郭偉娜,陶 晶,何夢婷,王紫葦,馬佰賀,趙 磊

(1.安徽科技學(xué)院 動物科學(xué)學(xué)院,安徽 鳳陽 233100; 2.動物營養(yǎng)調(diào)控與健康安徽省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,安徽 鳳陽 233100)

沙門菌是能夠引起人類食源性傳染性疾病的重要食物致病菌之一[1]。我國由致病菌引起的食物中毒事件70%～80%是由沙門菌引起,人和動物感染后主要表現(xiàn)為嘔吐、腹瀉、傷寒、副傷寒、敗血癥等病癥。因此,沙門菌具有重要的醫(yī)學(xué)、獸醫(yī)學(xué)和公共衛(wèi)生學(xué)研究意義[2]。沙門菌血清型很多,已報道的有2 600多種,其中研究較多的可引起人獸共患的主要為腸炎沙門菌和鼠傷寒沙門菌兩種血清型[3-5]。研究表明,從零售肉制品中分離的341株腸道沙門菌中59.5%為腸炎沙門菌(203/341),腸炎沙門菌可在奶、肉、蛋類生物制品中存活幾個月,還可通過糞便威脅公共衛(wèi)生安全,是飼養(yǎng)環(huán)境中主要的致病菌之一。李世楷等[6]從廣東地區(qū)送檢的316份水禽病料樣品中分離鑒定出188株沙門菌,其中鵝源鼠傷寒沙門菌占82.97%,并且多數(shù)菌株具有多重耐藥性。鼠傷寒沙門菌感染雞的臨床表現(xiàn)主要有精神萎靡,食欲降低,閉眼縮頸,羽毛蓬亂,有白色糨糊狀稀糞排出,最終死于全身衰竭或敗血癥。鼠傷寒沙門菌病既能水平傳播又能垂直傳播,對畜禽養(yǎng)殖業(yè)危害較大[7]。

鼠傷寒沙門菌是一種很常見的病原菌,可從禽、豬、牛等多種動物及其產(chǎn)品中分離得到[8]。有些菌株除了引起局部胃腸炎,還能引起全身感染,例如菌株ST313和ST19等[9-10]。沙門菌含有的多種毒力因子與其致病性密切相關(guān),包括菌毛、鞭毛、脂多糖、毒素、毒力島、毒力質(zhì)粒等[11]。這些毒力因子相關(guān)基因多數(shù)位于毒力島SPI-1、SPI-2、SPI-3、SPI-4、SPI-5上,包括invA、invJ、virK、sipA、sopA、ssaB、misL、orf319、ssa、ssc、sse、pipC、mogA、mgtC、bcfA、araB等基因;少數(shù)毒力基因位于質(zhì)粒上,如spvR、spvA、spvB、spvC、spvD等[12]。沙門菌的致病性主要是由毒力基因之間的相互作用決定[13,14]。目前,已從不同血清型的沙門菌中發(fā)現(xiàn)了24個毒力島[15],其中SPI-1、SPI-2、SPI-3、SPI-4、SPI-5研究比較深入,例如SPI-1和SPI-2編碼的Ⅲ型分泌系統(tǒng)主要是通過轉(zhuǎn)運(yùn)毒力蛋白而影響宿主細(xì)胞功能[2]。本研究主要是對疑似沙門菌感染的病死產(chǎn)蛋雞進(jìn)行病原的分離鑒定和藥敏試驗(yàn),并對其5個毒力質(zhì)?；?spvR、spvA、spvB、spvC、spvD)和23個毒力島基因(SPI-1、SPI-2、SPI-3、SPI-4、SPI-5、invA、invJ、virK、sipA、sopA、araB、ssaB、sscA、sseC、sseD、ssE、sseL、mogA、mgtC、misL、orf319、bcfA、pipC)進(jìn)行PCR檢測及測序,深入了解沙門菌中毒力基因的分布和變異情況,從而為研究沙門菌的致病機(jī)理、減毒菌株的構(gòu)建和弱毒疫苗的研制等奠定基礎(chǔ),為禽源沙門菌病的防控技術(shù)研究提供重要參考,同時對保障人類健康和公共衛(wèi)生學(xué)等也具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料

藥敏試驗(yàn)圓紙片,購自天和微生物(杭州)公司;細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒,購自北京天根生化科技有限公司;血瓊脂培養(yǎng)基,購自常德比克曼生物科技有限公司;亞硫酸鉍瓊脂培養(yǎng)基(BS),購自青島海博生物技術(shù)有限公司;PCR MasterMix、50×TAE緩沖液、DNA Marker DL2000,購自生工生物工程(上海)有限公司;生化培養(yǎng)基由本實(shí)驗(yàn)室配制。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 病料來源

2021年7月,安徽省鳳陽縣某養(yǎng)殖戶共飼養(yǎng)3 000只產(chǎn)蛋雞,270日齡開始出現(xiàn)死亡,病雞精神沉郁,采食量下降,排出黃白色或黃綠色稀糞。送檢5只280日齡病死雞,經(jīng)剖檢發(fā)現(xiàn)肝臟腫大、壞死、出血、質(zhì)地變脆,脾臟腫大、壞死,肺臟充血、出血,胃腸道黏膜也有出血等敗血癥變化。

1.2.2 分離培養(yǎng)

從病死產(chǎn)蛋雞的脾臟組織蘸取病料,分別接種到普通營養(yǎng)瓊脂、麥康凱培養(yǎng)基、血瓊脂培養(yǎng)基、BS培養(yǎng)基上,37 ℃培養(yǎng)24 h后觀察分離菌在不同培養(yǎng)基上的菌落特征。然后挑取麥康凱培養(yǎng)基上的無色單菌落和BS培養(yǎng)基上的黑色菌落進(jìn)一步純化培養(yǎng)。

1.2.3 染色鏡檢

用無菌接種環(huán)從BS培養(yǎng)基上挑取分離菌純培養(yǎng)物的單個菌落制備細(xì)菌抹片,進(jìn)行革蘭染色鏡檢,觀察菌體形態(tài)特征。

1.2.4 模板制備

取分離菌純培養(yǎng)物的單個菌落接種至LB液體培養(yǎng)基中,37 ℃過夜培養(yǎng),采用離心柱型細(xì)菌基因組提取試劑盒(天根)從菌液中提取核酸作為模板,樣品于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.5 PCR擴(kuò)增及測序分析

利用細(xì)菌16S rRNA基因的通用引物(27-F:AGAGTTTGATCATGGCTCAG,1525-R:AAGGAGGTGATCCAACC),進(jìn)行PCR擴(kuò)增及測序分析。PCR反應(yīng)體系為50 μL:PCR Mix 25 μL,上下游引物各為2 μL,模板5 μL,滅菌水16 μL。PCR反應(yīng)條件為:95 ℃ 5 min;95 ℃ 30 s,55 ℃ 30 s,72 ℃ 60 s,共35個循環(huán);72 ℃ 10 min。

取5 μL PCR產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測,將有目的條帶的擴(kuò)增產(chǎn)物送至安徽通用生物有限公司測序,將16S rRNA基因的測序結(jié)果在NCBI網(wǎng)站核酸數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行序列比對分析,并用DNAStar軟件中的Megalign程序進(jìn)行同源性分析和遺傳進(jìn)化樹的構(gòu)建。

1.2.6 生化試驗(yàn)

用接種針將分離菌分別接種至不同糖發(fā)酵管中(葡萄糖、乳糖、麥芽糖、蔗糖、甘露醇),37 ℃培養(yǎng)24 h,檢測分離菌對糖的發(fā)酵情況;采用接種環(huán)將分離菌分別接種至蛋白胨水和葡萄糖蛋白胨水中,37 ℃培養(yǎng)24 h,檢測吲哚形成試驗(yàn)、甲基紅試驗(yàn)、二乙酰試驗(yàn)結(jié)果。

1.2.7 藥敏試驗(yàn)

用圓紙片擴(kuò)散法測定分離株對10大類共26種藥物的敏感性,具體包括:青霉素類藥物(氨芐西林、苯唑西林、羧芐西林)、氨基糖苷類藥物(新霉素、卡那霉素、丁胺卡那霉素、奈替米星)、頭孢菌素類藥物(頭孢哌酮、頭孢西丁、頭孢氨芐、頭孢噻肟、頭孢呋辛、頭孢曲松)、喹諾酮類藥物(氧氟沙星、環(huán)丙沙星、諾氟沙星、恩諾沙星)、氯霉素類藥物(氟苯尼考)、四環(huán)素類藥物(多西環(huán)素)、多肽類藥物(多黏菌素B、萬古霉素)、磺胺類藥物(復(fù)方新諾明)、大環(huán)內(nèi)酯類藥物(紅霉素、麥迪霉素)、林可酰胺類藥物(林可霉素、克林霉素)。37 ℃培養(yǎng)24 h后測定抑菌圈直徑,參照CLSI標(biāo)準(zhǔn)判定藥物敏感性。

1.2.8 毒力基因檢測

參照相關(guān)文獻(xiàn)中沙門菌的28個毒力基因引物序列[16-19],由安徽通用生物有限公司合成引物,引物序列及擴(kuò)增目的片段大小見表1。毒力基因的PCR擴(kuò)增體系為50 μL:PCR Mix 25 μL,上下游引物各為2 μL,模板5 μL,滅菌水16 μL。invA、spvR、spvA、spvB、spvC、spvD、sseE、sseL、mogA、mgtC、bcfA、araB這12個毒力基因的PCR反應(yīng)條件為:95 ℃ 5 min;95 ℃ 30 s,55 ℃ 30 s,72 ℃ 60 s,共35個循環(huán);72 ℃ 10 min。其余16個毒力基因的PCR體系調(diào)整為95 ℃ 5 min;95 ℃ 30 s,50 ℃ 30 s,72 ℃ 60 s,共35個循環(huán);72 ℃ 10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.0 %瓊脂糖凝膠電泳檢測,將有目的條帶的PCR產(chǎn)物送至安徽通用生物有限公司測序,測序結(jié)果在NCBI的GenBank中進(jìn)行序列比對分析。

表1 引物序列及目的片段大小

2 結(jié)果與分析

2.1 分離培養(yǎng)與鏡檢結(jié)果

分離菌在普通營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上表現(xiàn)為圓形、邊緣平整,表面光滑、濕潤、不透明、輕度隆起的灰白色小菌落;在麥康凱瓊脂培養(yǎng)基上為圓形、表面光滑、濕潤的無色菌落;在血瓊脂培養(yǎng)基上為圓形、表面光滑、濕潤的灰白色中等大小的菌落;在BS培養(yǎng)基上表現(xiàn)為光滑、圓形、黑色帶有金屬光澤的中等大小菌落,具體見圖1。分離菌經(jīng)革蘭染色鏡檢表現(xiàn)為革蘭陰性、無芽孢、紅色的短桿菌,如圖2,形態(tài)染色結(jié)果與沙門菌相符。

A,普通營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基;B,麥康凱瓊脂培養(yǎng)基;C,血瓊脂培養(yǎng)基;D,BS培養(yǎng)基。A, The ordinary agar; B, MacConkey agar; C, Blood agar; D, BS medium.

圖2 分離菌革蘭染色鏡檢結(jié)果(1 000×)Fig.2 Microscopic examination of isolated bacteria by Gram staining (1 000×)

2.2 16S rRNA基因的PCR擴(kuò)增結(jié)果

16S rRNA基因的PCR擴(kuò)增結(jié)果如圖3,擴(kuò)增出1 500 bp大小條帶,與預(yù)期相符。將測序結(jié)果在NCBI網(wǎng)站進(jìn)行序列比對分析,發(fā)現(xiàn)分離菌與鼠傷寒沙門菌OLF-FSR1-WB-Sparrow-ST-87菌株的16S rRNA基因(GenBank登錄號:CP051276)相似性為99.86%。

M,DL2 000 DNA marker;1,陰性對照;2,分離菌。M, DL2 000DNA marker; 1, Negative control; 2, the isolated bacteria.

2.3 16S rRNA基因的遺傳進(jìn)化分析結(jié)果

將分離菌16S rRNA基因測序結(jié)果(seq1)與GenBank中10株沙門菌參考菌株的16S rRNA基因序列(表2),用DNAStar軟件中的Megalign程序進(jìn)行同源性分析,發(fā)現(xiàn)其同源性介于99.5%～100%(圖4)?；?6S rRNA基因序列構(gòu)建的遺傳進(jìn)化樹,7個鼠傷寒沙門菌參考菌株均位于同一個分支,同源性較高(圖5)。因此,分離菌經(jīng)鑒定為鼠傷寒沙門菌,菌株命名為FY2021,將其16S rRNA基因測序結(jié)果上傳至GenBank,獲得登錄號為OM996201。

圖4 16S rRNA基因序列同源性分析Fig.4 Homology analysis of 16S rRNA sequence

圖5 基于16S rRNA基因序列構(gòu)建的遺傳進(jìn)化樹Fig.5 Construction of genetic evolutionary tree based on 16S rRNA sequences

表2 腸道沙門菌參考菌株信息

2.4 生化試驗(yàn)結(jié)果

生化試驗(yàn)表明,鼠傷寒沙門菌分離株能發(fā)酵葡萄糖、麥芽糖和甘露醇,但不發(fā)酵乳糖和蔗糖,吲哚形成試驗(yàn)陰性,甲基紅試驗(yàn)陽性,二乙酰試驗(yàn)陰性,枸櫞酸鹽利用試驗(yàn)陽性,生化試驗(yàn)結(jié)果與鼠傷寒沙門菌的生化特性相符。

2.5 藥敏試驗(yàn)結(jié)果

鼠傷寒沙門菌分離株對不同抗菌藥物的敏感性結(jié)果見表3,由表可知,對喹諾酮類藥物、氯霉素類、四環(huán)素類均為敏感,除多西環(huán)素的抑菌圈為18 mm以外,其他藥物的抑菌圈均在25 mm以上;對氨基糖胺類、頭孢菌素類藥物部分敏感,例如丁胺卡那霉素、奈替米星、頭孢哌酮、頭孢西丁、頭孢噻肟、頭孢曲松,其他為中度敏感;對多肽類、磺胺類、大環(huán)內(nèi)酯類、林克酰胺類藥物多數(shù)為耐藥,僅對多粘菌素B為中度敏感;另外對青霉素類藥物抑菌效果差異較大,其中苯唑西林耐藥,氨芐西林中度敏感,羧芐西林敏感。

表3 抑菌圈直徑測定結(jié)果

2.6 毒力基因的PCR檢測結(jié)果

鼠傷寒沙門菌分離株的28個毒力基因PCR擴(kuò)增結(jié)果見圖6,除了sseC基因由于濃度過低而測序失敗外,其余27個毒力基因均擴(kuò)增出目的條帶并成功測序。將測序結(jié)果與GenBank數(shù)據(jù)庫中沙門菌參考菌株的相應(yīng)基因序列比對分析,發(fā)現(xiàn)其相似性介于98.58%～100%,具體見表4。

M,DL2 000 DNA marker ;1～12,分別為毒力基因invA、spvR、spvA、spvB、spvC、spvD、sseE、sseL、mogA、mgtC、bcfA 和araB;13～28,分別為毒力基因invJ、sscA、sseC、sseD、virK、sipA、sopA、ssaB、misL、ofr319、pipC、SPI-1、SPI-2、SPI-3、SPI-4 和SPI-5。M, DL2 000 DNA marker;1-12, genes of invA, spvR, spvA, spvB, spvC, spvD, sseE, sseL, mogA, mgtC, bcfA and araB respectively.13-28, genes of invJ, sscA, sseC, sseD, virK, sipA, sopA, ssaB, misL, ofr319, pipC, SPI-1, SPI-2, SPI-3, SPI-4 and SPI-5, respectively.

表4 毒力基因相似性比對結(jié)果

3 討論

鼠傷寒沙門菌是一種分布于世界多個地區(qū)的重要食源性病原,已嚴(yán)重威脅到人類健康和公共衛(wèi)生安全。人類一般是因食用鼠傷寒沙門菌污染的動物產(chǎn)品而感染,因此,鼠傷寒沙門菌病的主要防治措施是控制養(yǎng)殖生產(chǎn)中的鼠傷寒沙門菌[20]。研究發(fā)現(xiàn),在澳大利亞鼠傷寒沙門菌是蛋雞沙門菌病暴發(fā)的主要原因[21],也是我國沙門菌中的主要血清型[22]。目前,沙門菌的診斷方法有分離培養(yǎng)、血清學(xué)方法、PCR檢測、基因芯片等技術(shù)[23],其中多重PCR方法有利于不同血清型沙門菌的快速鑒定。李師瑩等[24]采用四重PCR檢測方法從臨床病料中分離到63株沙門菌,其中33株為腸炎沙門菌,9株為鼠傷寒沙門菌,2株為雞白痢沙門菌。蔣小武等[25]從某農(nóng)貿(mào)市場采集的920份樣本中檢出159份沙門菌陽性樣品,采用PCR分子分型技術(shù)檢出8株腸炎沙門菌與1株鼠傷寒沙門菌。不同血清型沙門菌的分布可能與養(yǎng)殖環(huán)境、鳥類傳播等有關(guān),例如水禽主要在水中活動,與鳥類接觸機(jī)會更多,也更容易導(dǎo)致沙門菌散播。因此,需加強(qiáng)養(yǎng)殖業(yè)中沙門菌病的檢疫和防控,以及畜禽產(chǎn)品中的鼠傷寒沙門菌病原學(xué)監(jiān)測,減少或避免食源性疾病的發(fā)生。

本研究從病死產(chǎn)蛋雞的脾臟組織中分離鑒定出一株鼠傷寒沙門菌,分離株對喹諾酮類、氯霉素類、四環(huán)素類藥物均較敏感,其中對環(huán)丙沙星最為敏感,抑菌圈達(dá)30 mm;對丁胺卡那霉素、奈替米星、頭孢哌酮、頭孢西丁、頭孢噻肟、頭孢曲松敏感;對多肽類、磺胺類、大環(huán)內(nèi)酯類、林可酰胺類藥物多數(shù)為耐藥。張啟龍等[26]分離的1株信鴿源鼠傷寒沙門菌對頭孢噻肟、頭孢哌酮、多西環(huán)素、諾氟沙星和氧氟沙星等敏感,對新霉素中度敏感,與本研究一致,但對氟苯尼考表現(xiàn)耐藥,與本研究結(jié)果差異較大?？足懙萚27]分離的4株鵝源鼠傷寒沙門菌對諾氟沙星、頭孢曲松等敏感,與本研究相符,但不同的是對多黏菌素B和多西環(huán)素表現(xiàn)耐藥。程旭等[28]分離的1株肉鴿源鼠傷寒沙門菌對20種抗菌藥均敏感,僅對鏈霉素中度敏感。王彥紅等[29]從214份病死鵝分離的50株沙門菌中有30株為鼠傷寒沙門菌,其中20株鼠傷寒沙門菌表現(xiàn)多重耐藥。周榮云等[7]分離的21株禽源鼠傷寒沙門菌對新霉素、丁胺卡那霉素、卡那霉素敏感,但對喹諾酮類、頭孢菌素類、多肽類、四環(huán)素類、磺胺類等部分耐藥,其中10株菌為多重耐藥。軒慧勇等[30]從不同動物中分離到162株鼠傷寒沙門菌,其中有159株菌表現(xiàn)為多重耐藥。由此可見,我國不同地區(qū)的鼠傷寒沙門菌分離株耐藥性差異較大,多重耐藥呈現(xiàn)增加趨勢。耐藥性發(fā)展迅速多是由于濫用或過度使用抗生素造成[31],因此,養(yǎng)殖場必須合理應(yīng)用抗菌藥,定期進(jìn)行耐藥性監(jiān)測,控制耐藥菌的傳播,對沙門菌病的防控至關(guān)重要。另外,養(yǎng)殖場還要建立生物安全體系,做好飼養(yǎng)管理和衛(wèi)生消毒等工作。

本研究對鼠傷寒沙門菌分離株28個毒力基因的PCR檢測發(fā)現(xiàn),除了sseC基因未檢出外,其余27個毒力基因均被檢出,測序結(jié)果與參考菌株相應(yīng)基因的相似性介于98.58%～100%之間。楊文文等[11]分離的25株雞源沙門菌分離株中有9株腸炎沙門菌、8株雞白痢沙門菌和8株鼠傷寒沙門菌,分離菌均攜帶多種毒力基因,而毒力島基因gipA和毒力質(zhì)?；騭pvB只在鼠傷寒沙門菌中檢出。王德寧等[32]從44株雞源沙門菌分離株中共檢出invJ、virK、sipA、sopA、ssaB、misL、orf319、pipC這8種毒力基因。張啟龍等[26]從鼠傷寒沙門菌分離株中檢測出mogA、sseL、mgtC、bcfA、araB、spvA、spvB、spvC、spvD、spvR、sopA、virK這12種毒力基因,均與本研究一致。王德寧[32]、張珍等[12]發(fā)現(xiàn),沙門菌分離株的致病性與其攜帶的毒力基因種類呈正相關(guān)。研究表明,沙門菌可通過質(zhì)粒轉(zhuǎn)移獲得新的毒力基因,其水平方向的傳遞可使菌株毒力發(fā)生改變,從而改變沙門菌對宿主的致病性[33]。李仕楷等[6]通過構(gòu)建鵝源鼠傷寒沙門菌crp、hfq基因缺失株并鑒定其生物學(xué)特性,研究這兩個毒力基因的功能從而為沙門菌病的疫苗研發(fā)提供參考。研究證實(shí)耐藥基因的轉(zhuǎn)移也可能影響毒力基因的表達(dá)[34],因此,沙門菌耐藥性、毒力相關(guān)基因的研究,對沙門菌的致病機(jī)理闡釋和沙門菌病的綜合防控意義深遠(yuǎn)。

本研究通過病原分離鑒定、PCR檢測等方法從送檢的病死產(chǎn)蛋雞分離鑒定出一株鼠傷寒沙門菌菌株FY2021,其對環(huán)丙沙星最為敏感,同時攜帶27種毒力基因,從而為深入研究鼠傷寒沙門菌的致病機(jī)理、減毒菌株的構(gòu)建和弱毒疫苗的研制等提供參考依據(jù)。