王清 武香梅 劉福升 宮理達(dá) 陳震 陸愛萍
(1北京老年醫(yī)院病理科,北京 100095;2北京腫瘤醫(yī)院病理科)
肺癌是臨床常見的惡性腫瘤類疾病,而老年肺癌則是導(dǎo)致患者死亡及產(chǎn)生不良預(yù)后的重要病因〔1〕。老年肺癌也是主要的轉(zhuǎn)移致死疾病之一,其復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移率升高是影響老年患者生存和死亡的最關(guān)鍵因素,其中淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移老年是肺癌當(dāng)中較常見的,可及大的影響和降低肺癌患者的生存率。血管生成在肺癌的發(fā)生和發(fā)展中具有關(guān)鍵的作用,而血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)A是其中重要的調(diào)控因子,其廣泛存在于受損的血管內(nèi)皮細(xì)胞中,可增加內(nèi)皮祖細(xì)胞的遷移,在病理形態(tài)下對(duì)肺癌的血管生成起重要促進(jìn)作用〔2〕。缺氧誘導(dǎo)因子(HIF)-1α是介導(dǎo)VEGF的關(guān)鍵執(zhí)行因子,是在缺氧誘導(dǎo)因子中具體控制氧濃度的關(guān)鍵因子,在肺癌中具有高表達(dá)現(xiàn)象,可幫助癌細(xì)胞建立促進(jìn)自身分泌的信號(hào)通路并增加其侵襲特性〔3〕。肺癌的產(chǎn)生常需依靠于多種受體、血管內(nèi)皮生長因子、信號(hào)通路傳導(dǎo),且血管生成是加快肺癌疾病進(jìn)展的重要因素〔4〕。肺癌細(xì)胞的生長和轉(zhuǎn)移與新生血管的生成之間具有重要聯(lián)系,且當(dāng)癌細(xì)胞超過一定數(shù)量時(shí)便可通過分泌各種促血管生成因子,在其組織周圍形成新生的血管網(wǎng)以促進(jìn)腫瘤內(nèi)部的血管循環(huán)〔5〕。因此,抑制肺癌中細(xì)胞內(nèi)的血管生成已成為現(xiàn)階段老年肺癌治療的重要舉措之一。本研究探討VEGFA、HIF-1α在老年肺癌組織中表達(dá)及對(duì)肺癌細(xì)胞血管管腔形成的影響。
1.1一般資料 選取北京老年醫(yī)院2020年6月至2021年12月根據(jù)世界衛(wèi)生組織(WHO)病理學(xué)診斷標(biāo)準(zhǔn)確診,并在北京老年醫(yī)院進(jìn)行根治手術(shù)的100例肺老年癌患者所切除的肺部病理組織作為本次研究標(biāo)本。其中男63例,女37例,年齡35~73歲,平均(56.23±21.15)歲,有吸煙史患者72例,飲酒史患者78例,依據(jù)TNM分期標(biāo)準(zhǔn),Ⅰ期39例、Ⅱ期42例、Ⅲ期19例。納入標(biāo)準(zhǔn):患者經(jīng)病理檢測確診為肺癌;術(shù)前沒有進(jìn)行放、化療及其他腫瘤相關(guān)治療。排除標(biāo)準(zhǔn):以往有腫瘤疾病史;重要組織器官產(chǎn)生病變。此次研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn),所有患者及家屬對(duì)本次研究知情同意并簽署同意書。
1.2實(shí)驗(yàn)儀器 肺癌細(xì)胞株SPC-A-1(上海冠導(dǎo)生物工程公司,貨號(hào)C4601),顯微鏡(上海炳宇光學(xué)儀器公司產(chǎn)品,型號(hào)XDS-10),倒置生物顯微鏡(北京中顯恒業(yè)儀器,貨號(hào)DSZ2000X),顯色試劑盒(中杉金橋生物技術(shù)有限公司),CO2培養(yǎng)箱(上海三藤儀器,貨號(hào)DH-160I),恒溫箱(北京六一,貨號(hào)DYY-6C),兔抗人VEGF、癌細(xì)胞微血管密度(MVD)單克隆抗體(博世德生物技術(shù)有限公司)。
1.3細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染 將肺癌SPC-A-1細(xì)胞接種在有10%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基中,于含5%CO2的37 ℃常溫培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng),等細(xì)胞貼壁融合80%左右時(shí),使用0.25%的胰蛋白酶進(jìn)行傳代培養(yǎng),1次/2 d進(jìn)行傳代后,取對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞實(shí)驗(yàn)。SPC-A-1置于含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng),將SPC-A-1細(xì)胞以每孔1×105個(gè)接種在6孔板中,待細(xì)胞匯合約80%時(shí),更換新鮮無血清培養(yǎng)基繼續(xù)進(jìn)行培養(yǎng),于12 h后將細(xì)胞溶解于Opti-MEM培養(yǎng)基中,加入VEGFA的抑制劑(Axitinib,10 μmol/L)、HIF-1α抑制劑(YC-1,10 μmol/L)、VEGFA+HIF-1α(Axitinib+YC-1,20 μmol/L),收集轉(zhuǎn)染24 h后的肺癌細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。
1.4細(xì)胞分組 將未轉(zhuǎn)染的肺癌細(xì)胞進(jìn)行常規(guī)培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)作為SPC-A-1細(xì)胞組;將Axitinib與SPC-A-1細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)的作為Axitinib組;將YC-1與SPC-A-1細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)的作為YC-1組;將轉(zhuǎn)Axitinib+YC-1與SPC-A-1細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)的作為Axitinibt YC-1組。
1.5免疫組織化學(xué)染色法檢測VEGFA、HIF-1α陽性表達(dá) 使用免疫組化法檢測VEGFA、HIF-1α在癌組織及癌旁組織中的表達(dá)情況。標(biāo)本均在24 h內(nèi)采集于距病灶3 cm以外的癌旁組織和癌中心部位各取1塊,二甲苯脫蠟,15 min/次,乙醇梯度浸泡水化,清洗擦干后過氧化氫溫室下孵育15 min,磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗3次,檸檬酸鹽緩沖液微波熱修復(fù),于37 ℃,2%牛血清白蛋白(BSA)環(huán)境下封閉30 min,依據(jù)說明書用封閉液稀釋一抗VEGFA(1∶1 000)、HIF-1α(1∶500),4 ℃冰箱過夜后洗膜,加入稀釋的生物素標(biāo)記的二抗(1∶200),37 ℃水浴30 min,洗膜后二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色,PBS洗滌3次后用蘇木素復(fù)染進(jìn)行中性樹膠封片,HIF-1α、VEGFA胞質(zhì)中呈棕黃色顆粒沉淀為陽性,每張切片隨機(jī)取5個(gè)高倍鏡視野,計(jì)數(shù)100個(gè)細(xì)胞,陽性細(xì)胞數(shù)≤5%為0分,6%~25%為1分,26%~50%為2分,51%~75%為3分,>75%為4分,陽性強(qiáng)度黃色為1分,棕黃色為2分,褐色為3分,0~6分表示陽性(+),8~12分表示高陽性()所得積分相乘,將+、歸為表達(dá)陽性組計(jì)算陽性率。
1.6基質(zhì)膠小管形成實(shí)驗(yàn)檢測血管生成 將96 孔培養(yǎng)板、無菌移液槍頭等所有實(shí)驗(yàn)中將接觸基質(zhì)膠的器材放置在-20 ℃冰箱中預(yù)冷,-20 ℃保存的基質(zhì)膠于4 ℃冰箱中解凍,待基質(zhì)膠呈液態(tài)時(shí)向培養(yǎng)板每孔加入60 μl,再置于4 ℃ 15 min,常規(guī)30 min成膠。培養(yǎng)24 h后收集各組肺癌細(xì)胞培養(yǎng)上清液,將1×105個(gè)/ml單細(xì)胞懸液以每100 μl的體積接種于96孔培養(yǎng)板,分別加入200 μl肺癌細(xì)胞培養(yǎng)上清液,加200 μl RPMI1640培養(yǎng)液于對(duì)照組,細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h,使用顯微鏡觀察類血管結(jié)構(gòu)形成情況并拍照記錄,使用Im-age-Pro Plus軟件分析成管數(shù)量。
1.7免疫印跡檢測VEGF、MVD蛋白 取對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞加入裂解液中裂解,裂解后的細(xì)胞于10 000 r/min離心15 min,取上清液并收集細(xì)胞裂解物,Bradford法對(duì)蛋白濃度檢測,取20 μg總蛋白在1×十二烷基硫酸鈉(SDS)緩沖液中,沸騰5 min,10%SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE),電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜,用5%脫脂奶粉的PBS-T于室溫下封閉2 h后處理硝酸纖維素膜,加兔抗人VEGF(1∶1 000)、MVD(1∶800)、β-actin(1∶2 000),10%分離膠,稀釋后抗體4 ℃搖床孵育過夜,TBST洗滌3次,用辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗(1∶5 000)室溫下孵育2 h,TBST洗滌3 次,采用電化學(xué)發(fā)光(ECL)法檢測蛋白表達(dá)量,圖片灰度值進(jìn)行膠片條帶的分析。
1.8聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)檢測肺癌細(xì)胞中HIF-1α、VEGFA mRNA的表達(dá) 肺癌細(xì)胞培養(yǎng)48 h后,采用Trizol試劑提取各組細(xì)胞總RNA并測定其濃度,按照試劑盒說明書合成cDNA,使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA后,進(jìn)行實(shí)時(shí)PCR分析。進(jìn)行Real time PCR,反應(yīng)條件為95 ℃ 3 min預(yù)變性,90 ℃ 5 s變性,75 ℃ 1 min退火,70 ℃ 30 s延伸,共40個(gè)循環(huán),以β-actin作為內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)化參照,應(yīng)用2-△△Ct對(duì)基因進(jìn)行相對(duì)定量計(jì)算,引物序列:HIF-1α上游引物:5′-CTGCCACTGCCACCACAACTG-3′、下游:5′-TGCCACTGTATGCTGATGCCTGAG-3′,VEGFA上游引物:5′-GTACCTCCACCATGCCAAAGT-3′、下游:5′-CTACCAGGGTCTCGATTGGA-3′,β-actin上游引物:5′-ACTGATCAGGCTAGCAC-3′、下游:5′-ACATCTGCTGGAAGGTGGAC-3′。
1.9統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS20.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn),χ2檢驗(yàn)。
2.1肺癌組織及癌旁組織VEGFA、HIF-1α陽性表達(dá) 與癌旁組織比較,肺癌組織中VEGFA、HIF-1α陽性表達(dá)明顯較高(均P<0.001),見圖1,表1。
圖1 肺癌及癌旁組織中VEGFA、HIF-1α陽性表達(dá)(免疫組織化學(xué)染色,×200)
表1 肺癌組織及癌旁組織VEGFA、HIF-1α陽性表達(dá)〔n(%),n=10〕
2.2VEGFA、HIF-1α與患者淋巴轉(zhuǎn)移關(guān)系 肺癌組織中患者HIF-1α陽性、VEGFA陽性是否發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見表2。
表2 VEGFA、HIF-1α陽性與患者淋巴轉(zhuǎn)移關(guān)系〔n(%)〕
2.3抑制VEGFA、HIF-1α對(duì)SPC-A-1細(xì)胞血管管腔形成數(shù)量的影響 與SPC-A-1細(xì)胞組比較,Axitinib組、YC-1組、Axitinib+YC-1組管腔形成數(shù)量均明顯降低(P<0.05);與Axitinib組、YC-1組比較,Axitinib+YC-1組管腔形成數(shù)量均明顯降低(均P<0.05),見表3、圖2。
2.4抑制后的VEGFA、HIF-1α mRNA在SPC-A-1細(xì)胞中的表達(dá) 與SPC-A-1細(xì)胞組比較,Axitinib組、YC-1組、Axitinib+YC-1組VEGFA、HIF-1α mRNA表達(dá)均明顯降低(P<0.05);與Axitinib組、YC-1組比較,Axitinib+YC-1組VEGFA、HIF-1α mRNA表達(dá)均明顯降低(P<0.05),見表3。
2.5抑制后的VEGFA、HIF-1α對(duì)SPC-A-1細(xì)胞管腔形成因子的蛋白表達(dá) 與SPC-A-1細(xì)胞組比較,Axitinib組、YC-1組、Axitinib+YC-1組VEGF、MVD蛋白表達(dá)明顯降低(P<0.05);與Axitinib組、YC-1組比較,Axitinib+YC-1組VEGF、MVD蛋白表達(dá)明顯降低(P<0.05),見表3、圖3。
表3 各組細(xì)胞血管管腔形成數(shù)量、VEGF、MVD蛋白表達(dá)、VEGFA、HIF-1α mRNA比較
圖2 肺癌細(xì)胞血管管腔形成數(shù)量(基質(zhì)膠法,×100)
肺癌是現(xiàn)階段對(duì)人類健康造成較大威脅的疾病之一,且預(yù)后相對(duì)較差。HIF-1作為細(xì)胞在缺氧條件下所產(chǎn)生的一種核轉(zhuǎn)錄相關(guān)因子可促進(jìn)癌細(xì)胞形成,且HIF-1α的降低能夠一定程度上抑制癌細(xì)胞的增加,其原因可能是由于HIF-1所調(diào)節(jié)的血管內(nèi)皮生成因子表達(dá)下降相關(guān)〔6〕。在肺癌產(chǎn)生的過程中,HIF-1α一方面能夠促進(jìn)VEGF表達(dá),而另一方面VEGF表達(dá)又加劇了肺癌疾病的發(fā)展〔7,8〕。
HIF-1可在缺氧環(huán)境下介導(dǎo)區(qū)域性和系統(tǒng)性的缺氧反應(yīng)及相關(guān)適應(yīng)性反應(yīng)〔9〕。以往實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn),VEGFA、HIF-1在人類結(jié)腸癌、乳腺癌及子宮癌前病變中等多種癌癥疾病中均具有過表達(dá)現(xiàn)象,且在正常組織中并無相關(guān)表達(dá)〔10~12〕。本研究結(jié)果提示,VEGFA、HIF-1α與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈顯著正相關(guān),分析原因可能VEGFA陽性率升高使肺癌細(xì)胞的遷移活動(dòng)增強(qiáng)且更易出現(xiàn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移現(xiàn)象相關(guān)。
本研究中肺癌細(xì)胞中抑制VEGFA與HIF-1α可抑制血管管腔形成,提示有效抑制VEGFA、HIF-1α表達(dá)對(duì)抑制肺癌細(xì)胞具有重要作用。抑制VEGFA與HIF-1α后使得肺癌細(xì)胞的滋養(yǎng)和增殖力進(jìn)行性減退并且導(dǎo)致肺癌細(xì)胞管腔生成發(fā)生障礙使其重鑄不足,同時(shí)也在一定程度上降低了血管內(nèi)皮細(xì)胞對(duì)VEGFA、HIF-1α的敏感特性,有效抑制了血管的形成重建及新生。張文英等〔13〕研究發(fā)現(xiàn),在肺腺癌中抑制VEGF可一定程度上降低肺腺癌體外微血管的形成,與本研究結(jié)果相類似。肺癌的發(fā)生及癌細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)移都需要持續(xù)的新生血管,而VEGF為促進(jìn)血管形成的關(guān)鍵因子,不僅能夠通過與血管內(nèi)皮細(xì)胞相結(jié)合而促進(jìn)癌細(xì)胞的血管新生,還對(duì)促進(jìn)癌轉(zhuǎn)移概率、提高血管通透性、增進(jìn)淋巴內(nèi)皮細(xì)胞轉(zhuǎn)移等具有關(guān)鍵調(diào)節(jié)作用〔14〕。相關(guān)研究表示,MVD的增加反映了癌細(xì)胞的血管生成增多,同時(shí)提示肺癌細(xì)胞的惡性行為能力也有所增加〔15〕。本研究發(fā)現(xiàn),抑制VEGFA、HIF-1α能夠顯著降低肺癌細(xì)胞中的血管管腔形成因子VEGF及MVD表達(dá)。相關(guān)研究表示,VEGF可在一定程度上激活蛋白酶表達(dá)致使細(xì)胞外的基質(zhì)被降解,進(jìn)而在肺癌細(xì)胞的生成和發(fā)展中誘導(dǎo)血管因子生成而加快MVD形成〔16〕。以往在VEGF和MVD的關(guān)系研究中發(fā)現(xiàn),抑制肺癌中的VEGF、MVD表達(dá)可抑制小細(xì)胞肺癌侵襲轉(zhuǎn)移〔17〕。成龍等〔18〕在VEGF抑制劑治療肺癌的療效和安全性的研究中表示,VEGF抑制劑可提高患者的生存率。由此本文推測,抑制VEGFA、HIF-1α可使癌細(xì)胞中的血管新生、形成、成熟等受限,破壞癌細(xì)胞血管的完整性的同時(shí)抑制VEGF的血管芽生,進(jìn)而阻止肺癌細(xì)胞的生長。
本研究結(jié)果提示,抑制后的VEGFA、HIF-1α對(duì)抑制肺癌細(xì)胞中的VEGFA、HIF-1α mRNA表達(dá)具有一定作用。以往研究發(fā)現(xiàn),當(dāng)對(duì)常規(guī)細(xì)胞進(jìn)行相關(guān)有氧因子的抑制處理后,可在一定程度上使得VEGF mRNA的可逆性表達(dá)被抑制〔19〕。在該環(huán)節(jié)中HIF-1α作為主要的參與因子可通過結(jié)合VEGF周圍的缺氧反應(yīng)元件抑制相關(guān)因子活性并干擾VEGF mRNA的穩(wěn)定性。因此,HIF-1α可能在疾病中可在轉(zhuǎn)錄及轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)VEGF的相關(guān)表達(dá)。Zhang等〔20〕研究發(fā)現(xiàn),HIF-1α同VEGF表達(dá)呈正相關(guān),在疾病中通過降低HIF-1α、VEGF可達(dá)到抑制不良腫瘤形成及腫瘤血管新生的作用。而經(jīng)抑制的VEGFA、HIF-1α可通過降低肺癌中淋巴細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、血管生長因子等的生成,進(jìn)而降低肺癌細(xì)胞生長和轉(zhuǎn)移率。
綜上,VEGFA、HIF-1α均在老年肺癌組織中呈高表達(dá)現(xiàn)象,并與患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移具有一定聯(lián)系,而經(jīng)抑制的VEGFA、HIF-1α對(duì)降低肺癌細(xì)胞血管管腔形成及肺癌的發(fā)生發(fā)展具有重要作用,并對(duì)預(yù)測老年肺癌患者的疾病具有積極意義。