段飛 陳羿 查官金 段訓(xùn)凰

(九江市第一人民醫(yī)院 1耳鼻咽喉頭頸外科,江西 九江 332600;2腫瘤科)

甲狀腺癌是一種主要起源于濾泡上皮細(xì)胞的常見內(nèi)分泌癌〔1〕。分為乳頭狀甲狀腺癌(PTC)、濾泡狀甲狀腺癌(FTC)、低分化甲狀腺癌(PDTC)和間變性甲狀腺癌(ATC)。其中PTC和FTC占甲狀腺癌病例的95%〔2〕。近十年來,甲狀腺癌的發(fā)病率呈現(xiàn)增長趨勢,這得益于醫(yī)療診斷技術(shù)的優(yōu)化〔3〕。目前手術(shù)切除是大多數(shù)甲狀腺癌患者的標(biāo)準(zhǔn)治療方法。然而,晚期甲狀腺癌患者的較差生存率表明仍然缺乏有效的治療策略〔4〕。特別是低分化或是晚期甲狀腺癌患者常出現(xiàn)淋巴轉(zhuǎn)移,需要進(jìn)行淋巴清掃和放射性碘治療〔5〕。因此,探究甲狀腺癌轉(zhuǎn)移相關(guān)的具體分子機(jī)制,對于甲狀腺癌轉(zhuǎn)移患者靶向治療的研究具有一定的意義。

MicroRNA(miRNA)是一類進(jìn)化上保守的小非編碼RNA,它們通過與其互補(bǔ)的靶mRNA結(jié)合在生物學(xué)的許多方面發(fā)揮關(guān)鍵作用〔6〕。目前,miRNA已成為癌癥新治療策略的有吸引力的工具和靶標(biāo)〔7〕。越來越多的研究已證實(shí),miRNA失調(diào)是許多癌癥發(fā)展的原因之一〔8〕。miR-340-5p是一種基因內(nèi)miRNA,位于宿主基因RNF130的內(nèi)含子區(qū)域、染色體5q35.313上。miR-340-5p在哺乳動物中表達(dá)模式與宿主基因相似〔9〕。越來越多的證據(jù)表明,miR-340-5p與多種癌發(fā)展相關(guān)。胃癌細(xì)胞中miR-340-5p的水平顯著高于正常胃黏膜細(xì)胞。敲降miR-340-5p通過上調(diào)細(xì)胞因子信號轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制因子(SOCS)3表達(dá)以抑制Janus激酶(JAK)-信號轉(zhuǎn)導(dǎo)子和轉(zhuǎn)錄激活子(STAT)3信號通路從而減弱胃癌細(xì)胞的細(xì)胞增殖并阻止細(xì)胞周期〔10〕。在甲狀腺癌的研究中發(fā)現(xiàn),miR-340-5p通過抑制骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMP)4在體外和體內(nèi)促進(jìn)甲狀腺癌的生長〔11〕。然而,目前關(guān)于miR-340-5p在甲狀腺癌轉(zhuǎn)移中的機(jī)制尚不清楚。轉(zhuǎn)換/蔗糖不發(fā)酵(SWI/SNF)復(fù)合物對染色質(zhì)調(diào)節(jié)和基因表達(dá)至關(guān)重要,其在約20%人類癌癥中的中發(fā)生突變或表達(dá)差異〔12〕。ARID亞基家族被認(rèn)為通過募集ATPase催化模塊來增強(qiáng)SWI/SNF復(fù)合物活性,其中ARID1A是SWI/SNF亞基最常發(fā)生突變的基因〔13〕。在ARID1A缺乏的情況下,增強(qiáng)子活性控制的缺陷會損害發(fā)育程序并導(dǎo)致基因表達(dá)廣泛失調(diào),從而驅(qū)動腫瘤形成〔14〕。研究顯示,小鼠BRAFV600E突變腫瘤中ARID1A的甲狀腺特異性缺失會促進(jìn)疾病進(jìn)展和降低存活率〔15〕。并且研究發(fā)現(xiàn),ARID1A mRNA表達(dá)與甲狀腺癌分化惡性程度呈負(fù)相關(guān)〔16〕。miR-340-5p是否通過調(diào)控ARID1A影響甲狀腺癌的發(fā)展有待進(jìn)一步證實(shí)。本研究在甲狀腺細(xì)胞BCPAP中通過分子生物學(xué)技術(shù),探討miR-340-5p靶向調(diào)控ARID1A對BCPAP細(xì)胞的活性、遷移和侵襲的影響。

1 材料與方法

1.1細(xì)胞培養(yǎng) 人類甲狀腺上皮胞系(HTori-3)和人類甲狀腺乳頭狀癌細(xì)胞系(IHH4、TPC-1、BCPAP、KTC-1)購自ATCC(美國)。非腫瘤來源的細(xì)胞系HTori-3在RPMI1640培養(yǎng)基中培養(yǎng),癌細(xì)胞系在DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)。兩種培養(yǎng)基均添加10%胎牛血清和雙抗。細(xì)胞培養(yǎng)放置在37 ℃的5% CO2的培養(yǎng)箱中。

1.2細(xì)胞活性檢測 噻唑藍(lán)(MTT)法測定不同處理后的甲狀腺癌細(xì)胞活性。處理后0、24、48 h,用MTT(5 mg/ml)處理細(xì)胞4 h。然后使用二甲基亞砜溶解所得的甲臜晶體及使用酶標(biāo)儀(ELX800)測量570 nm 處吸光度(OD)值。

1.3實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(RT-qPCR)使用Trizol試劑從甲狀腺癌細(xì)胞中提取總RNA。使用PrimeScriptTMRT試劑盒將1 μg RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。RT-qPCR使用 SYBR? Premix Ex TaqTMⅡ試劑盒進(jìn)行。熱循環(huán)條件如下:95 ℃ 30 s預(yù)變性,95 ℃ 10 s變性,60 ℃ 30 s退火,65 ℃ 30 s延伸,40個循環(huán)。GAPDH用作內(nèi)源性對照。同樣,miRNA被逆轉(zhuǎn)錄。使用TaqMan microRNA檢測試劑盒檢測miRNA表達(dá)。U6用作內(nèi)源性對照。通過2-ΔΔCt方法計(jì)算表達(dá)倍數(shù)。引物序列:miR-340-5p正向:5′-AACTGTTTGCAGAGGAAACTGA-3′,反向:5′-TCTTGGGGTTATTGGTCAGC-3′;ARID1A正向:5′-AAAAGCTGACCCCTTTAGCC-3′,反向:5′-GCTCCGGTGTTTTCTTCATC-3′;U6正向:5′-CTCGCTTCGG-CAGCACA-3′,反向:5′-AACGCTTCACGAATTTGCG-T-3′;GAPDH正向:5′-TCACCAGGGCTGCTTTTAAC-3′,反向:5′-TGACGGTGCCATGGAATTTG-3′。

1.4Western印跡 使用RIPA緩沖液從處理和未處理的甲狀腺癌細(xì)胞中提取總蛋白。使用二喹啉甲酸(BCA)定量試劑盒進(jìn)行定量后,在10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)凝膠中分離30 μg蛋白質(zhì)并轉(zhuǎn)移到聚偏氟乙烯(PVDF)膜上。將膜在室溫下用5%脫脂牛奶封閉1 h,然后在4 ℃下與一抗孵育過夜。使用的一抗如下:anti-ARID1A(1∶1 000;ab70816;Abcam)和anti-GAPDH(1∶2 000;ab9485;Abcam)。第2天,在室溫下用0.1%TBST洗滌3次后,將辣根過氧化物酶(HRP)綴合的山羊抗兔 IgG(1∶2 000;ab6721;Abcam)在室溫下孵育2 h。用0.1%TBST洗滌3次后,將印跡與電化學(xué)發(fā)光(ECL)試劑在室溫下孵育3 min,并在成像系統(tǒng)上曝光。使用ImageJ軟件評估和計(jì)算蛋白質(zhì)密度值。

1.5細(xì)胞轉(zhuǎn)染和雙熒光素酶報(bào)告基因檢測 甲狀腺癌細(xì)胞用miR-340-5p抑制物購自上海生工生物公司,編碼ARID1A特異性shRNA(sh-ARID1A)、相應(yīng)的陰性對照(sh-NC)進(jìn)行慢病毒包裝。使用Lipofectamine2000試劑轉(zhuǎn)染至細(xì)胞中。3′-UTR ARID1A基因位于1號染色體上,miR-340-5p的結(jié)合位點(diǎn)位于chr1:27108172-27108178。然后,在PCR擴(kuò)增結(jié)合位點(diǎn)處的ARID1A 3′-UTR區(qū)域,使用點(diǎn)突變試劑盒對其進(jìn)行點(diǎn)突變處理。將其與psiCHECK-2熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒連接得到野生型質(zhì)粒(WT-ARID1A)和突變型質(zhì)粒(MUT-ARID1A)。將細(xì)胞接種在24孔板上(1×105/孔)并在5% CO2中37 ℃培養(yǎng)。第2天,使用Lipofectamine2000試劑將細(xì)胞與miR-340-5p模擬物、miR-340-5p抑制物、WT-ARID1A、MUT-ARID1A或其對照質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染48 h后,通過Dual-Luciferase Reporter Assay 試劑盒檢測熒光素酶活性。

1.6細(xì)胞遷移和侵襲 Transwell 板插入的上室有(侵襲)或者沒有(遷移)涂有基質(zhì)膠。在處理后24 h將在無血清培養(yǎng)基中適當(dāng)處理的細(xì)胞(5×104)加入上室,同時(shí)將含有10%胎牛血清(FBS)的培養(yǎng)基加入下室。在37 ℃下孵育48 h后,使用棉簽小心去除留在上室中的細(xì)胞,同時(shí)使用4%多聚甲醛在室溫下將剩余的細(xì)胞染色10 min,并在6個隨機(jī)區(qū)域中的侵入細(xì)胞使用光學(xué)顯微鏡對每個樣品的視圖進(jìn)行計(jì)數(shù)。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用GraphPad Prism8.0軟件進(jìn)行方差分析、Tukey事后檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1甲狀腺癌細(xì)胞中miR-340-5p和ARID1A表達(dá) 與HTori-3細(xì)胞比較,miR-340-5p在IHH4、TPC-1、BCPAP、KTC-1細(xì)胞中明顯高表達(dá),ARID1A mRNA及蛋白在IHH4、TPC-1、BCPAP、KTC-1細(xì)胞中明顯低表達(dá)(P<0.05)。見表1、圖1。其中BCPAP細(xì)胞系差異最為顯著,因此選其作為后續(xù)研究的細(xì)胞系。

表1 不同甲狀腺癌相關(guān)細(xì)胞中miR-340-5p和ARID1A mRNA及蛋白表達(dá)比較

1～10:HTori-3、IHH4、TPC-1、BCPAP、KTC-1、對照組、抑制物對照+sh-RNA對照組、miR-340-5p抑制物組、sh-ARID1A組、miR-340-5p抑制物+sh-ARID1A組

2.2敲降miR-340-5p減少甲狀腺癌細(xì)胞的活性、遷移和侵襲 通過轉(zhuǎn)染抑制物對照和miR-340-5p抑制物檢測miR-340-5p表達(dá)結(jié)果發(fā)現(xiàn),與對照組相比,抑制物對照對miR-340-5p表達(dá)沒有明顯影響(P>0.05),miR-340-5p抑制物明顯降低了BCPAP細(xì)胞中miR-340-5p表達(dá)水平(P<0.05)。MTT檢測顯示,與對照組相比,抑制物對照對細(xì)胞活性沒有影響(P>0.05),miR-340-5p抑制物使BCPAP細(xì)胞48 h活性明顯降低(P<0.05)。與對照組相比,抑制物對照對細(xì)胞遷移和侵襲沒有明顯影響(P>0.05),miR-340-5p抑制物使BCPAP細(xì)胞遷移和侵襲個數(shù)明顯減少(P<0.05)。見表2、圖2。證明miR-340-5p對甲狀腺癌細(xì)胞系BCPAP的活性、遷移和侵襲具有調(diào)控作用。

表2 敲降miR-340-5p對甲狀腺癌細(xì)胞的活力、遷移和侵襲影響的比較

圖2 敲降miR-340-5p對甲狀腺癌細(xì)胞遷移和侵襲的影響(結(jié)晶紫染色,×100)

2.3miR-340-5p與ARID1A靶向結(jié)合關(guān)系 通過Starbase在線分析發(fā)現(xiàn),miR-340-5p與ARID1A具有直接結(jié)合位點(diǎn)。見圖3。提示ARID1A可能是miR-340-5p的靶標(biāo)基因。進(jìn)一步構(gòu)建了ARID1A雙熒光素酶突變載體。見圖4。通過雙熒光素酶報(bào)告基因檢測發(fā)現(xiàn),WT-ARID1A與miR-340-5p模擬物共轉(zhuǎn)染后,與模擬物對照熒光活性相比,miR-340-5p模擬物明顯抑制細(xì)胞的熒光活性(P<0.05);與抑制物對照熒光活性相比,miR-340-5p抑制物共轉(zhuǎn)染則明顯增加熒光活性(P<0.05),而MUT-ARID1A與模擬物對照或者抑制物對照相比,miR-340-5p模擬物或者抑制物共轉(zhuǎn)染后細(xì)胞中的熒光活性無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。見表3。表明miR-340-5p靶向調(diào)控ARID1A表達(dá)。

圖3 miR-340-5p與ARID1A存在結(jié)合位點(diǎn)

圖4 構(gòu)建ARID1A雙熒光素酶載體

表3 miR-340-5p與ARID1A靶向結(jié)合關(guān)系

2.4miR-340-5p通過調(diào)控ARID1A對甲狀腺癌細(xì)胞的活性、遷移和侵襲的影響 與對照組和抑制物對照+sh-RNA對照組相比,miR-340-5p抑制物組miR-340-5p表達(dá)明顯減少,敲降A(chǔ)RID1A對miR-340-5p表達(dá)沒有明顯影響(P<0.05),且miR-340-5p抑制物組與miR-340-5p抑制物+sh-ARIT1A組相比,miR-340-5p表達(dá)無顯著差異(P>0.05);與對照組及抑制物對照+sh-RNA對照組相比,miR-340-5p抑制物組ARID1A mRNA和蛋白表達(dá)明顯增加,sh-ARID1A組ARID1A mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)明顯減少(P<0.05);miR-340-5p抑制物組+sh-ARID1A組ARID1A mRNA和蛋白表達(dá)較sh-ARID1A組明顯升高(P<0.05)。證實(shí)ARID1A為miR-340-5p的下游基因。進(jìn)一步分析細(xì)胞活性、遷移和侵襲變化發(fā)現(xiàn),與對照組及抑制物對照+sh-RNA對照組相比,miR-340-5p抑制物組細(xì)胞48 h活性、遷移和侵襲數(shù)明顯減少(P<0.05),sh-ARID1A組細(xì)胞48 h活性、遷移、侵襲數(shù)顯著增加(P<0.05)。而同時(shí)敲降A(chǔ)RID1A明顯逆轉(zhuǎn)了單獨(dú)敲降miR-340-5p對48 h活性、遷移、侵襲的抑制作用。見圖1、圖5、表4。表明miR-340-5p通過調(diào)控ARID1A影響甲狀腺癌細(xì)胞活性、遷移和侵襲。

圖5 各組BCPAP細(xì)胞遷移和侵襲(結(jié)晶紫染色,×100)

表4 同時(shí)敲降miR-340-5p和miR-340-5p對甲狀腺癌細(xì)胞活力、遷移和侵襲影響的比較

3 討 論

預(yù)計(jì)到2030年,甲狀腺癌將成為第四大癌癥〔17〕。雖然高分化甲狀腺乳頭狀癌具有良好的預(yù)后,但50%淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率和20%復(fù)發(fā)率仍然使甲狀腺癌備受關(guān)注〔18〕。本研究在甲狀腺癌多個細(xì)胞系中發(fā)現(xiàn)miR-340-5p和ARID1A的表達(dá)失調(diào)。

miRNA通常通過調(diào)控下游mRNA的穩(wěn)定性和翻譯活性來影響下游基因的表達(dá)〔19〕。miR-340-5p在癌癥中具有抑癌和促癌兩種調(diào)控作用〔9〕。在結(jié)直腸癌〔20〕和乳腺癌〔21〕中miR-340-5p具有抑癌作用。與正常黏膜相比,miR-340-5p在結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)水平顯著降低且與較差的預(yù)后相關(guān)〔22〕。轉(zhuǎn)染miR-340-5p降低了結(jié)腸癌細(xì)胞的遷移和侵襲〔23〕。而在胃癌〔24〕、甲狀腺癌〔11〕等癌癥中miR-340-5p則具有促癌基因作用。研究發(fā)現(xiàn),miR-340-5p過表達(dá)促進(jìn)了腎癌細(xì)胞增殖、遷移、侵襲、細(xì)胞外丙氨酸水平和糖酵解水平〔25〕。Zhao等〔11〕研究發(fā)現(xiàn),在甲狀腺癌組織中miR-340-5p過表達(dá),具有較高病理分級的腫瘤具有較高水平的miR-340-5p。并且miR-340-5p過表達(dá)通過抑制BMP4顯著增強(qiáng)了甲狀腺癌細(xì)胞活力和集落形成,與本研究一致。miR-340-5p在不同癌癥中具有不同調(diào)控作用,推測可能是miR-340-5p具有疾病特異性。關(guān)于miR-340-5p對于癌癥調(diào)控機(jī)制仍需深入探究。

ARID1A編碼多功能SWI/SNF的復(fù)合亞基。ARID1A表達(dá)異常常見于多種癌癥類型,如卵巢癌、結(jié)直腸癌、膽管癌等〔26〕。研究表示,在肺腺癌中ARID1A的缺失導(dǎo)致組蛋白去乙酰化酶(HDAC)1募集缺失,并隨后增強(qiáng)了糖酵解相關(guān)基因的驅(qū)動轉(zhuǎn)錄從而促進(jìn)癌癥發(fā)展〔27〕。本研究證實(shí),ARID1A是miR-340-5p的靶標(biāo)下游。敲降A(chǔ)RID1A能夠逆轉(zhuǎn)miR-340-5p抑制劑對甲狀腺癌細(xì)胞活性、遷移和侵襲的抑制作用。本研究只在甲狀腺癌細(xì)胞中進(jìn)行研究,由于癌癥的轉(zhuǎn)移可能涉及多種因素影響,后續(xù)將在小鼠體內(nèi)進(jìn)行深入驗(yàn)證。