楊 娟，丁豐源，康鵬天，王秀琴，張國(guó)維

(甘肅省漁業(yè)技術(shù)推廣總站，甘肅 蘭州 730030)

入春以來(lái)，甘肅地區(qū)一養(yǎng)殖池塘魚(yú)病害頻發(fā)，損失嚴(yán)重，筆者通過(guò)病樣采集、細(xì)菌分離鑒定及藥敏試驗(yàn)，科學(xué)指導(dǎo)了養(yǎng)殖生產(chǎn)過(guò)程中的細(xì)菌病防治。

一、細(xì)菌分離鑒定及藥敏試驗(yàn)

1.主要癥狀 鰓部充血、鰭條出血、皮膚潰瘍、鱗片脫落、黏液增多，解剖可見(jiàn)腹水、內(nèi)臟出血、水腫等癥狀，初步診斷為細(xì)菌性感染。

2.樣品處理 將病魚(yú)在無(wú)菌環(huán)境下剖解，取內(nèi)臟置于無(wú)菌平皿中，用滅菌剪刀剪取其橫斷面，制備菌液。

3.藥敏試驗(yàn) 將菌液取100微升涂板，貼藥敏紙片，18℃下培養(yǎng)20 小時(shí)，測(cè)定抑菌圈直徑，參照NCCLS 的判斷標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行結(jié)果判定，顯示頭孢他啶、頭孢噻肟、頭孢哌酮、阿米卡星和左氟沙星抑菌效果最佳。

4.細(xì)菌分離純化 在普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板劃線接種，18℃培養(yǎng)24 小時(shí)，觀察平板細(xì)菌生長(zhǎng)情況，根據(jù)菌落的形態(tài)特點(diǎn)，挑取多個(gè)典型單菌落，涂片，鏡檢。如此反復(fù)，直到純化為單一菌落。

5.16S rRNA 序列分析 根據(jù)TIANamp Bacteria DNA Kit 試劑盒說(shuō)明書(shū)提取分離菌株的基因組DNA。

根據(jù)平板上菌落的顏色、形態(tài)、大小等特征挑取不同菌落于含LB 液體培養(yǎng)基的試管中(共12 管)，18℃過(guò)夜培養(yǎng)，第2 天依據(jù)細(xì)菌DNA 提取試劑盒的操作流程分別提取12株細(xì)菌的DNA，并進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。反應(yīng)體系：Premix Taq?(Ex Taq?Version 2.0 plus dye)12.5 微升，DNA 模板1 微升，上、下游引物各1 微升，dd 水補(bǔ)足至25 微升。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性3 分鐘，95℃變性30 秒，退火55～65℃，延伸90 秒，Cycle 39×，再延伸5 分鐘，4℃下保存。用1.5%瓊脂糖凝膠電泳并查看結(jié)果。

將PCR 產(chǎn)物條帶切割，放入1.5 毫升離心管中，根據(jù)膠回收試劑盒的操作流程分別對(duì)12 株菌落進(jìn)行膠回收。最終將PCR膠回收產(chǎn)物再次用瓊脂糖凝膠驗(yàn)證后送金唯智公司進(jìn)行16S rRNA測(cè)序。

圖1 純化后的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物

金唯智公司測(cè)序返回的12 株細(xì)菌序列分別進(jìn)行拼接并在NCBI中比對(duì)，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 菌株16S rRNA 序列分析

通過(guò)對(duì)病魚(yú)主要組織和內(nèi)臟器官進(jìn)行初步診斷及病原菌分離、16S rRNA 擴(kuò)增和測(cè)序，檢測(cè)到假單胞菌、腐敗希瓦氏菌、溫和氣單胞菌、紫色桿菌等多種病原菌，并通過(guò)藥敏試驗(yàn)，篩選出氯霉素、復(fù)方新諾明等敏感藥物，為科學(xué)指導(dǎo)養(yǎng)殖生產(chǎn)過(guò)程中的細(xì)菌病防治提供了一定依據(jù)。

二、春季魚(yú)病害綜合防治措施

1.徹底清塘消毒，殺滅病原菌 干塘后清除雜草和池底淤泥，修整并加固塘埂。經(jīng)修整過(guò)的池塘暴曬15～20 天，然后用150～200 千克/畝的生石灰溶液全池潑灑，隨即均勻翻耙底泥。排水困難的魚(yú)塘，可帶水清塘，水深為0.8～1 米時(shí)，用120～150千克/畝的生石灰溶液全池潑灑。生石灰除可殺滅野雜魚(yú)和病原菌外，還能改良底質(zhì)、中和酸性、提高pH、釋放營(yíng)養(yǎng)素，保證有機(jī)物質(zhì)的良性循環(huán)，同時(shí)還能補(bǔ)充塘魚(yú)發(fā)育生長(zhǎng)所需的鈣質(zhì)。

2.抓水質(zhì)管理，保持水環(huán)境穩(wěn)定 春季氣溫較低時(shí)，養(yǎng)殖池塘通常將水位調(diào)節(jié)為50～60 厘米，這樣有利于水溫的升高。在水體溫度達(dá)到10℃以上時(shí)開(kāi)始加注新鮮水，加水應(yīng)堅(jiān)持少量多次的原則，以防水溫驟降，同時(shí)應(yīng)適當(dāng)施有機(jī)肥，以利提高水溫。遇連續(xù)陰雨天氣時(shí)，氣壓較低，水體易缺氧，要適當(dāng)增加水深，以防水溫變化幅度過(guò)大，減少魚(yú)應(yīng)激。

3.提早開(kāi)食，科學(xué)投喂 當(dāng)池塘水溫上升到10℃以上時(shí)，一般的水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物已開(kāi)始攝食，攝食量隨水溫的升高而逐漸增大，應(yīng)及早開(kāi)食，投喂新鮮質(zhì)優(yōu)的飼料，促進(jìn)魚(yú)體質(zhì)的恢復(fù)。此時(shí)需隔天投餌1次，投餌量為魚(yú)體重的1%左右；當(dāng)池塘水溫達(dá)到15℃以上時(shí)，開(kāi)始正常投喂，每天上午9:00—10:00、下午3:00—4:00各投餌1次，投餌量為塘魚(yú)體重的3%～5%。投飼時(shí)必須嚴(yán)格遵循“四定和四看”原則，即：定時(shí)、定位、定質(zhì)、定量和看天氣、看水質(zhì)、看季節(jié)、看吃食情況。

4.加強(qiáng)越冬管理 一是越冬前強(qiáng)化培育。在越冬之前要多投喂一些富含蛋白質(zhì)、脂肪的飼料，提高越冬魚(yú)肥滿度，使其能夠順利越冬。二是防止魚(yú)體凍傷。在冬季適當(dāng)提高水位，保持相對(duì)穩(wěn)定的水溫，防止魚(yú)體凍傷，有利于增強(qiáng)魚(yú)體抗寒能力和抗應(yīng)激能力。三是規(guī)范操作，防止魚(yú)體機(jī)械損傷。冬季拉網(wǎng)、并塘、轉(zhuǎn)塘、運(yùn)輸過(guò)程中，要規(guī)范操作，防止魚(yú)體受傷。

5.準(zhǔn)確診斷，科學(xué)用藥 根據(jù)細(xì)菌分離鑒定及藥敏試驗(yàn)結(jié)果，可選用頭孢他啶、頭孢噻肟、頭孢哌酮、阿米卡星和左氟沙星等抗生素類藥物進(jìn)行對(duì)癥治療。