王瑋 楊淑媚 羅丹 李啟祥 尹合坤

(江門市中心醫(yī)院消化內(nèi)科,廣東 江門 529030)

潰瘍性結(jié)腸炎(UC)是一種復(fù)雜的慢性、免疫介導(dǎo)的炎癥性腸病〔1〕。雖然目前針對UC的治療在臨床上具有一定療效,但長期藥物治療(如5-氨基水楊酸、激素等)會引起明顯的副作用〔2〕。木犀草素(Lut)可在金銀花、野菊花等多種植物中提取。Lut作為一種抗氧化劑和抗炎劑,可用于多種疾病治療〔3〕。研究發(fā)現(xiàn),Lut可通過調(diào)控細(xì)胞凋亡和自噬改善小鼠實驗性結(jié)腸炎〔4〕。據(jù)報道,蛋白酪氨酸激酶(JAK)2/信號轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子(STAT)3是機體重要的經(jīng)典炎癥通路,可通過調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞極化來抑制機體炎癥反應(yīng)〔5〕。推測Lut可能通過JAK2/STAT3信號通路調(diào)控巨噬細(xì)胞極化從而減輕UC損傷。葡聚糖硫酸鈉(DSS)誘導(dǎo)的UC模型已被廣泛使用〔6〕。本研究構(gòu)建DSS誘導(dǎo)的UC小鼠模型,探討Lut減輕小鼠UC損傷的作用及其機制。

1 材料和方法

1.1動物和試劑、儀器 80只8～10周齡、體質(zhì)量21～25 g的SPF級雄性健康C57BL/6小鼠〔SCXK(京)2019-0009〕由北京維通利華公司提供。在(20～25)℃、40%～60%的相對濕度下飼養(yǎng),自由進(jìn)食、飲水。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)。Lut(491-70-3,純度HPLC≥98%)、蘇木素(H104306)、伊紅染色液(E292725)購自上海Aladdin;DSS(42867-25G)購自美國Sigma;小鼠白細(xì)胞介素(IL)-6(PI326)、IL-1β(PI301)、IL-10(PI522)及腫瘤壞死因子(TNF)-α(PT512)酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)試劑盒購自上海BEYONTIME;抗體:磷酸化(p)-JAK2(ab32101,130 kD)、p-STAT3(ab267373,88 kD)、B細(xì)胞淋巴瘤(Bcl)-2相關(guān)X蛋白(Bax,ab32503,21 kD)、胱天蛋白酶(Caspase)-3(ab32351,32 kD)、Bcl-2(ab32124,26 kD)、誘導(dǎo)型一氧化氮合成酶(iNOS,ab178945,131 kD)、精氨酸酶(Arg)-1(ab233548,35 kD)及β-Actin(ab8226,42 kD);TUNEL細(xì)胞凋亡原位檢測試劑盒(SNM535-DUH)購自北京百奧萊博;JAK2抑制劑AG490(SIH-428-25MG-E)購自加拿大StressMarq。實驗中所有涉及的引物均由上海生工合成。RM2125RTS石蠟切片、DMILLED熒光顯微鏡購自德國Leica;CFX 384多通道熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)儀、Universal Hood Ⅱ凝膠成像系統(tǒng)購自美國Bio-Rad。

1.2小鼠UC模型構(gòu)建及分組 將80只小鼠分為4組(根據(jù)體質(zhì)量微調(diào),盡量使各組體質(zhì)量均衡),每組20只,分別為Control組、DSS組、DSS+Lut組及DSS+AG490組。小鼠馴化3 d后開始處理,除Control組外,其余各組連續(xù)7 d給予溶于飲用水3% DSS誘導(dǎo)UC模型〔4〕。DSS+Lut組和DSS+AG490組小鼠經(jīng)口灌胃給予Lut(50 mg/kg)〔6〕和AG490(10 mg/kg)〔5〕,連續(xù)7 d,1次/d,Control組和DSS組給予等量生理鹽水。于第8天頸椎脫臼處死小鼠,取結(jié)腸測量長度,再進(jìn)行后續(xù)分析。每天對各組小鼠進(jìn)行稱重〔體質(zhì)量下降率(%)=(原體質(zhì)量-下降后的體質(zhì)量)/原體質(zhì)量×100%〕,采用疾病活動指數(shù)評價各組小鼠病情〔7〕。

1.3組織學(xué)分析 結(jié)腸組織用4%多聚甲醛固定進(jìn)行石蠟包埋和連續(xù)切片(3.5 μm)。用蘇木素和伊紅染色,并使用Image-Pro Plus5.0系統(tǒng)獲得圖像。測量隱窩深度,對組織的結(jié)腸損傷進(jìn)行評分〔8〕。評分范圍為0～4分,無上皮損傷和炎癥浸潤0分;杯狀細(xì)胞輕度減少和炎癥浸潤到隱窩1分;杯狀細(xì)胞相對廣泛減少和黏膜肌層炎癥浸潤2分;廣泛杯狀細(xì)胞減少,隱窩輕度減少,黏膜肌層廣泛炎癥浸潤3分;隱窩廣泛減少,黏膜下層炎癥浸潤4分。

1.4實時熒光定量(qRT)-PCR檢測巨噬細(xì)胞標(biāo)志物iNOS、Arg-1的表達(dá)水平 加入Trizol試劑提取各組結(jié)腸組織總RNA并制備cDNA,經(jīng)qRT-PCR儀檢測iNOS、Arg-1 mRNA相對表達(dá)量引物序列(5′-3′)為:iNOS上游GGCAGCCTGTGAGACCTTTG,下游GCATTGGAAGTGAAGCGTTTC;Arg-1上游GGGAA-GACAGCAGAGGAGGT,下游TAGTCAGTCCCTGGC-TTATGG;GAPDH上游CCGCATCTTCTTGTGCAGT,下游GGCAACAATCTCCACTTTGC。

1.5ELISA檢測炎癥因子水平 采用ELISA測定結(jié)腸組織中促炎因子(IL-6、IL-1β和TNF-α)和抗炎因子(IL-10)水平,按照試劑盒說明書操作。

1.6Western印跡檢測JAK2/STAT3通路及凋亡相關(guān)蛋白表達(dá) RIPA法提取結(jié)腸組織總蛋白,12%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離蛋白并轉(zhuǎn)至聚偏氟乙烯(PVDF)膜上,使用5%脫脂牛奶封閉2 h后添加一抗:iNOS、Arg-1、p-JAK2、p-STAT3、Bax、Caspase-3、Bcl-2及β-Actin,4 ℃隔夜孵育,隔天使用磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗后,添加辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔二抗孵育2 h,PBS沖洗后添加電化學(xué)發(fā)光(ECL)顯色液顯影,拍照。使用Quantity One軟件分析灰度值。目的蛋白相對表達(dá)=目的蛋白條帶灰度值/β-Actin條帶灰度值。

1.7TUNEL法測定細(xì)胞凋亡 結(jié)腸組織用4%甲醛室溫固定,洗滌、脫水、石蠟包埋,切成4 μm切片。按照TUNEL細(xì)胞凋亡原位檢測試劑盒的說明書進(jìn)行。染色后呈棕色細(xì)胞核的細(xì)胞為TUNEL陽性細(xì)胞(即凋亡細(xì)胞),在熒光顯微鏡下對凋亡細(xì)胞進(jìn)行統(tǒng)計。

1.8統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS25.0軟件進(jìn)行單因素方差分析、獨立t檢驗。

2 結(jié) 果

2.1Lut對DSS誘導(dǎo)UC損傷的影響 如表1、表2所示,與Control組相比,在飲用DSS第3天后小鼠體質(zhì)量下降率逐漸明顯升高(P<0.05),DSS組結(jié)腸組織長度顯著縮短,疾病活動指數(shù)及隱窩深度均顯著增加(P<0.05)。與DSS組相比,DSS+Lut組和DSS+AG490組體質(zhì)量下降率顯著降低,結(jié)腸組織長度顯著加長,疾病活動指數(shù)及隱窩深度均顯著降低(P<0.05)。

表1 各組體質(zhì)量下降率

表2 各組結(jié)腸損傷指標(biāo)

2.2Lut對DSS誘導(dǎo)的小鼠結(jié)腸組織病理學(xué)的影響 如圖1所示,Control組結(jié)腸黏膜上皮細(xì)胞排列整齊,結(jié)構(gòu)完整;腸壁黏膜和隱窩結(jié)構(gòu)完好,杯狀細(xì)胞齊整;無中粒細(xì)胞浸潤,無炎癥表現(xiàn)。DSS組結(jié)腸黏膜上皮細(xì)胞排列紊亂;隱窩膿腫形成,杯狀細(xì)胞耗竭;中性粒細(xì)胞浸潤,有炎癥體現(xiàn);DSS+Lut組和DSS+AG490組結(jié)腸黏膜上皮細(xì)胞損傷得到一定的恢復(fù);隱窩結(jié)構(gòu)幾乎復(fù)原,杯狀細(xì)胞增多,結(jié)構(gòu)恢復(fù);中性粒細(xì)胞浸潤降低,炎癥得到有效改善。與Control組〔(0.35±0.03)分〕相比,DSS組具有更高的病理學(xué)評分〔(7.65±1.15)分;t=29.719,P<0.05〕;與DSS組相比,DSS+Lut組和DSS+AG490組病理學(xué)評分〔(3.96±0.84)、(3.71±0.62)分〕明顯降低(t=15.022、16.040,均P<0.05)。

圖1 各組結(jié)腸組織病理學(xué)(蘇木素-伊紅染色,×200)

2.3Lut對DSS誘導(dǎo)的結(jié)腸組織中巨噬細(xì)胞極化的影響 如圖2、表3所示,與Control組相比,DSS組結(jié)腸組織中iNOS、Arg-1 mRNA和蛋白表達(dá)水平均顯著增加(P<0.05);與DSS組相比,DSS+Lut組和DSS+AG490組結(jié)腸組織中iNOS mRNA和蛋白表達(dá)水平明顯下降,Arg-1 mRNA和蛋白表達(dá)水平明顯上調(diào)(P<0.05)。

圖2 各組結(jié)腸組織中iNOS、Arg、Bax、Caspase-3、Bcl-2、p-JAK2、p-STAT3蛋白表達(dá)

2.4Lut對DSS誘導(dǎo)的結(jié)腸組織中炎癥反應(yīng)的影響 如表3所示,與Control組相比,DSS組結(jié)腸組織中IL-6、IL-1β和TNF-α水平顯著增高,IL-10水平顯著降低(P<0.05)。與DSS組相比,DSS+Lut組和DSS+AG490組結(jié)腸組織中IL-6、IL-1β和TNF-α水平明顯降低,IL-10水平明顯增高(P<0.05)。

表3 各組結(jié)腸組織中iNOS、Arg-1 mRNA和蛋白表達(dá)及IL-6、IL-1β、TNF-α、IL-10水平比較

2.5Lut對DSS誘導(dǎo)的結(jié)腸組織細(xì)胞凋亡的影響 如圖2、表4、圖3所示,與Control組相比,DSS組結(jié)腸組織中細(xì)胞凋亡率顯著增加,Bax與Caspase-3蛋白表達(dá)均顯著增高,Bcl-2蛋白表達(dá)顯著降低(P<0.05);與DSS組相比,DSS+Lut組和DSS+AG490組結(jié)腸組織中細(xì)胞凋亡率顯著減少,Bax與Caspase-3蛋白表達(dá)均顯著降低,Bcl-2蛋白表達(dá)顯著增高(P<0.05)。

表4 各組結(jié)腸組織中凋亡細(xì)胞與Bax、Caspase-3、Bcl-2、p-JAK2、p-STAT3蛋白表達(dá)比較

圖3 各組細(xì)胞凋亡(TUNEL染色,×200)

2.6Lut對DSS誘導(dǎo)的結(jié)腸組織中JAK2/STAT3通路的影響 如圖2、表4所示,與Control組相比,DSS組結(jié)腸組織中p-JAK2和p-STAT3蛋白表達(dá)顯著增高(P<0.05)。與DSS組相比,DSS+Lut組和DSS+AG490組結(jié)腸組織中p-JAK2和p-STAT3蛋白表達(dá)顯著降低(P<0.05)。

3 討 論

UC是由結(jié)直腸黏膜免疫系統(tǒng)功能障礙引起的慢性非特異性炎癥,其發(fā)病率呈上升趨勢〔1〕。DSS是一種水溶性硫酸化多糖,可破壞腸黏膜屏障的完整性,誘導(dǎo)UC,主要特征為結(jié)直腸潰瘍、炎癥細(xì)胞浸潤及隱窩膿腫,是動物模型中誘發(fā)UC的理想選擇〔4〕。本研究首次在小鼠模型上證明Lut可以減輕DSS誘導(dǎo)的小鼠UC損傷。Lut是一種多酚類黃銅化合物,可抑制腫瘤細(xì)胞的發(fā)生發(fā)展,還在一定程度上減輕器官性炎癥損傷〔3,4〕。然而,缺乏Lut在UC中的研究。本研究提示,Lut可以減輕DSS誘導(dǎo)的小鼠的UC損傷。大量炎癥因子釋放是UC進(jìn)一步加重的重要原因〔9〕。本研究結(jié)果表明,DSS可促進(jìn)小鼠UC的炎癥反應(yīng),Lut可以減輕DSS誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)。研究表明,IL-6、IL-1β和TNF-α都是促炎因子,其表達(dá)上調(diào)表明機體炎癥反應(yīng)加重〔10〕。IL-10是一種抗炎因子,其表達(dá)下調(diào)表明機體炎癥不能被抑制〔11〕。

研究表明,大量炎癥介質(zhì)刺激巨噬細(xì)胞極化為M1型巨噬細(xì)胞,是炎癥反應(yīng)進(jìn)展的原因之一〔12〕。在機體免疫過程中,巨噬細(xì)胞被激活成M1和M2兩種不同的極化表型〔13〕。其中M1型巨噬細(xì)胞主要分泌TNF-α、IL-1β及IL-6等炎癥因子,具有促進(jìn)炎癥反應(yīng)的作用;M2型巨噬細(xì)胞主要分泌IL-10等抗炎因子,抵抗機體炎癥反應(yīng)〔14〕。研究顯示,iNOS是M1型巨噬細(xì)胞極化標(biāo)志物,Arg-1是M2型巨噬細(xì)胞極化標(biāo)志物,其表達(dá)水平增高表明巨噬細(xì)胞出現(xiàn)M1、M2型極化〔15〕。本研究表明,DSS可刺激機體產(chǎn)生炎癥反應(yīng),促進(jìn)巨噬細(xì)胞M1、M2型極化;Lut通過抑制DSS誘導(dǎo)UC中M1巨噬細(xì)胞的極化,促進(jìn)M2巨噬細(xì)胞的極化傾向,這與炎癥因子表達(dá)改變的結(jié)果一致。

據(jù)報道,腸上皮細(xì)胞凋亡是導(dǎo)致腸黏膜屏障損傷和UC的重要病理特征〔16〕。正常情況下,Bcl-2和Bax處于相對穩(wěn)定的狀態(tài)并相互調(diào)節(jié),意味著一旦這種穩(wěn)定狀態(tài)被打破,可能會誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。Caspase-3被稱為死亡蛋白酶,不僅是哺乳動物的關(guān)鍵蛋白酶,還是多種凋亡途徑的關(guān)鍵下游效應(yīng)物〔17〕。另外,已有研究顯示,在UC動物模型中Bax和Caspase-3等凋亡相關(guān)蛋白顯著增高,Bcl-2表達(dá)顯著降低〔18〕。因此,改善細(xì)胞凋亡對UC治療至關(guān)重要。本研究結(jié)果與前人研究結(jié)果一致〔18〕,提示Lut還可以抑制UC小鼠腸上皮細(xì)胞的凋亡。

本研究結(jié)果提示,Lut可以抑制UC小鼠中JAK2和STAT3的活化,Lut對小鼠UC損傷的保護(hù)作用可能是通過抑制JAK2/STAT3信號通路的激活來實現(xiàn)的。本研究發(fā)現(xiàn),Lut可能通過抑制JAK2/STAT3信號通路的激活調(diào)控巨噬細(xì)胞極化,從而減輕DSS誘導(dǎo)的潰瘍性結(jié)腸炎損傷,因此它可能作為未來潛在的治療潰瘍性結(jié)腸炎藥物。然而,本研究還存在一些局限性,首先,并未設(shè)計單獨Lut組去探究Lut是否對健康小鼠存在影響;其次,由于實驗開始之初并未找到合適的JAK2激動劑,故并未設(shè)計JAK2激動劑是否可以逆轉(zhuǎn)來Lut對UC小鼠的保護(hù)作用。后續(xù)將針對以上不足重點探究,以完善Lut在UC中的保護(hù)機制。