李豐玲 劉云霞 劉秀 劉瑜

(濰坊醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院 1神經(jīng)內(nèi)一科,山東 濰坊 261031;2浮煙山綜合內(nèi)科;3濱州醫(yī)學(xué)院煙臺附屬醫(yī)院心血管內(nèi)科;4濰坊醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院全科醫(yī)學(xué)科)

動脈粥樣硬化(AS)是引起心腦血管疾病發(fā)生及死亡的重要原因〔1〕。炎癥是AS血管內(nèi)皮損傷發(fā)生發(fā)展及惡化的重要推動因素,也是刺激巨噬細(xì)胞活化產(chǎn)生炎癥應(yīng)答、形成泡沫細(xì)胞,導(dǎo)致血管內(nèi)皮脂質(zhì)沉積及斑塊形成的關(guān)鍵因素,并認(rèn)為抑制炎癥信號的生成、傳導(dǎo)及擴(kuò)大,是延緩AS發(fā)生及惡化的關(guān)鍵機制〔2〕。

Toll樣受體(TLR)4可與動脈損傷過程中的內(nèi)源性配體相結(jié)合,誘導(dǎo)核因子(NF)-κB入核活化,介導(dǎo)炎癥信號產(chǎn)生及擴(kuò)大,并調(diào)控巨噬細(xì)胞極化參與AS血管內(nèi)皮脂質(zhì)沉積及炎癥應(yīng)答〔3〕。特異性敲低TLR4及其下游炎癥因子表達(dá),可發(fā)揮抗AS血管內(nèi)皮脂質(zhì)沉積及炎癥損傷作用〔4〕,預(yù)示干預(yù)TLR4/NF-κB信號活化,可能是治療AS的關(guān)鍵策略。但靶向抑制TLR4/NF-κB信號活化的基因調(diào)控機制,還不甚明確。

微小RNA(miRNA)可與蛋白質(zhì)編碼基因(mRNA)的3′非翻譯區(qū)(UTR)相互結(jié)合來調(diào)控蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)錄及表達(dá),并參與AS等炎性疾病的發(fā)生發(fā)展〔5〕。已有報道發(fā)現(xiàn),miRNA中的miR-93在AS患者血清中呈異常低表達(dá),并推測miR-93缺失可能是引起AS患者血管白細(xì)胞聚集和脂肪物質(zhì)沉積的關(guān)鍵因素〔6〕。但miR-93參與AS血管內(nèi)皮脂質(zhì)沉積及炎癥損傷的分子調(diào)控機制卻并不清楚。另外,也有研究發(fā)現(xiàn),miR-93與TLR4之間存在靶向調(diào)控關(guān)系,miR-93的高表達(dá)可靶向抑制TLR4表達(dá),發(fā)揮抗骨關(guān)節(jié)炎炎癥反應(yīng)〔7〕,預(yù)示外源性干預(yù)miR-93表達(dá),很可能通過抑制TLR4/NF-κB信號活化,而達(dá)到抗AS血管內(nèi)皮脂質(zhì)沉積及炎癥損傷目的。本研究建立大鼠AS模型,探討miR-93靶向TLR4/NF-κB信號通路對AS大鼠血管內(nèi)皮炎癥反應(yīng)的影響。

1 材料及方法

1.1材料 取健康清潔級SD大鼠90只,雌雄各半,體質(zhì)量180～220 g,鼠齡7～8周齡,購自肇慶市瑞思元生物科技有限公司,生產(chǎn)許可證號:SCXK(粵)2020-0053。本研究經(jīng)醫(yī)院動物倫理委員會批準(zhǔn)同意,批號為IACUC-01(2020103029)。維生素D3(貨號:YT2462,北京伊塔生物科技有限公司);miR-93模擬物(miR-93 agomir)及其陰性對照agomir-NC均由百奧邁科生物技術(shù)有限公司合成;TLR4激活劑RS09(貨號:HY-P1431,美國MCE公司);三酰甘油(TG)、總膽固醇(TC)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)、低密度膽固醇脂蛋白(LDL-C)、白細(xì)胞介素(IL)-6、C反應(yīng)蛋白(CRP)等酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)試劑盒均購自南京森貝伽生物科技有限公司;Movat染色液及油紅O染色液購自上海一研生物科技有限公司;M1型巨噬細(xì)胞標(biāo)記抗體(CD11)、TLR4、NF-κB、磷酸化NF(p-NF)-κB、三磷酸腺苷(ATP)結(jié)合盒轉(zhuǎn)運體(ABC)A1、載脂蛋白(Apo)A1、巨噬細(xì)胞清道夫受體(ScR)-A、凝集素型氧化低密度脂蛋白受體(Lox)-1、IL-1β、誘導(dǎo)型一氧化氮(iNOS)、IL-10、幾丁質(zhì)酶-3樣蛋白3(YM1)等抗體均購自美國Abcam公司。

1.2AS模型建立及分組 取SD大鼠75只,經(jīng)腹腔注射維生素D3(60×104IU/kg)1次后,給予高脂飼料喂養(yǎng)8 w建立AS模型〔8〕,并按隨機數(shù)字表法分為模型組、miR-93模擬物(miR-93 agomir)組、agomir-NC組、RS09(TLR4激活劑)組、miR-93 agomir+RS09組,每組15只。另取15只大鼠,正常飼料喂養(yǎng)+腹腔注射生理鹽水(共1次),8 w后,作為正常對照組。miR-93 agomir組及其陰性對照agomiR-NC組,參照文獻(xiàn)〔7〕經(jīng)尾靜脈注射5 nmol的miR-93 agomir及agomiR-NC試劑,每兩日1次;RS09組參照文獻(xiàn)〔9〕經(jīng)尾靜脈注射25 μg/只的RS09,每兩日1次;模型組及正常對照組經(jīng)尾靜脈注射10 ml/kg的生理鹽水;各組連續(xù)給藥6 w后結(jié)束給藥,進(jìn)行后續(xù)試驗。

1.3血脂、炎性因子、循環(huán)血管內(nèi)皮細(xì)胞比例檢測 末次給藥結(jié)束后,麻醉,取腹主動脈血3 ml,按ELISA方法測血脂(TG、TC、HDL-C、LDL-C)和炎癥因子(IL-6、CRP)水平;參照文獻(xiàn)〔10〕中方法,分離外周單核細(xì)胞,加入CD31抗體孵育30 min后,進(jìn)行流式上機檢測并計算CD31陽性細(xì)胞比例,以CD31陽性細(xì)胞比例大小評價內(nèi)皮細(xì)胞損傷變化。

1.4Movat及油紅O染色觀察胸主動脈血管內(nèi)皮組織病理變化及斑塊面積 各組大鼠隨機取6只,麻醉后處死,取胸主動脈血管2.5 cm,于4%多聚甲醛中固定24 h后制成厚為5 μm的連續(xù)石蠟切片,每隔50 μm選1張切片(共5個切片),按Movat及油紅O染色液說明書方法染色后,于光鏡下觀察拍照,油紅O染色切片,使用Photoshop軟件計算5個切片中斑塊總面積百分比。

1.5免疫組化檢測CD11陽性表達(dá)水平 取上述連續(xù)石蠟切片,脫蠟及破膜透化處理后,滴加1∶200的CD11兔抗大鼠一抗抗體4 ℃避光孵育24 h,滴加生物素IgG二抗,室溫孵育2 h,二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色處理后,光鏡下拍照,Image-Pro Plus6.0軟件分析單位面積內(nèi)CD11陽性染色(棕黃色)區(qū)域的積分光密度值。

1.6實時熒光定量-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-qPCR)檢測miR-93表達(dá) 剩余大鼠斷頭處死,取胸主動脈組織2 cm,剪取1 cm血管組織粉碎勻漿后,提取總RNA,反轉(zhuǎn)錄得cDNA,行PCR(92 ℃預(yù)變性50 s、1個循環(huán),95 ℃變性55 s、70 ℃退火60 s,共46個循環(huán))。miR-93以U6為內(nèi)參,用2-ΔΔCt法計算基因相對表達(dá)水平。各引物序列由上海生工生物工程股份有限公司合成。

1.7Western印跡法檢測蛋白表達(dá) 取胸主動脈組織1 cm,剪碎、裂解液裂解及勻漿后,提取胞漿及胞核中蛋白,二喹啉甲酸(BCA)法測蛋白濃度,制備分離膠及濃縮膠,取蛋白30 μg行電泳及電轉(zhuǎn)膜操作,滴加1∶500的一抗TLR4、NF-κB、p-NF-κB、ABCA1、ApoA1、ScR-A、Lox-1、CD11、IL-1β、iNOS、IL-10,YM1及1∶900的β-actin內(nèi)參抗體,4 ℃避光孵育24 h,室溫滴加1∶1 100的羊抗兔二抗孵育50 min,化學(xué)發(fā)光法浸膜顯影,Quantity One軟件分析條帶相對灰度值。

1.8統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS22.0軟件及Shapiro-Wilk軟件進(jìn)行t檢驗、方差分析、SNK-q檢驗。

2 結(jié) 果

2.1上調(diào)miR-93對血脂水平的影響 與正常對照組相比,模型組HDL-C水平明顯降低,TC、TG、LDL-C水平明顯升高(P<0.05)。與模型組相比,miR-93 agomir組HDL-C水平明顯升高,TC、TG、LDL-C水平明顯降低(P<0.05)。RS09組HDL-C水平較模型組進(jìn)一步明顯降低(P<0.05),TC、TG、LDL-C水平較模型組進(jìn)一步明顯升高(P<0.05)。與miR-93 agomir組相比,miR-93 agomir+RS09組HDL-C水平明顯降低,TC、TG、LDL-C水平明顯升高(P<0.05)。agomir-NC組與模型組血脂水平變化差異不顯著(P>0.05),見表1。

2.2上調(diào)miR-93對血清炎癥因子及循環(huán)內(nèi)皮細(xì)胞比例的影響 與正常對照組相比,模型組血清IL-6、CRP水平、循環(huán)內(nèi)皮細(xì)胞比例明顯升高(P<0.05)。與模型組相比,miR-93 agomir組血清IL-6、CRP水平、循環(huán)內(nèi)皮細(xì)胞比例明顯降低(P<0.05)。RS09組血清IL-6、CRP水平、循環(huán)內(nèi)皮細(xì)胞比例較模型組進(jìn)一步明顯升高(P<0.05)。與miR-93 agomir組相比,miR-93 agomir+RS09組血清IL-6、CRP水平、循環(huán)內(nèi)皮細(xì)胞比例明顯升高(P<0.05)。agomir-NC組與模型組血清炎癥因子及循環(huán)內(nèi)皮細(xì)胞比例變化差異不顯著(P>0.05),見表1。

表1 各組TC、TG、LDL-C、HDL-C水平、血清炎癥因子及循環(huán)內(nèi)皮細(xì)胞比例比較

2.3上調(diào)miR-93對血管組織病理變化的影響 Movat染色及油紅O染色可見,正常對照組血管壁層次結(jié)構(gòu)清晰,無脂質(zhì)沉積。模型組可見血管內(nèi)膜層增加,被染成紫色的泡沫細(xì)胞聚集明顯,內(nèi)膜及中膜層有大量脂質(zhì)彌漫,斑塊面積百分比明顯高于正常對照組(P<0.05)。miR-93 agomir組可見內(nèi)膜層逐漸變薄,紫色的泡沫細(xì)胞聚集減少,脂質(zhì)彌漫沉積減少,斑塊面積百分比明顯低于模型組(P<0.05)。RS09組血管內(nèi)膜增厚進(jìn)一步增加,紫色泡沫細(xì)胞聚集增多,脂質(zhì)沉積進(jìn)一步加重,斑塊面積百分比明顯高于模型組(P<0.05)。miR-93 agomir+RS09組紫色泡沫細(xì)胞聚集及脂質(zhì)沉積較miR-93 agomir組嚴(yán)重,斑塊面積百分比明顯高于miR-93 agomir組(P<0.05)。agomir-NC組病理變化與模型組相似。見表2、圖1。

2.4上調(diào)miR-93對血管組織CD11陽性表達(dá)及miR-93/TLR4/NF-κB信號軸基因及蛋白表達(dá)的影響 CD11為M1型巨噬細(xì)胞標(biāo)記的特異性抗體,免疫組化陽性染色呈黃棕色。與正常對照組相比,模型組CD11陽性表達(dá)、TLR4、p-NF-κB/NF-κB蛋白表達(dá)明顯升高,miR-93表達(dá)明顯降低(P<0.05)。與模型組相比,miR-93 agomir組CD11陽性表達(dá)、TLR4、p-NF-κB/NF-κB蛋白表達(dá)降低,miR-93表達(dá)明顯升高(P<0.05);RS09組CD11陽性表達(dá)、TLR4、p-NF-κB/NF-κB蛋白表達(dá)較模型組進(jìn)一步明顯升高(P<0.05),miR-93表達(dá)較模型組相比差異不顯著(P>0.05)。與miR-93 agomir組相比,miR-93 agomir+RS09組CD11陽性表達(dá)、TLR4、p-NF-κB/NF-κB蛋白表達(dá)明顯升高(P<0.05),miR-93表達(dá)差異不顯著(P>0.05)。agomir-NC組與模型組相比上述指標(biāo)變化差異不顯著(P>0.05),見表2、圖2、圖3。

表2 各組動脈血管斑塊面積、CD11陽性表達(dá)及miR-93、TLR4、p-NF-κB/NF-κB蛋白表達(dá)比較

圖1 各組胸主動脈血管(×40)

圖2 各組動脈血管CD11表達(dá)(免疫組化染色,×400)

2.5上調(diào)miR-93對血管組織脂質(zhì)形成相關(guān)蛋白表達(dá)的影響 與正常對照組相比,模型組ScR-A、Lox-1蛋白表達(dá)明顯升高,ABCA1、ApoA1蛋白表達(dá)明顯降低(P<0.05)。與模型組相比,miR-93 agomir組ScR-A、Lox-1蛋白表達(dá)明顯降低,ABCA1、ApoA1表達(dá)明顯升高(P<0.05);RS09組ScR-A、Lox-1蛋白表達(dá)較模型組進(jìn)一步明顯升高,ABCA1、ApoA1蛋白表達(dá)較模型組進(jìn)一步明顯降低(P<0.05)。與miR-93 agomir組相比,miR-93 agomir+RS09組ScR-A、Lox-1蛋白表達(dá)明顯升高,ABCA1、ApoA1蛋白表達(dá)明顯降低(P<0.05)。agomir-NC組與模型組相比上述指標(biāo)變化差異不顯著(P>0.05),見圖3、表3。

1～6:正常對照組、模型組、miR-93 agomir組、RS09組、agomir-NC組、miR-93 agomir+RS09組

2.6上調(diào)miR-93對血管組織巨噬細(xì)胞極化相關(guān)蛋白表達(dá)的影響 與正常對照組相比,模型組M1型巨噬細(xì)胞極化相關(guān)蛋白(IL-1β、iNOS)表達(dá)明顯升高(P<0.05),M2巨噬細(xì)胞極化相關(guān)蛋白(IL-10,YM1)表達(dá)明顯降低(P<0.05)。與模型組相比,miR-93 agomir組IL-1β、iNOS蛋白表達(dá)明顯降低,IL-10、YM1蛋白表達(dá)明顯升高(P<0.05)。RS09組IL-1β、iNOS表達(dá)較模型組明顯升高,IL-10、YM1蛋白表達(dá)較模型組明顯降低(P<0.05)。與miR-93 agomir組相比,miR-93 agomir+RS09組蛋白IL-1β、iNOS表達(dá)明顯升高,IL-10、YM1蛋白表達(dá)明顯降低(P<0.05)。agomir-NC組與模型組相比上述指標(biāo)差異不顯著(P>0.05),見圖3、表3。

表3 各組動脈血管組織ScR-A、Lox-1、ABCA1、ApoA1蛋白、IL-1β、iNOS、IL-10、YM1表達(dá)比較

3 討 論

AS是引起心腦血管疾病患病率及死亡率逐年攀升的重要原因,防治AS對阻止AS性心腦血管疾病流行有重要作用〔11〕。炎癥是促進(jìn)AS脂質(zhì)沉積及斑塊形成的關(guān)鍵因素。大量研究發(fā)現(xiàn),AS患者機體中存在促炎因子如IL-6及CRP升高現(xiàn)象〔12〕,且IL-6及CRP等促炎介質(zhì)的升高,一方面可刺激并損傷血管內(nèi)皮細(xì)胞,導(dǎo)致血管收縮功能降低,機體循環(huán)內(nèi)皮細(xì)胞比例升高而促進(jìn)血管內(nèi)皮損傷后再重構(gòu)〔13〕,另一方面可招募巨噬細(xì)胞,使巨噬細(xì)胞活化并通過內(nèi)皮細(xì)胞間隙進(jìn)入血管內(nèi)壁,氧化LDL-C成為ox-LDL后,吞噬ox-LDL轉(zhuǎn)化為泡沫細(xì)胞,來介導(dǎo)炎癥應(yīng)答及脂質(zhì)沉積〔14〕,加劇AS斑塊形成、導(dǎo)致血管內(nèi)皮功能異常及血栓形成,最終引起心血管事件的發(fā)生。本研究結(jié)果提示,AS大鼠造模成功。

另外,AS炎癥刺激單核巨噬細(xì)胞活化過程中,巨噬細(xì)胞一方面可極化成具有促炎表型的M1型細(xì)胞并釋放IL-1β、iNOS等促炎介質(zhì),來加劇巨噬細(xì)胞吞噬ox-LDL轉(zhuǎn)化為泡沫細(xì)胞,導(dǎo)致斑塊形成,另一方面可極化成具有抗炎表型的M2型巨噬細(xì)胞并分泌IL-10、YM1抗炎因子,來抑制ScR-A及Lox-1表達(dá),從而延緩ox-LDL的攝取及泡沫細(xì)胞的形成〔15〕。感染、脂代謝紊亂、炎癥等因素刺激動脈內(nèi)皮損傷過程中,TLR4可迅速識別并結(jié)合動脈損傷過程中釋放的內(nèi)源性配體,誘導(dǎo)NF-κB入核活化,來釋放大量炎癥介質(zhì),刺激巨噬細(xì)胞極化,調(diào)控LDL-C修飾成ox-LDL而介導(dǎo)脂質(zhì)形成及炎癥應(yīng)答,并促進(jìn)炎癥細(xì)胞趨化及脂質(zhì)沉積,加劇AS斑塊形成及內(nèi)皮細(xì)胞損傷〔16〕。本研究結(jié)果提示,TLR4/NF-κB介導(dǎo)的炎癥及巨噬細(xì)胞極化激活,可能是導(dǎo)致AS血管內(nèi)皮損傷、泡沫細(xì)胞聚集及脂質(zhì)沉積形成的關(guān)鍵通路。

目前已有用炎癥特異性抑制劑〔IL-1受體抑制劑、NOD樣受體熱蛋白結(jié)構(gòu)域相關(guān)蛋白(NLRP)3受體阻斷劑〕來靶向抑制炎癥因子的表達(dá),發(fā)揮抗AS炎癥及斑塊形成,但這些靶向抑制劑并不能完全降低炎癥反應(yīng)的復(fù)發(fā)及心血管事件的發(fā)生〔17〕,并認(rèn)為AS血管內(nèi)皮炎癥損傷及脂質(zhì)沉積,可能與miRNA的異常表達(dá)有關(guān),且炎癥特異性抑制劑的使用,并不能逆轉(zhuǎn)miRNA異常引發(fā)的炎癥靶蛋白轉(zhuǎn)錄翻譯的異?！?8〕。故尋找抑制TLR4/NF-κB炎癥信號的上游miRNA,內(nèi)源性靶向調(diào)控TLR4/NF-κB炎癥應(yīng)答信號,可能是防治AS的有效策略。miRNA中的miR-93是TLR4的上游調(diào)節(jié)因子〔19〕,已有研究發(fā)現(xiàn),miR-93可靶向負(fù)調(diào)控TLR4表達(dá),阻斷TLR4/NF-κB炎癥應(yīng)答信號活化,來抵抗骨關(guān)節(jié)、肺炎等炎癥性疾病的進(jìn)一步惡化〔20,7〕。另外,miR-93已被發(fā)現(xiàn)在AS患者外周單核細(xì)胞中表達(dá)降低,且AS患者miR-93表達(dá)的缺失可能與ABCA1、ApoA1等脂肪轉(zhuǎn)運相關(guān)蛋白的缺失有關(guān)〔6〕。但外源性上調(diào)miR-93表達(dá),是否能靶向抑制TLR4/NF-κB炎癥應(yīng)答信號活化,緩解AS內(nèi)皮炎癥損傷及斑塊形成,還未見報道。本研究結(jié)果提示,外源性上調(diào)miR-93表達(dá),可靶向抑制TLR4/NF-κB炎癥應(yīng)答信號活化,降低炎癥刺激引起的內(nèi)皮細(xì)胞損傷、泡沫細(xì)胞聚集、脂質(zhì)沉積。TLR4/NF-κB特異性激活劑-RS09可拮抗miR-93 agomir的抗炎、抗M1型巨噬細(xì)胞極化、抗泡沫細(xì)胞聚集及抗脂質(zhì)沉積作用。

綜上,外源性上調(diào)miR-93表達(dá)可能通過靶向抑制TLR4/NF-κB通路活化,發(fā)揮抗炎、抗M1型巨噬細(xì)胞極化、抗泡沫細(xì)胞聚集及抗脂質(zhì)沉積作用,改善AS大鼠血管內(nèi)皮損傷及斑塊形成。但引起miR-93表達(dá)異常的上游調(diào)控機制還不甚清楚,有待后續(xù)繼續(xù)研究。