陳源 吳悠 吳麗麗 秦靈靈 劉銅華

糖尿病是一類以高血糖和糖脂代謝障礙為特征的代謝性疾病,中醫(yī)認(rèn)為其核心病機(jī)為“陰虛燥熱”[1-2]。滋腎丸是一首中醫(yī)經(jīng)典名方,方中只有知母、黃柏、肉桂三味藥,常用于淋證、癃閉等腎系疾病。方中知母、黃柏滋陰清熱,肉桂反佐,基本符合糖尿病病機(jī)。前期動(dòng)物實(shí)驗(yàn)已經(jīng)證實(shí)滋腎丸具有一定的降糖效果,如郭曉媛[3]用滋腎丸醇提取物對(duì)db/db小鼠干預(yù)四周后空腹血糖(fasting blood glucose,FBG)水平開始下降,并能減輕糖尿病腎病腎小管早期腎損害,改善腎功能。Tang等[4]將db/db小鼠分成滋腎丸三個(gè)劑量組,發(fā)現(xiàn)其顯著降低小鼠血糖及糖化血紅蛋白水平,并改善其糖耐量,其降糖效果可與羅格列酮不相上下。實(shí)驗(yàn)室前期研究發(fā)現(xiàn)滋腎丸可通過增加Occludin和ZO-1蛋白在腸道中的表達(dá)來增強(qiáng)腸道屏障功能和降低全身炎癥,改善骨骼肌形態(tài),調(diào)節(jié)骨骼肌胰島素信號(hào)通路[5]。肝臟也是胰島素的重要靶器官之一,本研究將基于肝臟胰島素通路,進(jìn)一步驗(yàn)證其在自發(fā)性糖尿病動(dòng)物模型KKay小鼠中的降糖作用,以及探討其改善肝臟胰島素抵抗的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

KKay小鼠21只,5周齡;C57BL/6J小鼠7只,5周齡,由北京華阜康生物科學(xué)有限公司提供,飼養(yǎng)于北京中醫(yī)藥大學(xué)SPF級(jí)動(dòng)物房,室溫(25±2)℃,相對(duì)濕度(50±5)%,晝夜循環(huán)12小時(shí)/12小時(shí)人工光照條件下,自由飲水,正常維持飼料喂養(yǎng)。普通飼料為小鼠全價(jià)營(yíng)養(yǎng)顆粒飼料,KKay小鼠專用高脂飼料由北京華阜康生物科學(xué)公司提供(貨號(hào):1042)。

1.2 倫理審查

本研究的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)經(jīng)北京中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(倫理號(hào):BUCM-4-2019031003-1089)。

1.3 實(shí)驗(yàn)藥物

知母、黃柏、肉桂中藥飲片購(gòu)買于北京同仁堂制藥公司。

滋腎丸水提物提取:將中藥飲片知母300 g、黃柏300 g、肉桂45 g混合,浸泡在10倍藥重的蒸餾水中1小時(shí),煮沸45分鐘后收集藥液。再次加入相同體積的水煮沸45分鐘,將兩次的煎劑一起放入旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中濃縮至645 mL,得到1g/mL浸膏。將濃縮的浸膏分裝收集在50 mL的EP管中并保存在-20℃冰箱中,每次灌胃前純水稀釋。

1.4 實(shí)驗(yàn)儀器與試劑

便攜式血糖儀(GLUCOCARD 01-min plus,日本愛科來醫(yī)療科技有限公司,型號(hào):GT-1970);酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀(美國(guó),Promega,型號(hào):E9032);凝膠成像系統(tǒng)(美國(guó),Bio-RAD公司,型號(hào):ChemiDocTMXRS);研磨儀(上海凈信科技有限公司,型號(hào):JXFSTPRP-24);實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(美國(guó),Thermo Fisher Scientific,型號(hào):7500);臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)(美國(guó)Sigma Aldrich公司,型號(hào):3K15);紫外分光光度計(jì)(瑞士梅特勒-托利多國(guó)際有限公司,型號(hào):UV5Nano)。

RNA Easy Fast Tissue/cell Kit(北京天根生化科技有限公司,貨號(hào):DP451);HiScript?III RT SuperMix for qPCR (+gDNA wiper)(南京諾唯贊生物科技有限公司,貨號(hào):R323);GO Taq?RT-Qpcr System(美國(guó)Promega生物技術(shù)有限公司,貨號(hào):A6001);小鼠超敏胰島素ELISA試劑盒(美國(guó)ALPCO Diagnostics,貨號(hào):80-INSMSU-E01)。

1.5 造模、分組與給藥

在適應(yīng)性喂養(yǎng)3周后,所有小鼠禁食不禁水12小時(shí),尾尖采血法測(cè)量FBG。據(jù)FBG及體重結(jié)果按隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)將KKay小鼠分為3組:滋腎丸高劑量組、滋腎丸低劑量組、模型組;C57BL/6J小鼠為正常組。滋腎丸高劑量組根據(jù)人劑量10 g黃柏、10 g知母、1.5 g肉桂,換算小鼠生藥給藥量2.8 g/kg。小鼠每天同一時(shí)間段灌胃給藥一次,滋腎丸高劑量組予2.8 g/kg,滋腎丸低劑量組予1.4 g/kg,模型組及正常組予等體積蒸餾水,連續(xù)給藥6周。

1.6 標(biāo)本采集

第6周末次給藥后,禁食不禁水12小時(shí),摘取眼球取血,置于離心管中,不抗凝,室溫下靜置30分鐘后在4℃,3 000 r/min條件下離心15分鐘,吸取上清液于-20℃保存;取出肝臟,將組織的一小部分固定在多聚甲醛溶液中用于形態(tài)學(xué)觀察,其余部分收集在管中并立即用液氮冷凍。

1.7 指標(biāo)檢測(cè)

1.7.1 FBG測(cè)定 每周固定時(shí)間,將小鼠禁食不禁水12小時(shí),取尾尖血,用葡萄糖氧化酶法測(cè)定FBG,采用配套血糖儀及試紙。

1.7.2 口服葡萄糖耐量試驗(yàn)(oral glucose tolerance test,OGTT) 第6周末次給藥后,禁食不禁水12小時(shí),測(cè)小鼠FBG作為0分鐘血糖,按2 g/kg給小鼠灌胃葡萄糖溶液進(jìn)行OGTT試驗(yàn),測(cè)定30分鐘、60分鐘、120分鐘血糖,計(jì)算曲線下面積(area under curve,AUC)。

AUC=0.5×(Bg0min+Bg30min)/2+0.5×(Bg30min+Bg60min)/2+1×(Bg60min+Bg120min)/2

其中Bg0min為0分鐘血糖,以此類推。

1.7.3 酶聯(lián)免疫吸附法測(cè)定胰島素水平 將吸取的血清冷凍保存后檢測(cè)空腹血清胰島素(fasting insulin,FINS)水平,并計(jì)算胰島素抵抗指數(shù)(homeostasis model assessment-insulin resistance,HOMA-IR)。

HOMA-IR=FBG·FINS/22.5

1.7.4 肝臟組織染色 新鮮肝臟組織經(jīng)4%多聚甲醛固定24小時(shí)后,石蠟包埋,3～5 μm切片,根據(jù)蘇木素-伊紅(hematoxylin-eosin staining,HE)染色試劑盒及糖原過碘酸雪夫染色(periodic Acid-Schiff staining,PAS)試劑盒使用說明書步驟進(jìn)行,常規(guī)光學(xué)顯微鏡高倍鏡鏡檢,觀察肝臟組織形態(tài)及糖原分布情況,拍照保存圖片。

1.7.5 qRT-PCR法測(cè)定相關(guān)基因表達(dá)水平 將肝臟組織從-80℃冰箱取出,試劑盒提取總RNA,按照PCR操作要求及Promega試劑盒說明書進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA并擴(kuò)增,反應(yīng)條件: 50℃2分鐘,95℃10分鐘,(95℃15秒,60℃1分鐘,40循環(huán)),95℃15秒,60℃1分鐘,95℃30秒,60℃15秒。以模型組的基因表達(dá)為對(duì)照,采用2-△△Ct法計(jì)算得到各個(gè)樣本之間相對(duì)的基因表達(dá)水平。檢測(cè)基因?yàn)橐葝u素受體底物(insulin receptor substrate,IRS)、磷脂酰肌醇3-激酶(phosphoinositide 3-kinase,PI3K)、蛋白激酶B(protein kinase B,PKB/Akt)、叉頭框蛋白1(forkhead box O1,FOXO1)、磷酸烯醇丙酮酸羧激酶(phosphoenolpyruvate carboxykinase,PEPCK)、葡萄糖-6-磷酸酶(glucose-6-phosphatase,G6pase)、葡萄糖激酶(glucokinase,GCK)基因表達(dá)水平。所測(cè)基因引物序列如表1所示。

表1 qRT-PCR引物序列

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 滋腎丸對(duì)KKay小鼠空腹血糖的影響

與正常組相比,模型組小鼠的血糖顯著升高(P<0.05);與模型組相比,滋腎丸低劑量組小鼠在第3、5、6周血糖顯著降低(P<0.05),從第1周開始至用藥結(jié)束,滋腎丸高劑量組小鼠空腹血糖顯著降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),且下降幅度比滋腎丸低劑量組大。見表2。

表2 滋腎丸對(duì)KKay小鼠空腹血糖的影響

2.2 滋腎丸對(duì)KKay小鼠糖耐量的影響

與正常組相比,模型組小鼠的0分鐘、30分鐘、60分鐘、120分鐘血糖及AUC均顯著升高(P<0.05);與模型組相比,滋腎丸高、低劑量組0分鐘、30分鐘、60分鐘、120分鐘血糖及AUC均顯著下降(P<0.05)。見表3。

表3 滋腎丸對(duì)KKay小鼠糖耐量的影響

2.3 滋腎丸對(duì)KKay小鼠胰島素水平及胰島素抵抗指數(shù)的影響

與正常組相比,模型組FINS水平顯著降低(P<0.05),提示早期胰島調(diào)節(jié)功能受損;與模型組相比,高、低劑量滋腎丸均顯著提升FINS水平(P<0.05),考慮滋腎丸可以改善早期胰島功能。與正常組相比,模型組HOMA-IR顯著升高(P<0.05),提示胰島素抵抗。與模型組相比,高、低劑量滋腎丸均顯著降低HOMA-IR水平(P<0.05),提示滋腎丸可以改善胰島素抵抗。見表4。

表4 滋腎丸對(duì)KKay小鼠胰島素水平及胰島素抵抗指數(shù)的影響

2.4 肝臟組織病理學(xué)觀察

2.4.1 HE染色 光鏡下觀察小鼠肝臟細(xì)胞HE染色情況。正常組肝組織肝小葉結(jié)構(gòu)清晰,肝索排列規(guī)則整齊,以中央靜脈為中心呈放射狀分布,未見脂質(zhì)沉積;模型組肝臟形態(tài)紊亂,肝小葉肝索結(jié)構(gòu)消失,肝細(xì)胞腫大變性,存在大量脂肪空泡及脂質(zhì)沉積。與模型組相比,滋腎丸高、低劑量組肝小葉結(jié)構(gòu)較為清晰完整,肝索排列較正常,肝竇排列較為規(guī)則,中央靜脈結(jié)構(gòu)較完整,空泡樣改變明顯減少。見圖1。

注:A 正常組;B 模型組;C 滋腎丸低劑量組;D 滋腎丸高劑量組。

2.4.2 PAS染色 光鏡下觀察小鼠肝臟糖原染色,胞質(zhì)PAS反應(yīng)陽性物質(zhì)即為糖原,顯示為紫紅色,細(xì)胞核為藍(lán)色。正常組肝細(xì)胞內(nèi)紫紅色糖原顆粒分布均勻,數(shù)量適中,提示血糖正常平穩(wěn)。與正常組相比,模型組肝細(xì)胞內(nèi)紫紅色顆粒顯著減少,提示肝臟糖原合成減弱;與模型組相比,滋腎丸高、低劑量組紫紅色顆粒數(shù)量顯著增加,提示糖原顯著增多,與PCR結(jié)果相一致,表明滋腎丸劑量依賴性促進(jìn)糖原合成,抑制肝糖輸出從而起到降低血糖的作用。見圖2。

注:A 正常組;B 模型組;C 滋腎丸低劑量組;D 滋腎丸高劑量組。

2.5 滋腎丸對(duì)KKay小鼠IRS-1、PI3K、AKT2、FOXO1、PEPCK、G6pase、GCK基因表達(dá)量的影響

與模型組相比,滋腎丸各劑量組FOXO1、PEPCK、G6pase的mRNA表達(dá)量均顯著降低(P<0.05),且滋腎丸高劑量組下降幅度比低劑量組大。與正常組相比,模型組FOXO1的mRNA表達(dá)量顯著上升(P<0.05),但PEPCK、G6pase的組間差異不符合預(yù)期。

與正常組相比,模型組GCK mRNA表達(dá)量顯著降低(P<0.05);與模型組相比,滋腎丸低劑量組GCK mRNA表達(dá)量有上升趨勢(shì),但無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);高劑量組GCK mRNA表達(dá)量顯著上升(P<0.05)。

與模型組相比,滋腎丸給藥后IRS-1、PI3K及Akt2的mRNA有上升趨勢(shì),但組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表5。

表5 滋腎丸對(duì)KKay小鼠肝組織相關(guān)靶基因的影響

3 討論

中藥治療糖尿病具有多通路、多靶點(diǎn)的優(yōu)勢(shì)特點(diǎn),在當(dāng)前時(shí)代背景下運(yùn)用現(xiàn)代技術(shù)探究及闡明其內(nèi)在作用機(jī)制是極其必要的。滋腎丸是來源于中醫(yī)古籍中的經(jīng)典方劑,組方精妙,量小藥少而力專,方中以等量知母、黃柏為主,二者皆氣寒味苦入腎經(jīng),瀉火堅(jiān)陰,在組方配伍中常相須而用?！侗静萁?jīng)解》言知母“主消渴熱中,除邪氣”,《本草經(jīng)疏》云黃柏“以至陰之氣,補(bǔ)至陰之不足,虛則補(bǔ)之,以類相處”。二者相合,少佐溫陽化氣之肉桂共同起到滋陰化氣之效,尤宜于消渴病之下消證。本實(shí)驗(yàn)參考既有文獻(xiàn)研究[4],以10∶10∶1.5的比例制成水提物,探究其降糖機(jī)制及量效關(guān)系,以冀對(duì)臨床中方劑應(yīng)用提供幫助。

肝胰島素通路有轉(zhuǎn)錄水平以及蛋白磷酸化水平兩方面的調(diào)節(jié)作用,相關(guān)研究已證實(shí)IRS、PI3K、Akt是通路上的三個(gè)重要節(jié)點(diǎn)[6]。在生理?xiàng)l件下,胰島素分泌入血后,沿著IRS-1/PI3K/Akt2/FOXO1信號(hào)通路發(fā)生級(jí)聯(lián)反應(yīng),首先與肝細(xì)胞膜上的特定INSR結(jié)合,通過募集底物IRS-1,IRS-1多個(gè)酪氨酸殘基磷酸化,募集PI3K催化二磷酸磷脂酰肌醇生成三磷酸磷脂酰肌醇,后者進(jìn)一步與下游Akt結(jié)合并磷酸化激活A(yù)kt。目前發(fā)現(xiàn)Akt有3種亞型,Akt1表達(dá)于大部分組織,Akt2主要表達(dá)于胰島素效應(yīng)組織,Akt3則高度表達(dá)于腦和睪丸組織[7]。目前的研究表明Akt2是葡萄糖代謝所必需的[8]。肝臟Akt2激活后進(jìn)一步磷酸化FOXO1使其失活,從而釋放下游糖異生基因轉(zhuǎn)錄及抑制葡萄糖產(chǎn)物生成。胰島素通過這些受體激活和信號(hào)蛋白的招募/磷酸化,在肝細(xì)胞質(zhì)膜上啟動(dòng)近端胰島素的一系列蛋白磷酸化反應(yīng)。

FOXO1是肝臟胰島素信號(hào)級(jí)聯(lián)的關(guān)鍵一步,是代謝信號(hào)到細(xì)胞核的延續(xù)與轉(zhuǎn)接[9]。資料顯示,在高脂喂養(yǎng)的小鼠中肝臟FOXO1 mRNA表達(dá)降低40%也足以降低基礎(chǔ)的肝臟葡萄糖生成[10]。正常生理?xiàng)l件下,FOXO1停留在細(xì)胞核內(nèi),進(jìn)食狀態(tài)時(shí)在胰島素作用下磷酸化失活從細(xì)胞核轉(zhuǎn)移到細(xì)胞質(zhì),從而禁用其轉(zhuǎn)錄因子活性;在糖代謝紊亂及炎癥狀態(tài)下,FOXO1會(huì)發(fā)生細(xì)胞核移位從而被激活,激活的FOXO1結(jié)合轉(zhuǎn)錄輔激活因子過氧化物酶體增殖激活受體γ共激活因子1α[9](peroxisome proliferator-activated receptor γ coactivator-1α,PGC1-α),以協(xié)調(diào)糖異生轉(zhuǎn)錄程序,可以靶向提高PEPCK、G6pase兩個(gè)關(guān)鍵酶的基因表達(dá)水平來促進(jìn)糖異生?；钚訤OXO1還與輔阻遏子SIN3A結(jié)合,降低GCK的表達(dá),進(jìn)一步促進(jìn)葡萄糖輸出[11]。

GCK是己糖激酶的一種,僅存在于肝細(xì)胞和胰島β細(xì)胞中,具有絕對(duì)專一性,其作用是催化葡萄糖生成葡萄糖-6-磷酸(glucose6-phosphate,G6p)。后者是糖原合成酶(glycogen synthase,GS)的底物,也是別構(gòu)激活劑[12-13],可以促進(jìn)糖原合酶的激活,提高糖原合成水平。GCK還受血糖濃度影響,在生理?xiàng)l件下,高血糖也可導(dǎo)致葡萄糖激酶從細(xì)胞核轉(zhuǎn)移到細(xì)胞質(zhì)[14],從而促成葡萄糖-G6p流動(dòng)。GCK催化G6p的生成同時(shí)也是有氧氧化的開始,所以GCK同時(shí)控制著肝臟葡萄糖的利用與儲(chǔ)存[3]。目前GCK已成為潛在的治療靶點(diǎn),且已經(jīng)出現(xiàn)了小分子的激活劑[15]。

本實(shí)驗(yàn)以基因突變的KKay小鼠為2型糖尿病對(duì)照,在遺傳易感的基礎(chǔ)上飼以高脂飼料[16],造成外周組織對(duì)胰島素敏感性降低,與人類2型糖尿病表現(xiàn)極為相似。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,滋腎丸可顯著降低KKay小鼠的FBG、OGTT AUC及HOMA-IR,PCR顯示滋腎丸可以降低小鼠FOXO1、PEPCK、G6pase基因表達(dá),提高小鼠的GCK基因表達(dá),另外通過PAS染色也證實(shí)給藥后肝臟糖原增加。這些證據(jù)均提示藥物可能通過降低FOXO1從而上調(diào)GCK基因表達(dá)、下調(diào)糖異生酶基因表達(dá),抑制糖異生及促進(jìn)肝糖原合成,從而改善肝臟胰島素抵抗,降低血糖水平,可能跟IRS-1-PI3K-Akt2胰島素信號(hào)通路有關(guān)。PCR結(jié)果提示上游IRS-1、PI3K、Akt2基因表達(dá)水平改變無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。考慮到胰島素在上述位點(diǎn)的作用與轉(zhuǎn)錄后蛋白磷酸化有關(guān),仍需完善蛋白免疫印跡實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證。此外,滋腎丸復(fù)方成分復(fù)雜,本實(shí)驗(yàn)只探索了該復(fù)方對(duì)胰島素通路上的其中一條進(jìn)行了研究,有可能還涉及到其他的胰島素通路,仍有待進(jìn)一步探索。