賈紋紋，譚 軍，張 秦，黨 磊，徐 溢，陳 李

（1.重慶大學(xué)光電工程學(xué)院光電技術(shù)與系統(tǒng)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶 400044；2.重慶大學(xué)新型微納器件與系統(tǒng)技術(shù)重點(diǎn)學(xué)科實(shí)驗(yàn)室，重慶 400044；3.航天神舟生物科技集團(tuán)有限公司北京市空間生物工程研究中心，北京 100080）

0 引 言

大氣溶膠顆粒物帶來的影響愈發(fā)受到人們重視，當(dāng)氣溶膠中含有細(xì)菌、病毒、霉菌孢子以及寄生蟲卵等致病微生物時，會給人類健康帶來巨大威脅［1，2］。已有論文研究表明，氣溶膠中的細(xì)菌、真菌能明顯增加患肝部、肺部、及過敏性疾病的幾率［3］，給人類健康帶來了諸多負(fù)面影響，因此對其濃度進(jìn)行實(shí)時監(jiān)測十分必要。

自1968年被報道激光誘導(dǎo)熒光技術(shù)以來，科研人員對生物氣溶膠的實(shí)時監(jiān)測技術(shù)開展了系列研究。2015 年，日本海洋地球科學(xué)技術(shù)廳Taketani F等人［4］研發(fā)了一種氣溶膠混合粒子實(shí)時監(jiān)測系統(tǒng)，在環(huán)境中成功探測到具有熒光成分的顆粒；2018年，中國科學(xué)院上海光學(xué)精密機(jī)械研究所對生物氣溶膠監(jiān)測進(jìn)行了系列研究，實(shí)現(xiàn)了生物氣溶膠實(shí)時檢測裝置［5］；2020 年，Jeong Y S等人［3］采用紫外發(fā)光二極管誘導(dǎo)熒光，研制了手持式生物氣溶膠實(shí)時監(jiān)測系統(tǒng)，通過測量熒光和散射光強(qiáng)度，確定目標(biāo)生物粒子。上述研究的基本思路類似，但對微生物本征熒光特性研究較少。

本文在光路整形設(shè)計研究基礎(chǔ)上［6］，對微生物含有的熒光活性物質(zhì)及幾種典型細(xì)菌的激發(fā)和發(fā)射光譜進(jìn)行了測試，進(jìn)一步對儀器的氣路、光檢測結(jié)構(gòu)進(jìn)行優(yōu)化設(shè)計，完成儀器系統(tǒng)的設(shè)計和搭建，并完成對儀器性能的初步測試。

1 粒子計數(shù)原理分析

1.1 光散射粒子檢測原理

粒子對光的散射可以分為瑞利散射和米氏（Mie）散射兩種。如圖1所示，當(dāng)粒子直徑遠(yuǎn)小于入射光波長λ時，表現(xiàn)為瑞利散射，前向和后向散射光分布比較對稱；當(dāng)粒子直徑與入射光波長λ相當(dāng)時，表現(xiàn)為Mie散射，此時前向散射光更強(qiáng)，方向性比較明顯［7］，隨著粒子粒徑進(jìn)一步增大，前向散射光會更強(qiáng)。

由于氣溶膠生物粒子直徑通常在0.5 μm以上，與激發(fā)光波長相比主要表現(xiàn)為Mie 散射［8］。散射模型如圖2 所示，若散射角為θ，則沿著散射角θ方向的散射光強(qiáng)度表達(dá)式如式（1）［9］所示

圖2 均勻球形粒子的光散射

式中s1（θ），s2（θ）為關(guān)于粒子粒徑d的函數(shù)，由此可推導(dǎo)出散射光強(qiáng)度I（θ）與粒徑d及散射角θ有關(guān)［10］。當(dāng)散射角度固定時，即可通過探測散射光的強(qiáng)度，實(shí)現(xiàn)對不同粒徑的粒子進(jìn)行分類計數(shù)。

1.2 微生物粒子本征熒光特性分析

絕大部分微生物粒子含有色氨酸、煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（nicotinamide adenine dinucleotide，NAD＋）、核黃素等熒光活性分子［11，12］。如圖3所示，當(dāng)這些活性分子受到特定波長入射光照射時，部分處于基態(tài)的電子吸收光子能量躍遷至高能級的激發(fā)態(tài)，并發(fā)生振動弛豫而以熱能形式消耗掉一部分能量后，處于激發(fā)態(tài)的最低振動能級；再躍遷回基態(tài)能級，并輻射出熒光。這個過程中由于熱能消耗，導(dǎo)致輻射光子能量低于吸收的光子能量（ΔV′＜ΔV），即熒光發(fā)射波長大于入射波長。而大部分非生物粒子，則不具有熒光發(fā)射特性。

采用瓦里安Cary Eclipse分子熒光光譜儀，對熒光活性物色氨酸、NAD＋和核黃素進(jìn)行了測試，結(jié)果如圖4所示。

處于3種熒光物質(zhì)激發(fā)波長范圍的激光器典型波長有280，355，405 nm等。其中，280 nm的光源可對Tryptophan激發(fā)，355，405 nm 可對NAD＋和黃素腺嘌呤二核苷酸（flavinadenine dinucleotide，F(xiàn)AD）激發(fā)。280，355 nm連續(xù)輸出的小體積紫外激光器功率較低（10～20 mW）；而405 nm 的連續(xù)輸出的小體積紫外激光器功率可達(dá)100 mW 以上，對提高儀器的靈敏度十分有利。選取較為常見的微生物進(jìn)行熒光光譜測試實(shí)驗(yàn)，測試結(jié)果如圖5 所示。可見幾種微生物的熒光譜峰范圍非常接近，峰值位置約為485 nm。

圖5 微生物熒光光譜

2 微生物粒子計數(shù)儀器設(shè)計

2.1 裝置整體結(jié)構(gòu)設(shè)計

微生物粒子計數(shù)裝置如圖6 所示。激發(fā)光出射后，經(jīng)整形得到均勻的光束并進(jìn)入檢測腔［6］；檢測腔主要由激光輸入通道、光陷阱、氣溶膠輸入輸出通道和凹面反射鏡組成，粒子與光束相互作用產(chǎn)生熒光和散射光，由檢測腔下方凹面反射鏡收集；再通過二向色鏡，將熒光信號分離，然后采用光電倍增管對兩路光信號進(jìn)行探測。信號處理電路完成探測器輸出電信號的模／數(shù)（A／D）轉(zhuǎn)換、數(shù)據(jù)緩存、峰值鑒別及分類計數(shù)功能，最后將結(jié)果上傳至上位機(jī)進(jìn)行顯示。

圖6 計數(shù)儀整體結(jié)構(gòu)示意

2.2 氣路結(jié)構(gòu)設(shè)計

氣流裹挾待測粒子進(jìn)入裝置內(nèi)光檢測區(qū)，完成粒子檢測。若氣路設(shè)計不合理，則檢測腔區(qū)域內(nèi)容易產(chǎn)生湍流現(xiàn)象，導(dǎo)致氣流裹挾的粒子出現(xiàn)漏檢及重復(fù)檢測的問題。因此對進(jìn)氣、出氣通道進(jìn)行了優(yōu)化，當(dāng)進(jìn)氣口相距6 mm、內(nèi)徑為3 mm時結(jié)果最優(yōu)，仿真結(jié)果如圖7（a）所示。從仿真結(jié)果可以看出，氣流的發(fā)散程度較小，湍流強(qiáng)度較弱。對進(jìn)入腔體內(nèi)的粒子進(jìn)行軌跡追蹤，結(jié)果如圖7（b）所示，只有極少部分粒子產(chǎn)生偏移。統(tǒng)計數(shù)據(jù)如表1 所示，粒子的偏移率不超過3.2%，處于較低的水平。

表1 粒子軌跡分布統(tǒng)計數(shù)據(jù)

圖7 氣路結(jié)構(gòu)仿真結(jié)果

2.3 光探測結(jié)構(gòu)設(shè)計

檢測腔內(nèi)氣流與激光束垂直交叉，交點(diǎn)處即為光檢測核心區(qū)，產(chǎn)生的熒光與散射光通過光學(xué)元件進(jìn)行收集。通常對光信號的收集分為前向和側(cè)向2 種方式，前向收集方式將聚焦透鏡放置在散射光前向，透鏡前設(shè)置光陷阱，消除入射光對散射收集的影響；側(cè)向收集方式將球面反射鏡結(jié)構(gòu)裝配于光路氣路交叉平面的90°側(cè)向，通過球面反射對光信號進(jìn)行會聚收集。

為選擇一種更好的收集方式，采用定量方法對上述2種方式在0.5 ～5.0 μm范圍內(nèi)粒子的散射光收集量進(jìn)行積分計算，計算模型如圖8所示，對不同粒徑粒子在同一位置進(jìn)行相同收集面積的積分運(yùn)算。側(cè)向收集選用球形模型，而前向收集方式采用聚焦透鏡，因此可近似于矩形模型。

圖8 2 種收集方式仿真

由于此處并不是對實(shí)際收集的光通量進(jìn)行計算，因此對比考察2種方式相對收集量的變化趨勢，將其繪制成曲線如圖9所示。通過仿真結(jié)果可以看出，隨著粒子粒徑的不斷增大，前向和側(cè)向收集方式的散射光收集量均出現(xiàn)增加，但前向收集方式增加趨勢較為緩慢，側(cè)向收集方式增加趨勢更迅速，側(cè)向收集方式具有更好的線性。除此之外，前向收集方式收集裝置與入射光同軸，因此散射光的收集極易受入射光影響產(chǎn)生誤差。而側(cè)向收集方式收集裝置位于入射軸正交方向，有效避免了入射光的干擾，因此檢測腔設(shè)計中選用側(cè)向光收集結(jié)構(gòu)更為合理。

圖9 相對收集量變化趨勢

3 性能測試與分析

組裝完成的儀器裝置如圖10所示。

圖10 微生物粒子計數(shù)裝置

對氣溶膠樣本進(jìn)行采樣，圖11 為熒光通道和散射光通道的檢測信號，通過設(shè)計的算法對脈沖信號進(jìn)行統(tǒng)計，即可獲得不同粒子的數(shù)量。將其中較為明顯的特征信號進(jìn)行分析，圖12（a）為一個普通塵埃粒子經(jīng)過檢測區(qū)時，散射光通道產(chǎn)生了一個光脈沖信號，而熒光通道無信號；圖12（b）為一個微生物粒子通過檢測區(qū)時，散射光通道和熒光通道均產(chǎn)生一個光脈沖。測試結(jié)果證明，本文檢測裝置可以完成微生物粒子的檢測，并實(shí)現(xiàn)微生物粒子與普通塵埃粒子的區(qū)分。

圖11 熒光和散射光檢測信號

圖12 單個粒子檢測信號

4 結(jié) 論

本文通過對色氨酸、NAD ＋、核黃素等熒光活性分子的光譜測試，獲得了激發(fā)波長和熒光發(fā)射波長，選定了405 nm的激發(fā)光。通過對金黃色葡萄球菌等微生物粒子的光譜測試，進(jìn)一步證實(shí)了405 nm激發(fā)光可以有效地激發(fā)微生物粒子的熒光信號。對儀器整體結(jié)構(gòu)、光學(xué)檢測腔等進(jìn)行了設(shè)計，完成了檢測裝置的構(gòu)建。初步測試結(jié)果表明，該裝置可以實(shí)現(xiàn)對空氣中各種粒子的散射光信號和微生物粒子的熒光信號探測。下一步將對該裝置進(jìn)行標(biāo)定，為進(jìn)一步研制氣溶膠微生物粒子濃度監(jiān)測儀器奠定基礎(chǔ)。