郭舒琪 于志君 陳潤(rùn)吉 姜愛(ài)華 晏丹 袁瓊

(武漢科技大學(xué)醫(yī)學(xué)院新藥創(chuàng)制研究所 職業(yè)危害識(shí)別與控制湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,湖北 武漢 430065)

缺血性腦卒中(IS)是導(dǎo)致死亡和殘疾的主要原因之一,其病理機(jī)制復(fù)雜,涉及能量代謝障礙、氧化應(yīng)激損傷、炎癥反應(yīng)、細(xì)胞內(nèi)鈣超載、自噬、血腦屏障破壞、細(xì)胞凋亡等〔1〕。近年來(lái)隨著測(cè)序技術(shù)和生物信息技術(shù)的飛速發(fā)展,缺血性腦卒中發(fā)病機(jī)制研究不斷深入,環(huán)狀RNA(circRNA)在IS發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后修復(fù)中發(fā)揮著重要的作用。本文主要從circRNA概述、circRNA與IS相關(guān)性及circRNA作為競(jìng)爭(zhēng)性?xún)?nèi)源RNA(ceRNA)在急性IS發(fā)生發(fā)展中的調(diào)控機(jī)制進(jìn)行綜述。

1 circRNA概述

circRNA是一類(lèi)經(jīng)過(guò)反向剪接,通過(guò)上、下游剪接位點(diǎn)以共價(jià)連接閉合形成環(huán)狀結(jié)構(gòu)的內(nèi)源性單鏈非編碼RNA〔2〕。與普通線(xiàn)性RNA相比,因缺少5'帽子及3'polyA 尾,可有效抵抗RNA外切酶的降解,因此穩(wěn)定、廣泛的分布在不同組織、細(xì)胞中,具有典型的組織特異性、細(xì)胞特異性〔3〕和時(shí)空特異性等特點(diǎn)〔4〕。 circRNA可根據(jù)剪接來(lái)源不同,分為外顯子衍生的circRNA(ecircRNAs)、內(nèi)含子衍生的circRNA(ciRNAs)和外顯子-內(nèi)含子衍生的circRNA(EIciRNA)〔5〕3類(lèi),其中外顯子衍生的 circRNA 最為豐富。研究發(fā)現(xiàn),大多數(shù)circRNA 定位于細(xì)胞質(zhì),少數(shù)circRNA 定位于細(xì)胞核內(nèi),他們可通過(guò)調(diào)節(jié)可變剪接、充當(dāng) microRNA(miRNA)海綿、隔離功能蛋白甚至編碼蛋白等方式,在轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)錄后和翻譯水平等多層面調(diào)控基因表達(dá),參與重要病理生理進(jìn)程〔3,6〕。circRNA的異常表達(dá)在腫瘤〔7〕、神經(jīng)系統(tǒng)疾病〔8〕、心血管疾病〔9〕、糖尿病(DM)〔10,11〕等多種疾病的發(fā)生、發(fā)展中起關(guān)鍵的調(diào)解作用,目前circRNA已經(jīng)成為疾病早期診斷、預(yù)后預(yù)測(cè)和靶向治療研究的新熱點(diǎn)。

2 circRNA異常表達(dá)與IS相關(guān)性

腦組織中存在大量特異性表達(dá)的circRNA,它們的存在與大腦發(fā)育、神經(jīng)遞質(zhì)功能、神經(jīng)元成熟和突觸活動(dòng)等密切相關(guān)〔8〕。越來(lái)越多的研究〔12～22〕發(fā)現(xiàn),在IS細(xì)胞和動(dòng)物模型及患者血樣中存在circRNA異常表達(dá),見(jiàn)表1。且其異常表達(dá)與IS發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后密切相關(guān)。Lin等〔12〕對(duì)氧糖剝奪/再灌注(OGD/R)的 HT22細(xì)胞進(jìn)行微陣列芯片檢測(cè)發(fā)現(xiàn),15個(gè)circRNA 發(fā)生2倍以上的顯著改變。Liu等〔13〕采用高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)OGD/R處理的大鼠腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞(BMECs)中circRNA的表達(dá)進(jìn)行檢測(cè),發(fā)現(xiàn)1 288個(gè)circRNA發(fā)生差異性改變,其中211 個(gè)上調(diào)和 326 個(gè)下調(diào),功能富集分析表明circRNA異常表達(dá)與鈣離子相關(guān)通路和環(huán)狀鳥(niǎo)苷 3′,5′-單磷酸依賴(lài)性蛋白激酶信號(hào)通路相關(guān)。局灶性大腦中動(dòng)脈阻塞/再灌注(MCAO/R)動(dòng)物模型檢測(cè)結(jié)果也發(fā)現(xiàn)circRNA存在不同程度的改變。腦缺血90 min再灌注6、12、24 h的缺血半影區(qū)有283個(gè)circRNA至少在一個(gè)再灌注時(shí)間點(diǎn)發(fā)生2倍以上的改變,其中16 個(gè)circRNA在所有時(shí)間點(diǎn)都發(fā)生改變〔16〕。急性IS患者血樣檢測(cè)中同樣發(fā)現(xiàn)了circRNA的異常表達(dá)。Dong 等〔20〕發(fā)現(xiàn),患者外周血中有521個(gè)circRNA 發(fā)生差異性改變,異常表達(dá)的circRNA主要富集MAPK、炎癥、免疫等信號(hào)通路。Zuo等〔22〕對(duì)急性IS患者靜脈血進(jìn)行基因芯片檢測(cè),發(fā)現(xiàn)circFUNDC1,circPDS5B及circCDC14A表達(dá)顯著上調(diào),其表達(dá)水平與腦梗死體積正相關(guān)。研究還發(fā)現(xiàn),3種circRNA在預(yù)后好及差的患者中變化趨勢(shì)相反,于是推測(cè)他們可作為急性IS診斷及預(yù)后的生物標(biāo)志物。隨著測(cè)序技術(shù)的發(fā)展,越來(lái)越多的circRNA被發(fā)現(xiàn)在IS的異常表達(dá),然而,目前對(duì)測(cè)序結(jié)果的分析仍存在弊端,這主要由于樣本來(lái)源、測(cè)序方式、測(cè)序時(shí)間點(diǎn)及測(cè)序平臺(tái)不同,致使獲得的circRNA表達(dá)譜及可能參與的信號(hào)通路復(fù)雜、多樣,無(wú)統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)。如果完善數(shù)據(jù)庫(kù)后能將細(xì)胞、動(dòng)物以及患者血樣的檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行有效的結(jié)合,有望篩選出更多有價(jià)值的IS診斷標(biāo)志物及功能靶標(biāo)。

表1 circRNA在IS中異常表達(dá)

3 circRNA通過(guò)ceRNA機(jī)制調(diào)控IS損傷

3.1ceRNA調(diào)控機(jī)制 ceRNA機(jī)制是在各種RNA之間相互作用的一種全新的基因表達(dá)調(diào)控模式,主要指某些ncRNA,如長(zhǎng)鏈非編碼 RNA(lncRNA)、假基因和circRNA,可作為 miRNA的海綿通過(guò)與miRNA 反應(yīng)元件(MREs)競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合,最終影響 miRNA的靶基因mRNA的表達(dá)及功能。以往研究揭示circRNA作為ceRNA可通過(guò)調(diào)控細(xì)胞增殖〔23,24〕、炎癥〔25〕、凋亡〔26,27〕、自噬〔28〕、血管新生〔29〕等病理生理進(jìn)程參與多種疾病的發(fā)生發(fā)展。IS病理機(jī)制復(fù)雜,目前研究顯示,circRNA 作為ceRNA可通過(guò)影響神經(jīng)元凋亡、自噬、氧化應(yīng)激、炎癥及其他多種途徑參與急性IS病理生理進(jìn)程。

3.2circRNA調(diào)控IS細(xì)胞凋亡 細(xì)胞凋亡是細(xì)胞程序性死亡的一種方式,是腦卒中后的主要病理現(xiàn)象。研究表明腦缺血損傷后數(shù)小時(shí)或腦缺血再灌注后,缺血半影區(qū)主要以凋亡為主。抑制細(xì)胞凋亡對(duì)IS患者的預(yù)后有較大幫助,被認(rèn)為是IS防治的最為重要的途徑。研究〔30～38〕顯示,大量的circRNA可通過(guò)ceRNA 機(jī)制促進(jìn)或抑制IS引起的細(xì)胞凋亡過(guò)程,見(jiàn)表2。

表2 circRNA作為ceRNA調(diào)控細(xì)胞凋亡

Chen等〔30〕發(fā)現(xiàn),在IS體內(nèi)、外損傷模型中circUCK2表達(dá)顯著降低,過(guò)表達(dá)circUCK2可抑制miR-125b-5p活性,促進(jìn)生長(zhǎng)分化因子(GDF)11表達(dá),從而激活下游轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(TGF)-β/Smad3信號(hào)通路減少細(xì)胞損傷,提高細(xì)胞存活率,抑制細(xì)胞凋亡。最新研究發(fā)現(xiàn)〔33〕,circTLK1在小鼠MCAO/R損傷模型及OGD/R 處理的N2a細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)。敲除circTLK1顯著減少梗死體積,改善神經(jīng)功能。機(jī)制研究發(fā)現(xiàn),敲低circTLK1 通過(guò) miR-26a-5p/PTEN軸減輕OGD/R誘導(dǎo)的 N2a 細(xì)胞的凋亡,減輕神經(jīng)元損傷。Xu等〔34〕在人腦BMECs缺氧處理后還發(fā)現(xiàn),circPHC3高表達(dá),敲低circPHC3抑制 OGD誘導(dǎo)的 BMECs細(xì)胞凋亡。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn),circPHC3吸附miR-455-5p激活腫瘤壞死因子受體作用因子(TRAF)3,促進(jìn)細(xì)胞死亡和凋亡。Dai等〔35〕也發(fā)現(xiàn)circHECTD1及TRAF3在OGD處理的HT22細(xì)胞及MCAO 小鼠中,表達(dá)上調(diào),miR-133b表達(dá)下調(diào)。敲除circHECTD1可緩解OGD引起的HT22細(xì)胞死亡,改善MCAO小鼠腦梗死體積及神經(jīng)元凋亡。下調(diào)circHECTD1可通過(guò)靶向miR-133b抑制TRAF3的表達(dá),降低caspase-3和NF-κB活化,從而影響神經(jīng)元凋亡。綜上,circPHC3和circHECTD1盡管靶向不同的miRNA,但均可通過(guò)調(diào)節(jié)TRAF3的表達(dá)來(lái)影響細(xì)胞凋亡。可見(jiàn),在ceRNA調(diào)控模式下不同circRNA還可通過(guò)吸附不同miRNA靶向調(diào)控同一或不同的mRNA在IS引起的細(xì)胞凋亡中發(fā)揮生物功能。

3.3circRNA調(diào)節(jié)IS細(xì)胞自噬 自噬是細(xì)胞組分的正常降解過(guò)程,是細(xì)胞中高度保守的分解代謝途徑,在維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定中發(fā)揮重要作用〔39〕。研究發(fā)現(xiàn),適度自噬可抵抗IS造成的缺血缺氧環(huán)境,維持存活狀態(tài),但是過(guò)度自噬可導(dǎo)致細(xì)胞死亡〔40〕。隨著對(duì)IS circRNA研究的深入,越來(lái)越多的研究發(fā)現(xiàn),circRNA作為ceRNA 參與了IS細(xì)胞自噬的調(diào)節(jié)。

Han等〔41〕發(fā)現(xiàn),在IS小鼠模型和患者血漿中circHECTD1表達(dá)均顯著增加。敲低circHECTD1可顯著減少腦梗死面積,減輕神經(jīng)元損傷,抑制星形膠質(zhì)細(xì)胞的活化。機(jī)制研究發(fā)現(xiàn),circHECTD1可作為miR-142海綿,抑制TCDD誘導(dǎo)多聚ADP核糖聚合酶(TIPARP) 的表達(dá),促進(jìn)自噬。Zhou等〔42〕研究發(fā)現(xiàn),circ-0025984 和TET1蛋白在IS星形膠質(zhì)細(xì)胞中表達(dá)顯著降低,miR-143-3p表達(dá)增加。抑制miR-143-3p 或過(guò)表達(dá)circ-0025984顯著降低星形膠質(zhì)細(xì)胞凋亡和自噬,減輕腦損傷和神經(jīng)元丟失。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn),這種神經(jīng)保護(hù)作用主要與定位于細(xì)胞質(zhì)中的circ-0025984充當(dāng)miR-143-3p的海綿,靶向上調(diào)TET1表達(dá)有關(guān)。上調(diào)的TET1轉(zhuǎn)位入核后,與ORP150啟動(dòng)子結(jié)合,將5-甲基胞嘧啶(5mC)轉(zhuǎn)化為5-羥甲基胞嘧啶(5hmC),導(dǎo)致DNA去甲基化,引起ORP150表達(dá)增加,進(jìn)而增加LC3-Ⅱ表達(dá),激活自噬。Xu 等〔43〕發(fā)現(xiàn),在小鼠MCAO/R模型中circAkap7表達(dá)下調(diào),當(dāng)外源性給與脂肪來(lái)源間充質(zhì)干細(xì)胞修飾的circAkap7外泌體(exo-circAkap7)可減輕腦損傷。研究發(fā)現(xiàn)exo-circAkap7可作為ceRNA海綿吸附miR-155-5p,促進(jìn)ATG12介導(dǎo)的自噬,抑制 NRF2 介導(dǎo)的氧化應(yīng)激,減輕神經(jīng)細(xì)胞損傷。這表明circAkap7至少可部分通過(guò)促進(jìn)自噬發(fā)揮保護(hù)作用。與此研究相似,星形膠質(zhì)細(xì)胞外泌體來(lái)源的circSHOC2,可吸附 miR-7670-3p,調(diào)節(jié)沉默信息調(diào)節(jié)因子(SIRT)1的表達(dá),通過(guò)調(diào)節(jié)自噬,改善神經(jīng)元損傷〔44〕。

3.4circRNA調(diào)節(jié)細(xì)胞器膜穩(wěn)態(tài) 細(xì)胞質(zhì)膜(PM)與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(ER)之間的動(dòng)態(tài)平衡,對(duì)維持細(xì)胞的正常功能至關(guān)重要。PM/ER之間的非囊泡脂質(zhì)轉(zhuǎn)移被認(rèn)為在膜穩(wěn)態(tài)維持中起主要作用〔45〕。 Shang等〔46〕發(fā)現(xiàn),IS會(huì)打破PM和ER之間的脂質(zhì)穩(wěn)態(tài),引起PM和ER之間的磷脂酰肌醇(PIs)和磷脂酰絲氨酸(PS)分布異常。其中ORP5 參與了PIs〔PI(4)P,PI(4,5)P2,PI(3,4,5)P3〕及PS在PM及ER的重新分配過(guò)程。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)circRNA 0001449作為ceRNA通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合miR-124-3p及 miR-32-5p,靶向調(diào)控氧固醇結(jié)合蛋白l5(Osbpl5)mRNA 的翻譯過(guò)程,促使ORP5 蛋白表達(dá)增加。上調(diào)的ORP5促進(jìn)PI(4)P或PI(4,5)P2從PM到ER的轉(zhuǎn)運(yùn),從而消除了PM中PI(3,4,5)P3來(lái)源,進(jìn)而減少PI(3,4,5)P3募集和AKT激活,最終加速細(xì)胞的損傷。因此認(rèn)為 circRNA 0001449作為ceRNA 在IS PM及EM膜穩(wěn)態(tài)的調(diào)節(jié)中起重要作用。

3.5circRNA多靶點(diǎn)、多通路調(diào)節(jié)血腦屏障(BBB)、炎癥、氧化應(yīng)激等 circRNA作為ceRNA在IS發(fā)生發(fā)展中的作用并非單一的,越來(lái)越多的研究顯示,它可通過(guò)調(diào)節(jié)血腦屏障、炎癥、氧化應(yīng)激、增殖分化等多通路、多靶點(diǎn)的發(fā)揮調(diào)節(jié)功能。

BBB是神經(jīng)血管單元的重要組成部分,它控制血液和大腦之間各種生物物質(zhì)的交換。 在急性IS時(shí)BBB完整性被破壞,滲透性增高,血液成分滲入大腦,引起血管源性腦水腫、顱內(nèi)壓增高等一系列病理反應(yīng),損害正常的神經(jīng)元。IS時(shí),內(nèi)皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化導(dǎo)致BBB破壞,Bai等〔47〕發(fā)現(xiàn),在急性IS患者和小鼠IS模型中,circDLGAP4表達(dá)下調(diào),上調(diào)circDLGAP4可顯著抑制緊密連接蛋白和間充質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物表達(dá),進(jìn)而抑制內(nèi)皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化。機(jī)制研究發(fā)現(xiàn),circDLGAP4可作為內(nèi)源性 miR-143 海綿,靶向抑制E6-APC末端結(jié)構(gòu)域E3泛素蛋白連接酶(HECTD)1功能,通過(guò)調(diào)節(jié)BBB完整性相關(guān)的內(nèi)皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化發(fā)揮保護(hù)作用。與此研究相似,Qiu 等〔48〕在OGD處理的HCN2細(xì)胞中也發(fā)現(xiàn)circDLGAP4表達(dá)下調(diào)。過(guò)表達(dá)circDLGAP4 可充當(dāng)miR-503-3p 的海綿,促進(jìn)神經(jīng)生長(zhǎng)調(diào)節(jié)因子(NEGR)1 mRNA及蛋白表達(dá),增加細(xì)胞存活率,抑制細(xì)胞死亡和炎癥反應(yīng),發(fā)揮保護(hù)作用?？梢?jiàn)circRNA的作用可以是多靶點(diǎn)的,即同一circRNA可吸附不同miRNA發(fā)揮不同的生物功能。見(jiàn)表3。

表3 通過(guò)多通路、多靶點(diǎn)參與調(diào)控的circRNA

另外,Ren等〔49〕研究表明,circ-Memo1、SOS1在IS患者外周血及缺氧/復(fù)氧處理的人腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞(HBMEC)中表達(dá)上調(diào),miR-17-5p表達(dá)下調(diào)。沉默circ-Memo1可通過(guò)調(diào)節(jié)miR-17-5p/SOS1軸促進(jìn)了細(xì)胞活力,抑制了ERK/NF-κB信號(hào)通路的激活,減少了氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng),并抑制了細(xì)胞凋亡,減輕缺氧/復(fù)氧引起的HBMEC細(xì)胞損傷。Yang等〔50〕研究發(fā)現(xiàn),在OGD誘導(dǎo)的HBMEC細(xì)胞中,過(guò)表達(dá)circPHKA2可通過(guò)miR-574-5p/超氧化物歧化酶(SOD)2軸,促進(jìn)增殖、遷移、血管新生,抑制凋亡、氧化應(yīng)激、ER應(yīng)激等減輕OGD誘導(dǎo)的HBMEC損傷,發(fā)揮保護(hù)作用。因此,circRNA發(fā)揮作用的途徑還可以是多通路的,即同一circRNA可通過(guò)調(diào)節(jié)增殖、氧化應(yīng)激、炎癥等多個(gè)通路發(fā)揮生物功能。綜上,circRNA作為ceRNA通過(guò)多靶點(diǎn)、多通路在IS的病理進(jìn)程中發(fā)揮著十分重要的作用,這為其治療指明了新的研究方向。

TLR4:Toll樣受體4

4 展 望

大量的研究發(fā)現(xiàn),circRNA不再是轉(zhuǎn)錄副產(chǎn)物,它可作為IS診斷標(biāo)志物和分子靶點(diǎn)在疾病的發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后發(fā)揮重要的生物功能。circRNA的ceRNA機(jī)制在IS的作用不是孤立的,它可以通過(guò)多靶點(diǎn)、多通路、多機(jī)制參與疾病發(fā)生發(fā)展的病理進(jìn)程,從而為IS的診斷、治療及藥物研發(fā)提供重要理論依據(jù)。目前IS circRNA還有大量的circRNA有待發(fā)現(xiàn),更多重要的機(jī)制有待進(jìn)一步挖掘。