jié)腸相關(guān)的神經(jīng)傳導(dǎo)反應(yīng),改善了精神心理狀態(tài),從而發(fā)揮防治IBS的作用。本研究所得結(jié)果為針灸通過(guò)調(diào)控“腦-腸”軸防治IBS提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù),為臨床防治IBS提供新的治療思路。但這些靶標(biāo)如何參與發(fā)揮的內(nèi)在作用機(jī)制仍需進(jìn)一步更深入的研究。