馬玲 鐘利國(guó) 崔裕如 劉彬

(荊州市第一人民醫(yī)院 1中醫(yī)科,湖北 荊州 434000;2科研科)

阿爾茨海默病(AD)是一種中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病,其發(fā)病機(jī)制較為隱匿,神經(jīng)細(xì)胞凋亡、大腦皮層等形成神經(jīng)纖維纏結(jié)是AD的主要病理特征〔1〕。β淀粉樣蛋白 (Aβ)25～35聚集與沉積可促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞凋亡從而促進(jìn)AD的發(fā)生〔2〕。研究表明,部分中藥的活性成分或提取物具有抗炎、抗氧化等作用,并可用于治療AD〔3,4〕。靈芝可減緩AD患者神經(jīng)退行性疾病,并可改善患者的非運(yùn)動(dòng)癥狀,研究表明,靈芝提取物可減輕1-甲基-4-苯基-吡啶離子(MPP+)誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞損傷〔5〕。但靈芝提取物與Aβ25～35誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞損傷的相關(guān)研究尚未見(jiàn)報(bào)道。miR-143-3p在AD細(xì)胞模型中表達(dá)水平升高,抑制其表達(dá)可促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞存活〔6〕。本研究通過(guò)Aβ25～35誘導(dǎo)大鼠腎上腺嗜鉻細(xì)胞PC12建立AD細(xì)胞模型,探討靈芝提取物通過(guò)調(diào)控miR-143-3p表達(dá)對(duì)Aβ25～35誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞損傷的影響。

1 材料與方法

1.1材料與試劑 西安瑞仁生物技術(shù)有限公司提供靈芝提取物;上海弘順生物科技有限公司提供大鼠腎上腺嗜鉻細(xì)胞PC12;美國(guó)Invitrogen提供LipofectamineTM3000轉(zhuǎn)染試劑;北京天根生化科技有限公司提供miRNA提取試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒及SYBR Green試劑盒;北京索萊寶提供噻唑藍(lán)(MTT)試劑盒、細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒;南京建成生物工程研究所提供丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、過(guò)氧化氫酶(CAT)檢測(cè)試劑盒;武漢艾美捷提供兔抗鼠酶切的胱天蛋白酶(Cleaved-caspase)3、Cleaved-caspase9抗體購(gòu)自;美國(guó)Santa Cruz提供內(nèi)參GAPDH抗體與二抗。

1.2實(shí)驗(yàn)分組 PC12細(xì)胞接種于96孔板,用20 μmol/L的Aβ25～35處理PC12細(xì)胞24 h〔7〕建立AD細(xì)胞模型(Aβ25～35組),control組為未經(jīng)Aβ25～35處理細(xì)胞;分別加入含有不同濃度(0.1、1.0、10.0 mg/L)靈芝提取物〔8〕與20 μmol/L Aβ25～35的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h,分別記為Aβ25～35+GLE-L組、Aβ25～35+GLE-M組、Aβ25～35+GLE-H組。另設(shè)置Aβ25～35+anti-miR-NC 組(轉(zhuǎn)染anti-miR-NC后,用20 μmol/L的Aβ25～35處理PC12細(xì)胞24 h)、Aβ25～35+anti-miR-143-3p 組(轉(zhuǎn)染anti-miR-143-3p后,用20 μmol/L的Aβ25～35處理PC12細(xì)胞24 h);參照LipofectamineTM3000轉(zhuǎn)染試劑說(shuō)明書(shū)將miR-NC、miR-143-3p mimics分別轉(zhuǎn)染至PC12細(xì)胞,轉(zhuǎn)染成功后加入含有濃度為10 mg/L靈芝提取物與20 μmol/L Aβ25～35的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h,分別記為Aβ25～35+GLE+miR-NC組、Aβ25～35+GLE+miR-143-3p組。

1.3MTT檢測(cè) PC12細(xì)胞接種在96孔板中,按1.2法處理細(xì)胞,培養(yǎng)2 d后,每孔中加入20 μl MTT試劑,繼續(xù)反應(yīng)4 h倒掉培養(yǎng)液,每孔中加150 μl 二甲基亞砜(DMSO)試劑,于酶標(biāo)儀490 nm處檢測(cè)吸光度(OD)值。

1.4流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡 收集各組細(xì)胞,加入1×結(jié)合緩沖液將細(xì)胞重懸,加膜聯(lián)蛋白Ⅴ-異硫氰酸熒光素(Annexin Ⅴ-FITC)和碘化丙啶(PI)試劑5 μl,避光反應(yīng)15 min,上流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

1.5MDA含量和SOD、CAT活性檢測(cè) 取各組PC12細(xì)胞,裂解后取上清液,檢測(cè)MDA含量、SOD和CAT活性。

1.6實(shí)時(shí)熒光定量-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-qPCR)檢測(cè)miR-143-3p表達(dá)水平 采用miRNA提取試劑盒分別提取PC12細(xì)胞總RNA,反轉(zhuǎn)錄合成cDNA,以cDNA為模板進(jìn)行RT-qPCR擴(kuò)增,應(yīng)用ABI StepOnePlus熒光定量PCR儀檢測(cè)miR-143-3p相對(duì)表達(dá)量。

1.7Western印跡檢測(cè)Cleaved-caspase3、Cleaved-caspase9蛋白表達(dá) 提取各組PC12細(xì)胞總蛋白,取30 μg蛋白經(jīng)Cleaved-caspase3(1∶1 000)、Cleaved-caspase9(1∶1 000)電泳分離、轉(zhuǎn)膜、封閉后,與GAPDH抗體(1∶2 000)4 ℃孵育24 h,再與二抗稀釋液(1∶3 000)37 ℃孵育2 h,分析條帶灰度值。

1.8統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS21.0軟件進(jìn)行獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)、單因素方差分析。

2 結(jié) 果

2.1靈芝提取物對(duì)Aβ25～35誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞增殖、凋亡的影響 與control組比較,Aβ25～35組細(xì)胞活力明顯降低,細(xì)胞凋亡率和Cleaved-caspase3、Cleaved-caspase9蛋白表達(dá)明顯升高(P<0.05);與Aβ25～35組比較,Aβ25～35+GLE-L組、Aβ25～35+GLE-M組、Aβ25～35+GLE-H組細(xì)胞活力明顯升高,細(xì)胞凋亡率和Cleaved-caspase3、Cleaved-caspase9蛋白表達(dá)明顯降低,且呈劑量依賴(lài)性(P<0.05),見(jiàn)圖1、圖2、表1。

1～9:control組、Aβ25～35組、Aβ25～35+GLE-L組、Aβ25～35+GLE-M組、Aβ25～35+GLE-H組、Aβ25～35+anti-miR-NC組、Aβ25～35+anti-miR-143-3p組、Aβ25～35+GLE+miR-NC組、Aβ25～35+GLE+miR-143-3p組

圖2 靈芝提取物對(duì)PC12細(xì)胞凋亡的影響

2.2靈各組PC12細(xì)胞中MDA水平及SOD、CAT活性比較 與control組比較,Aβ25～35組MDA水平明顯升高,SOD、CAT活性明顯降低(P<0.05);與Aβ25～35組比較,Aβ25～35+GLE-L組、Aβ25～35+GLE-M組、Aβ25～35+GLE-H組MDA水平明顯降低,SOD、CAT活性明顯升高,且呈劑量依賴(lài)性(P<0.05),見(jiàn)表1。

2.3各組PC12細(xì)胞中miR-143-3p表達(dá)比較 與control組比較,Aβ25～35組miR-143-3p表達(dá)量明顯升高(P<0.05);與Aβ25～35組比較,Aβ25～35+GLE-L組、Aβ25～35+GLE-M組、Aβ25～35+GLE-H組miR-143-3p的表達(dá)量明顯降低,且呈劑量依賴(lài)性(P<0.05),見(jiàn)表1。

表1 靈芝提取物對(duì)PC12細(xì)胞增殖、凋亡和細(xì)胞中MDA含量、SOD、CAT活性及miR-143-3p表達(dá)的影響

2.4過(guò)表達(dá)或抑制miR-143-3p轉(zhuǎn)染效率 與miR-NC組(1.00±0.04)比較,miR-143-3p組miR-143-3p表達(dá)量(2.29±0.17)顯著升高(t=22.160,P<0.05);與anti-miR-NC組(0.98±0.08)比較,anti-miR-143-3p組miR-143-3p表達(dá)量(0.39±0.06)明顯降低(t=17.700,P<0.05)。

2.5抑制miR-143-3p對(duì)Aβ25～35誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞增殖、凋亡、MDA含量及SOD、CAT活性的影響 與Aβ25～35+anti-miR-NC組比較,Aβ25～35+anti-miR-143-3p組細(xì)胞活力明顯升高,細(xì)胞凋亡率和Cleaved-caspase3、Cleaved-caspase9蛋白表達(dá)、MDA水平明顯降低,SOD、CAT活性明顯升高(P<0.05),見(jiàn)圖1、圖3、表2。

圖3 抑制miR-143-3p對(duì)PC12細(xì)胞凋亡的影響

表2 抑制miR-143-3p對(duì)PC12細(xì)胞增殖、凋亡、MDA含量、SOD、CAT活性的影響

2.6miR-143-3p對(duì)靈芝提取物處理的Aβ25～35誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞增殖、凋亡、MDA含量、SOD、CAT活性的影響 與Aβ25～35+GLE+miR-NC組比較,Aβ25～35+GLE+miR-143-3p組細(xì)胞活力明顯降低,細(xì)胞凋亡率和Cleaved-caspase3、Cleaved-caspase9蛋白表達(dá)MDA水平明顯升高,SOD、CAT活性明顯降低(P<0.05),見(jiàn)圖1、表3、圖4。

表3 miR-143-3p對(duì)靈芝提取物處理的PC12細(xì)胞增殖、凋亡、MDA含量、SOD、CAT活性的影響

圖4 miR-143-3p對(duì)靈芝提取物處理的PC12細(xì)胞凋亡的影響

3 討 論

miRNA在AD細(xì)胞模型中表達(dá)異常,為AD的潛在治療靶點(diǎn)〔9,10〕。靈芝提取物可通過(guò)抗氧化作用,減輕角質(zhì)形成細(xì)胞和MPP+誘導(dǎo)的神經(jīng)元損傷〔11,12〕。靈芝提取物可減輕缺氧誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞損傷〔13〕。本研究結(jié)果與既往研究報(bào)道結(jié)果相似〔14,15〕,提示靈芝提取物可抑制Aβ25～35誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞氧化應(yīng)激。

缺糖缺氧誘導(dǎo)的腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞中miR-143-3p表達(dá)水平升高〔16〕。miR-143-3p表達(dá)下調(diào)可減輕缺血性腦卒中損傷并保護(hù)星形膠質(zhì)細(xì)胞〔17〕。抑制miR-143-3p表達(dá)可減輕腦缺血/再灌注損傷〔18〕。本研究結(jié)果顯示,靈芝提取物可能通過(guò)抑制miR-143-3p表達(dá)而減輕Aβ25～35誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞損傷,抑制miR-143-3p表達(dá)可促進(jìn)Aβ25～35誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞增殖及抑制細(xì)胞凋亡、氧化應(yīng)激,而miR-143-3p過(guò)表達(dá)可減弱靈芝提取物對(duì)Aβ25～35誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞損傷的作用。

綜上,靈芝提取物可通過(guò)抑制miR-143-3p表達(dá)而促進(jìn)Aβ25～35誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞增殖及抑制細(xì)胞凋亡、氧化應(yīng)激從而減輕細(xì)胞損傷,miR-143-3p可能作為靈芝提取物治療AD的潛在靶點(diǎn)。