俞瑞鮮,胡秀卿,柳新菊,湯 濤,吳 珉,吳聲敢,趙學(xué)平,*

(1.浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全與營(yíng)養(yǎng)研究所,浙江 杭州 310021; 2.農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全危害因子與風(fēng)險(xiǎn)防控國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,浙江 杭州 310021)

在蠶繭生產(chǎn)季節(jié),由于桑園周邊的農(nóng)藥漂移、施藥設(shè)備農(nóng)藥殘留或直接在桑園中進(jìn)行害蟲(chóng)防治,桑葉極易受到農(nóng)藥污染[1]。近年來(lái),隨著現(xiàn)代農(nóng)業(yè)的發(fā)展,蠶區(qū)周邊經(jīng)濟(jì)作物的大面積種植,農(nóng)藥的使用頻率不斷增加,用藥種類也不斷增多。國(guó)內(nèi)每年因桑園農(nóng)藥使用不當(dāng)或桑園周圍其他農(nóng)作物使用農(nóng)藥污染導(dǎo)致家蠶中毒的情況時(shí)有發(fā)生,嚴(yán)重影響蠶農(nóng)的收入和蠶桑產(chǎn)業(yè)的發(fā)展[2-6]。如2018年廣西因桑園周邊柑橘園施用農(nóng)藥導(dǎo)致大面積家蠶發(fā)生不同程度的不吐絲不結(jié)繭的情況,蠶農(nóng)損失約1 000萬(wàn)元[7]。因此,有關(guān)農(nóng)藥對(duì)家蠶的研究也越來(lái)越受到重視,農(nóng)藥對(duì)家蠶生長(zhǎng)發(fā)育毒性的研究也逐漸成為了熱點(diǎn)。已有研究表明,隨著農(nóng)藥的不斷攝入,低劑量的藥劑雖然不足以導(dǎo)致家蠶急性中毒,但對(duì)家蠶的發(fā)育歷期、眠蠶體重、化蛹率、全繭量、繭層量、繭層率、結(jié)繭率等方面均有不同程度的影響,且存在一定的劑量-效應(yīng)關(guān)系[8-11]。

氰戊菊酯(fenvalerate)是擬除蟲(chóng)菊酯類農(nóng)藥的主要品種之一,因其高效、低毒、適用范圍廣,被廣泛用于棉花、果樹(shù)、蔬菜、大豆、小麥等作物的害蟲(chóng)防治。研究表明,氰戊菊酯對(duì)魚(yú)類、蚯蚓等非靶標(biāo)生物具有發(fā)育毒性、免疫毒性、神經(jīng)毒性、生殖毒性,并能誘導(dǎo)產(chǎn)生氧化應(yīng)激、細(xì)胞凋亡、DNA損傷以及組織病理學(xué)的改變[12-18]。近年來(lái)氰戊菊酯也被證實(shí)是一種潛在的環(huán)境污染物和內(nèi)分泌干擾物,在人體和大部分的環(huán)境介質(zhì)中均可檢出[19]。盡管已有研究表明,氰戊菊酯對(duì)家蠶具有較高的急性毒性,且持效期較長(zhǎng)[20-21],但目前尚未明確其對(duì)家蠶生長(zhǎng)發(fā)育的影響。隨著氰戊菊酯在農(nóng)?；煸詤^(qū)的廣泛施用,可能通過(guò)水源、霧滴漂移、噴霧器械等途徑污染桑園。其污染濃度通常低于田間實(shí)際施用濃度,但隨著時(shí)間的推移家蠶仍然有可能接觸到亞致死濃度的氰戊菊酯。因此,本研究采用浸葉法測(cè)定了亞致死劑量氰戊菊酯對(duì)家蠶的生長(zhǎng)發(fā)育影響,以闡明氰戊菊酯對(duì)家蠶的亞致死效應(yīng),以期為農(nóng)?；煸詤^(qū)殺蟲(chóng)劑的合理使用提供科學(xué)依據(jù),確保蠶桑產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。

1 材料與方法

1.1 材料

家蠶(Bombyxmori),品種為芙蓉、湘輝和皓月,由浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蠶桑與茶葉研究所提供。用常規(guī)方法催青并飼養(yǎng)至2齡起蠶供試。桑樹(shù)品種為農(nóng)桑12號(hào),采自浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蠶桑與茶葉研究所桑園,未接觸農(nóng)藥。

1.2 主要儀器與試劑

儀器:PL203-IC型電子天平[感量0.001 g,梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司],MLR-351 H植物培養(yǎng)箱(日本三洋電機(jī)株式會(huì)社),JWS-A5溫濕度表(北京寶力馬傳感技術(shù)有限公司)。

試劑:90%氰戊菊酯原藥,杭州慶豐農(nóng)化有限公司;分析純丙酮,永華化學(xué)股份有限公司;分析純吐溫-80,國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.3 急性毒性試驗(yàn)

參照國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 31270.11—2014[22],采用“浸葉法”,選擇健康且大小一致的2齡起蠶進(jìn)行試驗(yàn)。先將氰戊菊酯原藥以丙酮為溶劑,配制成一定濃度的母液,冷藏備用。在預(yù)試明確有效濃度范圍的基礎(chǔ)上,將配制好的母液用含0.1%吐溫-80的水以等比級(jí)差稀釋至6個(gè)系列梯度濃度。將桑葉于不同濃度的藥液中浸漬10 s,取出在通風(fēng)處懸掛自然晾干,然后將桑葉放入直徑15 cm的培養(yǎng)皿內(nèi)供試。每個(gè)濃度重復(fù)3次,每重復(fù)20頭蠶,同時(shí)設(shè)計(jì)空白對(duì)照和助劑對(duì)照(以最高濃度組所含丙酮量一致的含0.1%吐溫-80的水處理)。處理后的家蠶置于溫度為24～26 ℃、相對(duì)濕度為70%～85%、光周期為16 L∶8 D的人工氣候箱內(nèi),觀察并記錄處理24、48、72和96 h后家蠶的中毒癥狀和死亡數(shù)。用鑷子輕觸蟲(chóng)體不動(dòng)作為判斷死亡的標(biāo)準(zhǔn)。對(duì)照組死亡率小于5%的試驗(yàn)為有效試驗(yàn)。

1.4 亞致死效應(yīng)試驗(yàn)

根據(jù)急性毒性試驗(yàn)結(jié)果,選擇較為敏感的品種皓月用于亞致死效應(yīng)試驗(yàn)。按照氰戊菊酯96 h-LC50值的1/4、1/12、1/36、1/108、1/324設(shè)置5個(gè)試驗(yàn)濃度(0.062 8、0.020 9、0.006 98、0.002 33和0.000 775 mg·L-1),采用“浸葉法”,選擇健康且大小一致的2齡起蠶進(jìn)行氰戊菊酯對(duì)家蠶的亞致死效應(yīng)試驗(yàn)。參照1.3節(jié)的藥液處理方法配制各濃度藥液,將桑葉于不同濃度的藥液中浸漬10 s,取出在通風(fēng)處懸掛自然晾干。每個(gè)濃度為1個(gè)處理,每處理3個(gè)重復(fù),每重復(fù)15頭2齡起蠶,同時(shí)設(shè)計(jì)空白對(duì)照和助劑對(duì)照(以最高濃度組所含丙酮量一致的含0.1%吐溫80的水處理)。處理后的家蠶置于光周期16 h(L)∶8 h(D)、相對(duì)濕度70 %～85 %的人工氣候箱內(nèi)微光飼養(yǎng),直至上蔟結(jié)繭。2齡家蠶的飼養(yǎng)溫度為26 ℃～28 ℃,隨著齡期的增長(zhǎng),每一齡期的溫度降低1 ℃。家蠶上簇后移至人工氣候室中,溫度24 ℃,濕度75%,自然光偏暗均勻。

試驗(yàn)期間,2～3齡蠶每2 d更換一次藥液處理的桑葉,4～5齡蠶每天更換有毒桑葉,持續(xù)飼喂至家蠶成熟,整個(gè)試驗(yàn)飼養(yǎng)至結(jié)繭、化蛹為止。每天觀察并記錄家蠶的異常行為和死亡數(shù),同時(shí)記錄各齡期家蠶的發(fā)育歷期和存活眠蠶體重。上蔟開(kāi)始時(shí)統(tǒng)計(jì)上蔟的家蠶數(shù),結(jié)繭后第8天稱取全繭量、繭層量、蛹重,統(tǒng)計(jì)良蛹數(shù)量,計(jì)算繭層率、死籠率和化蛹率;凡繭內(nèi)的死蠶、死蛹、病蠶、病蛹、半蛻皮蛹(包住胸部或尾部2個(gè)以上環(huán)節(jié))、不蛻皮蛹、尾部3個(gè)環(huán)節(jié)呈黑色的蛹和雖然健康但未化蛹的毛腳蠶,均記為死籠繭。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

用DPS 數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)18.10 高級(jí)版計(jì)算氰戊菊酯對(duì)家蠶72 h和96 h的半致死濃度值(72 h-LC50和96 h-LC50)及其95%置信限,采用Duncan新復(fù)極差法對(duì)各個(gè)生物學(xué)指標(biāo)進(jìn)行差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 氰戊菊酯對(duì)3個(gè)不同品種家蠶的急性毒性

90%氰戊菊酯原藥對(duì)芙蓉、湘輝和皓月3個(gè)不同品種家蠶的急性毒性結(jié)果見(jiàn)表1。結(jié)果表明:90%氰戊菊酯原藥對(duì)皓月的急性毒性最高,其72 h和96 h的LC50(95%置信限)分別為0.299(0.257～0.331)mg·L-1和0.251(0.179～0.299)mg·L-1,為劇毒;對(duì)湘輝的急性毒性次之,其72 h和96 h的LC50(95%置信限)分別為0.348(0.315～0.411)mg·L-1和0.323(0.299～0.366)mg·L-1,為劇毒;對(duì)芙蓉的急性毒性略低,其72 h和96 h的LC50(95%置信區(qū)間)分別為0.743(0.687～0.828)mg·L-1和0.570(0.469～0.667)mg·L-1,為高毒。在本次試驗(yàn)條件下,3個(gè)品種的家蠶對(duì)氰戊菊酯的敏感性依次為皓月>湘暉>芙蓉。

表1 氰戊菊酯對(duì)家蠶的急性毒性結(jié)果

在試驗(yàn)過(guò)程中,不同品種的家蠶經(jīng)氰戊菊酯處理后均出現(xiàn)了一定程度的中毒癥狀,如拒食、體扭曲和吐水等。

2.2 亞致死劑量的氰戊菊酯對(duì)家蠶的生長(zhǎng)發(fā)育毒性

2.2.1 對(duì)家蠶眠蠶體重的影響

用亞致死劑量的氰戊菊酯藥液處理的桑葉飼喂2齡起蠶,各眠期家蠶幼蟲(chóng)的體重變化如圖1。0.062 8、0.020 9和0.006 98 mg·L-1氰戊菊酯處理組的2眠蠶體重均略低于空白對(duì)照組和助劑對(duì)照組,其中0.062 8 mg·L-1氰戊菊酯處理組的2眠蠶體重顯著低于空白對(duì)照組,但與助劑對(duì)照組差異不顯著,其余處理組2眠蠶體重與對(duì)照組均無(wú)顯著差異(P<0.05)。而各處理組的3眠和4眠蠶體重與對(duì)照組均無(wú)顯著差異(P<0.05)。

數(shù)據(jù)間無(wú)相同小寫(xiě)字母的表示差異顯著(P<0.05)。Values with different lowercase letters indicate the significant difference (P<0.05).

可見(jiàn),亞致死劑量的氰戊菊酯對(duì)眠蠶體重有一定的影響,隨著家蠶齡期的增長(zhǎng),對(duì)眠蠶體重的影響也逐漸減弱。

2.2.2 對(duì)家蠶發(fā)育歷期的影響

用亞致死劑量的氰戊菊酯藥液處理的桑葉飼喂2齡起蠶,各齡期家蠶發(fā)育歷期總體呈現(xiàn)先縮短再延長(zhǎng)的變化趨勢(shì)(表2)。各處理組家蠶2齡發(fā)育歷期均短于對(duì)照組,除0.006 98 mg·L-1處理組外,其余處理組家蠶2齡的發(fā)育歷期均與對(duì)照組存在顯著差異(P<0.05)。與對(duì)照組相比,各處理組家蠶3齡發(fā)育歷期均有所延長(zhǎng),其中0.000 775 mg·L-1處理組家蠶3齡的發(fā)育歷期顯著長(zhǎng)于對(duì)照組(P<0.05)。0.000 775 mg·L-1處理組家蠶4齡的發(fā)育歷期顯著短于對(duì)照組(P<0.05),其他各處理組家蠶4齡和5齡的發(fā)育歷期均與對(duì)照組無(wú)顯著差異(P<0.05)。可見(jiàn),亞致死劑量的氰戊菊酯對(duì)家蠶發(fā)育歷期有一定的影響,其中0.000 775 mg·L-1處理組對(duì)家蠶發(fā)育歷期的影響尤其明顯,但隨著家蠶齡期的增長(zhǎng),對(duì)發(fā)育歷期的影響也逐漸減弱。

表2 亞致死劑量氰戊菊酯對(duì)家蠶幼蟲(chóng)發(fā)育歷期的影響

2.2.3 對(duì)家蠶蛹重的影響

亞致死劑量氰戊菊酯持續(xù)飼喂對(duì)家蠶蛹重的影響見(jiàn)表3。各處理組蛹重與對(duì)照均無(wú)顯著差異(P<0.05)。

表3 亞致死劑量氰戊菊酯對(duì)家蠶經(jīng)濟(jì)學(xué)性狀的影響

2.2.4 對(duì)全繭量和繭層量的影響

亞致死劑量氰戊菊酯持續(xù)飼喂對(duì)家蠶全繭量和繭層量的影響見(jiàn)表3。0.062 8、0.020 9和0.006 98 mg·L-1氰戊菊酯處理組家蠶的全繭量略低于對(duì)照組,但與對(duì)照均無(wú)顯著差異(P<0.05)。而0.062 8、0.020 9和0.006 98 mg·L-1氰戊菊酯處理組家蠶的繭層量顯著低于對(duì)照組(P<0.05),呈現(xiàn)劑量-效應(yīng)關(guān)系?？梢?jiàn),亞致死劑量的氰戊菊酯對(duì)家蠶繭層量有顯著影響。

2.2.5 對(duì)家蠶幼蟲(chóng)死亡率、結(jié)繭率、化蛹率和死籠率的影響

亞致死劑量氰戊菊酯持續(xù)飼喂對(duì)家蠶幼蟲(chóng)期死亡率、結(jié)繭率和化蛹率的影響見(jiàn)表3。亞致死劑量的氰戊菊酯處理后,家蠶幼蟲(chóng)期的死亡率范圍為2.22%～6.67%,結(jié)繭率范圍為93.33%～97.78%,各處理間均無(wú)顯著差異(P<0.05)。0.062 8、0.020 9和0.006 98 mg·L-1氰戊菊酯處理組家蠶的化蛹率和死籠率與助劑對(duì)照無(wú)顯著差異(P<0.05);0.002 33和0.000 775 mg·L-1氰戊菊酯處理組家蠶的化蛹率和死籠率與助劑對(duì)照組差異顯著(P<0.05)?？梢?jiàn),亞致死劑量的氰戊菊酯對(duì)家蠶化蛹率和死籠率有顯著影響,且0.000 775 mg·L-1氰戊菊酯處理對(duì)化蛹率和死籠率的影響尤為明顯,蛹體發(fā)黑、變形、長(zhǎng)霉(圖2)。

A, 發(fā)黑;B和C,變形;D,長(zhǎng)霉。A, Black; B and C, Out of shape; D, Mouldy.

3 討論

目前對(duì)于亞致死劑量并沒(méi)有統(tǒng)一的界定,其取值也因研究對(duì)象和研究目的不同而有所差異,大多數(shù)選擇的劑量范圍為L(zhǎng)C10～LC30[23-25]。本研究中的氰戊菊酯通過(guò)外源污染到達(dá)桑葉上的劑量要遠(yuǎn)低于施用濃度,故選擇對(duì)家蠶的存活影響較小,但可能影響家蠶正常的生長(zhǎng)發(fā)育的試驗(yàn)劑量(0.000 775～0.062 8 mg·L-1)作為本研究的亞致死劑量。

農(nóng)藥對(duì)家蠶的生長(zhǎng)發(fā)育毒性效應(yīng)通常包括對(duì)家蠶幼蟲(chóng)眠蠶體重、發(fā)育歷期、化蛹率、蛹重、結(jié)繭率、全繭量、繭層量、繭層率等敏感指標(biāo)的影響[26],并且不同藥劑對(duì)家蠶生物學(xué)指標(biāo)的影響因藥劑的不同而有所不一致,且受影響的程度也不同。已有研究表明,在家蠶2～3齡階段暴露于0.16 mg·L-1三唑磷后,幼蟲(chóng)死亡率為0,但全繭量、繭層量和繭層率顯著降低[27];亞致死劑量的吡蟲(chóng)啉對(duì)家蠶的生長(zhǎng)發(fā)育和產(chǎn)繭量都有較大影響[28];亞致死劑量的溴蟲(chóng)腈對(duì)家蠶的發(fā)育歷期、蛹重和繭層量無(wú)不良影響,其中全繭量反而有所增加[28];在2～3齡階段暴露于0.40 mg·L-1戊唑醇后,全繭量、繭層量和繭層率分別顯著降低6.8%、11.8%和4.4%[8];亞致死劑量的甲氧蟲(chóng)酰肼對(duì)家蠶眠蠶體重、全繭量、繭層量、繭層率和結(jié)繭率等指標(biāo)均具有顯著影響[29]。本研究結(jié)果表明,亞致死劑量的氰戊菊酯處理對(duì)眠蠶體重和發(fā)育歷期有一定的影響,但隨著家蠶齡期的增長(zhǎng)其影響逐漸減弱;對(duì)家蠶化蛹率和死籠率有顯著影響(P<0.05);0.062 8、0.020 9和0.006 98 mg·L-1氰戊菊酯處理組對(duì)家蠶繭層量有顯著影響(P<0.05)。可見(jiàn),亞致死劑量的氰戊菊酯處理對(duì)家蠶的生長(zhǎng)發(fā)育造成了明顯的影響。繭層量是家蠶重要的生長(zhǎng)發(fā)育指標(biāo)和經(jīng)濟(jì)性狀,也是家蠶吐絲功能的表現(xiàn)。有研究報(bào)道,不同農(nóng)藥處理導(dǎo)致家蠶結(jié)繭率顯著降低,對(duì)家蠶絲腺進(jìn)行組織病理學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)家蠶絲腺顯著受損,絲腺體膜受損、管腔空泡化,進(jìn)而影響家蠶吐絲[8,30]。本研究中亞致死劑量的氰戊菊酯處理對(duì)家蠶繭層量的影響是否與絲腺組織的受損有關(guān)還有待進(jìn)一步研究。

本研究中,0.000 775 mg·L-1氰戊菊酯處理組對(duì)家蠶3齡和4齡發(fā)育歷期有顯著影響(P<0.05),0.002 33、0.000 775 mg·L-1氰戊菊酯處理組對(duì)家蠶化蛹率和死籠率有顯著影響(P<0.05),呈現(xiàn)非單調(diào)劑量-效應(yīng)關(guān)系,可能與氰戊菊酯的內(nèi)分泌干擾作用有關(guān)。越來(lái)越多的研究表明一些內(nèi)分泌干擾物的活性被證明具有復(fù)雜的非單調(diào)劑量-效應(yīng)關(guān)系,而不是單調(diào)的劑量-效應(yīng)關(guān)系[31-32],如滴滴伊在10-12～10-8mol·L-1的劑量范圍內(nèi),誘導(dǎo)垂體瘤細(xì)胞分泌催乳素的效應(yīng)呈倒U型曲線,硫丹、咪酰胺也表現(xiàn)出相似的劑量-效應(yīng)曲線[33-34]。阿特拉津津?qū)蓷珓?dòng)物變態(tài)的影響也被證明是非單調(diào)劑量-效應(yīng)關(guān)系[35],75 μg·L-1的阿特拉津處理能抑制虎皮蠑螈變態(tài),而250 μg·L-1時(shí)卻促進(jìn)變態(tài)[36],在1 mg·L-1時(shí)促進(jìn)南美蟾蜍變態(tài),而5 mg·L-1時(shí)抑制變態(tài),其他劑量時(shí)效應(yīng)不明顯[37]。高劑量(25 μg·kg-1·d-1)和低劑量(25 ng·kg-1·d-1)的雙酚A 降低雌鼠的生殖能力,而中間劑量(250 ng·kg-1·d-1)對(duì)雌鼠的生殖能力沒(méi)有明顯影響[38]。雙酚A經(jīng)消化道途徑給藥后,低劑量組小鼠子宮腔面積增大,子宮上皮增生明顯,但隨著雙酚A劑量的逐步增大,其子宮上皮增生作用反而逐漸減弱[39]。隨著內(nèi)分泌干擾物非單調(diào)劑量-效應(yīng)研究的不斷深入,學(xué)者們開(kāi)始從細(xì)胞毒性、細(xì)胞和組織特異性的受體和共因子、受體選擇性、受體下調(diào)和脫敏、受體競(jìng)爭(zhēng)、內(nèi)分泌負(fù)反饋等機(jī)制上對(duì)非單調(diào)劑量-效應(yīng)進(jìn)行了解釋[40-41]。而本研究中獲得的氰戊菊酯對(duì)家蠶發(fā)育歷期、化蛹率和死籠率的非單調(diào)劑量-效應(yīng)結(jié)果,其作用機(jī)制目前尚不清楚,有待進(jìn)一步深入探索。另外,本研究中獲得的非單調(diào)劑量-效應(yīng)未能呈現(xiàn)完整的非單調(diào)劑量-效應(yīng)關(guān)系,可能與本研究選擇的劑量范圍有關(guān),未能完全覆蓋整個(gè)劑量效應(yīng)關(guān)系。有觀點(diǎn)認(rèn)為即使很低劑量的內(nèi)分泌干擾物也能對(duì)生物的內(nèi)分泌系統(tǒng)產(chǎn)生干擾作用,所以內(nèi)分泌干擾物像致癌物一樣不存在安全閾值[42-43]。因此,今后針對(duì)此類內(nèi)分泌干擾物研究設(shè)計(jì)時(shí),應(yīng)該充分考慮劑量范圍,便于精準(zhǔn)掌握重點(diǎn)評(píng)價(jià)指標(biāo)。

此外,氰戊菊酯對(duì)家蠶的急性毒性為高毒或劇毒,在生產(chǎn)中通常不會(huì)在桑園內(nèi)使用,但往往容易忽略其在農(nóng)桑混栽區(qū)的使用。根據(jù)本研究結(jié)果,亞致死劑量的氰戊菊酯對(duì)家蠶眠蠶體重、發(fā)育歷期、繭層量、化蛹率、死籠率等指標(biāo)均有不同程度的影響。因此,在農(nóng)桑混栽區(qū)使用氰戊菊酯時(shí)應(yīng)與桑園保持足夠的距離,避免霧滴漂移或其他農(nóng)事活動(dòng)污染桑園引起家蠶中毒。