代宇 范偉

(貴州省人民醫(yī)院肝膽外科,貴州 貴陽(yáng) 550002)

非酒精性脂肪肝(NAFLD)屬于較常見(jiàn)的慢性肝病,隨著物質(zhì)生活提升,其發(fā)病率不斷升高,表現(xiàn)為肝細(xì)胞脂肪過(guò)度沉淀及脂肪樣變化,后期可能發(fā)展為肝硬化〔1,2〕。NAFLD不僅僅歸類于肝臟疾病,更屬于全身代謝類疾病,與高血壓、糖尿病等多種疾病存在關(guān)聯(lián)〔3〕。miR-34a與肝臟疾病具有顯著相關(guān)性,參與脂質(zhì)代謝的過(guò)程〔4〕。研究顯示〔5〕,自噬可以降解肝細(xì)胞內(nèi)脂滴,減輕肝臟脂質(zhì)蓄積,進(jìn)而改善肝功能,降低膽固醇水平,而AMP活化蛋白激酶(AMPK)/哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)信號(hào)通路屬于自噬相關(guān)信號(hào)通路。本研究探究AMPK/mTOR下調(diào)miR-34a對(duì)NAFLD大鼠的干預(yù)效果。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 選取43只雄性SD大鼠,體質(zhì)量180～213 g,平均(195.94±10.26)g,鼠齡(8.21±0.64)個(gè)月,生產(chǎn)許可證號(hào):SCXK(粵)2020-0055;使用許可證號(hào):SYXK(粵)2020-0242;購(gòu)自廣州賽業(yè)百沐生物科技有限公司,標(biāo)準(zhǔn)飼養(yǎng),自由飲水,在相對(duì)濕度為30%～35%、溫度為(23.51±1.51)℃下飼養(yǎng)1 w,陰暗交替12 h/12 h,本次實(shí)驗(yàn)操作均嚴(yán)格按照動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理相關(guān)要求進(jìn)行。

1.2主要試劑 miR-34a慢病毒(上海吉?jiǎng)P基因化學(xué)技術(shù)有限公司),逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(美國(guó)Fermentas公司),三酰甘油(TG)、總膽固醇(TC)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)檢測(cè)試劑盒(南京建成生物工程研究所),兔抗小鼠單克隆抗體磷酸化(p)-mTOR、p-AMPK(Cell Signal公司),蘇木素染液(武漢賽維爾生物科技有限公司),二喹啉甲酸(BCA)蛋白濃度試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)。

1.3主要儀器 冰凍切片機(jī)(德國(guó)Leica公司),病理組織包埋機(jī)(安徽電子科學(xué)研究所,型號(hào):BM-Ⅱ型),高速冷凍離心機(jī)(德國(guó)Hettich公司),血糖儀及配套試紙(強(qiáng)生醫(yī)療器材有限公司)。

1.4miR-34a慢病毒載體構(gòu)建 獲取基因序列,構(gòu)建miR-34a沉默轉(zhuǎn)染質(zhì)粒、miR-34a過(guò)表達(dá)轉(zhuǎn)染質(zhì)粒,設(shè)計(jì)并合成,并做慢病毒滴度測(cè)定(病毒滴度為5×108TU/ml)。

1.5動(dòng)物造?！?〕、分組及轉(zhuǎn)染 大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d隨機(jī)選取10只作為空白組,自由飲水,給予普通飼料,其余大鼠進(jìn)行NAFLD模型建立,均自由飲水,給予高脂飼料(包含84%的基礎(chǔ)飼料,4%蛋黃粉,10%豬油,2%膽固醇),進(jìn)行喂養(yǎng)。選取造模大鼠2只,處死,通過(guò)肝組織病理蘇木素-伊紅(HE)染色確定造模成功,將30只造模成功的大鼠隨機(jī)分為模型組、上調(diào)miR-34a組、下調(diào)miR-34a組,將10 μl miR-34a過(guò)表達(dá)慢病毒懸液、miR-34a沉默慢病毒懸液分別靜脈注入上調(diào)miR-34a組、下調(diào)miR-34a組大鼠尾部,空白組、模型組注射同劑量的蒸餾水。各組大鼠均干預(yù)4 w后進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.6葡萄糖耐受試驗(yàn)(OGTT) OGTT前大鼠禁食12 h,進(jìn)行操作時(shí)在各組大鼠腹腔內(nèi)注射2 g/kg的葡糖糖,0、30、60、120 min采集尾部靜脈血,使用血糖儀進(jìn)行血糖濃度的檢查,并繪制濃度曲線,計(jì)算曲線下面積(AUC)。

1.7血清中生化指標(biāo)檢測(cè) 各組大鼠進(jìn)行麻醉,取尾部靜脈血,3 000 r/min離心10 min,離心半徑5 cm,取上層血清,測(cè)定血清中TC、TG、LDL-C、HDL-C、空腹胰島素(FINS)含量,計(jì)算胰島素抵抗指數(shù)(HOMA-IR)。

1.8臟器系數(shù) 取各組大鼠進(jìn)行脫臼處死,取肝臟、胰腺,稱質(zhì)量,臟器系數(shù)=臟器濕質(zhì)量(g)/體質(zhì)量(g)×100%。

1.9miR-34a轉(zhuǎn)染效率鑒定 取各組大鼠肝組織,應(yīng)用TRIzoI進(jìn)行提取總RNA,依照反轉(zhuǎn)錄試劑盒轉(zhuǎn)錄為cDNA,PCR條件為:95 ℃10 s,95 ℃變性5 s,55 ℃退火,60 ℃延伸34 s,共40個(gè)循環(huán),miR-34a上游引物5′-TCGTGACTGGGATGCTGC-3′,下游5′-TCGGCATGCATTGATTGC-3′。以β-actin基因?yàn)閮?nèi)參,β-actin 基因上游引物5′-CACGATGGAGGGGCCGGACTCATC-3′,下游5′-TAAAGACCTCTATGCCAACACAGT-3′。采用2-△△Ct方法計(jì)算出miR-34a的表達(dá)量。

1.10病理學(xué)觀察 取各組大鼠相同肝組織,采用10%甲醛進(jìn)行固定,脫水、包埋、切片,行HE染色,觀察大鼠脂肪變性、小葉炎癥、氣球樣變,評(píng)估標(biāo)準(zhǔn)依照NAFLD活動(dòng)度積分(NAS)評(píng)分,標(biāo)準(zhǔn)為:(1)肝細(xì)胞呈現(xiàn)脂肪變性:<5%為0分;5%～33%為1分;34%～66%為2分;>66%為3分。(2)肝小葉內(nèi)炎癥程度:無(wú)為0分;<2個(gè)為1分;2～4個(gè)為2分;>4個(gè)為3分。(3)肝細(xì)胞呈氣球樣變性:無(wú)為0分;少見(jiàn)為1分;多見(jiàn)為2分。

1.11AMPK/mTOR信號(hào)通路相對(duì)蛋白表達(dá)量 Western印跡檢測(cè)大鼠肝組織 AMPK、mTOR蛋白表達(dá),加入裂解液進(jìn)行組織蛋白提取,用BCA法測(cè)定各樣本蛋白濃度,檢測(cè)蛋白濃度,將樣品上樣至8%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)凝膠上,經(jīng)電泳后轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜上,用磷酸鹽緩沖液(PBS)封閉2 h后,加入分別加入兔抗p-mTOR、p-AMPK、β-actin抗體,4 ℃孵育過(guò)夜,洗膜,加二抗,室溫孵育60 min。重復(fù)試驗(yàn)5次,顯色曝光,計(jì)算目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

1.12統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS19.0軟件進(jìn)行配對(duì)t檢驗(yàn)、χ2檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1病理學(xué)觀察 如圖1所示,空白組肝臟膜完整,肝索排列整齊,肝細(xì)胞形態(tài)正常細(xì)胞核大、圓,居于中,無(wú)病理變化;模型組肝索排列較為凌亂,肝細(xì)胞呈現(xiàn)較為嚴(yán)重的脂肪變性,細(xì)胞結(jié)構(gòu)較為模糊不清,細(xì)胞核縮小,炎性細(xì)胞浸潤(rùn)較為明顯;下調(diào)miR-34a組肝細(xì)胞脂肪變性嚴(yán)重,細(xì)胞結(jié)構(gòu)模糊,炎性細(xì)胞浸潤(rùn)非常明顯;上調(diào)miR-34a組肝索形態(tài)相對(duì)較齊,肝細(xì)胞脂肪變性較輕微,病理變化較輕。

圖1 各組肝組織病理特征(HE染色,×400)

2.2miR-34a轉(zhuǎn)染效率鑒定 如表1所示,與空白組相比,模型組、下調(diào)miR-34a組、上調(diào)miR-34a組miR-34a表達(dá)量上升,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05);與模型組相比,上調(diào)miR-34a組miR-34a表達(dá)量升高,下調(diào)miR-34a組miR-34a表達(dá)量下降,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05);與上調(diào)miR-34a組相比,下調(diào)miR-34a組miR-34a表達(dá)量下降,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05),說(shuō)明轉(zhuǎn)染成功。

2.3各組活動(dòng)度積分對(duì)比 如表1所示,與空白組相比,模型組、下調(diào)miR-34a組、上調(diào)miR-34a組肝臟系數(shù)、脂肪變性、小葉內(nèi)炎癥、氣球樣變積分均上升,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05);與模型組相比,上調(diào)miR-34a組肝臟系數(shù)、脂肪變性、小葉內(nèi)炎癥、氣球樣變積分升高,下調(diào)miR-34a組肝臟系數(shù)、脂肪變性、小葉內(nèi)炎癥、氣球樣變積分下降,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05);與上調(diào)miR-34a組相比,下調(diào)miR-34a組肝臟系數(shù)、脂肪變性、小葉內(nèi)炎癥、氣球樣變積分下降,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05),說(shuō)明下調(diào)miR-34a可改善大鼠肝臟病變。

表1 各組miR-34a轉(zhuǎn)染效率鑒定、活動(dòng)度積分對(duì)比

2.4各組血脂水平對(duì)比 如表2所示,與空白組相比,模型組、下調(diào)miR-34a組、上調(diào)miR-34a組TC、TG、LDL-C水平均上升,HDL-C水平降低,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05);與模型組相比,上調(diào)miR-34a組TC、TG、LDL-C水平均上升,HDL-C水平降低,下調(diào)miR-34a組TC、TG、LDL-C水平均降低,HDL-C水平上升,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05);與上調(diào)miR-34a組相比,下調(diào)miR-34a組TC、TG、LDL-C水平均降低,HDL-C水平上升,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05),說(shuō)明下調(diào)miR-34a對(duì)血脂紊亂調(diào)控效果較好。

2.5各組血糖水平及AUC比較 如表2所示,與空白組相比,模型組、下調(diào)miR-34a組、上調(diào)miR-34a組血糖、AUC均上升,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05);與模型組相比,上調(diào)miR-34a組血糖、AUC水平均上升,下調(diào)miR-34a組血糖、AUC水平均降低,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05);與上調(diào)miR-34a組相比,下調(diào)miR-34a組血糖、AUC水平均降低,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。

表2 各組血脂、血糖水平、AUC對(duì)比

2.6各組胰腺系數(shù)、FINS、HOMA-IR對(duì)比 如表3所示,與空白組相比,模型組、下調(diào)miR-34a組、上調(diào)miR-34a組胰腺系數(shù)、FINS、HOMA-IR均上升,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05);與模型組相比,上調(diào)miR-34a組胰腺系數(shù)、FINS、HOMA-IR均上升,下調(diào)miR-34a組胰腺系數(shù)、FINS、HOMA-IR均降低,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05);與上調(diào)miR-34a組相比,下調(diào)miR-34a組胰腺系數(shù)、FINS、HOMA-IR均降低,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05),說(shuō)明下調(diào)miR-34a可減輕胰島素抵抗,提高口服糖耐量。

2.7各組AMPK/mTOR信號(hào)通路相對(duì)蛋白表達(dá)量對(duì)比 如表3、圖2所示,與空白組相比,模型組、下調(diào)miR-34a組、上調(diào)miR-34a組AMPK表達(dá)降低,mTOR表達(dá)上升,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05);與模型組相比,上調(diào)miR-34a組AMPK表達(dá)降低,mTOR表達(dá)上升,下調(diào)miR-34a組AMPK表達(dá)上升,mTOR表達(dá)降低,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05);與上調(diào)miR-34a組相比,下調(diào)miR-34a組AMPK表達(dá)上升,mTOR表達(dá)降低,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。

表3 各組胰腺系數(shù)、FINS、HOMA-IR、AMPK/mTOR信號(hào)通路相對(duì)蛋白表達(dá)量對(duì)比

圖2 各組AMPK/mTOR信號(hào)通路蛋白表達(dá)

3 討 論

NAFLD發(fā)病屬于一種多因素進(jìn)行相互作用的過(guò)程,其機(jī)制可能為胰島素抵抗引起的肝臟TG積聚或脂肪變,肝細(xì)胞敏感性增高,能量代謝失衡,促進(jìn)NAFLD的發(fā)生進(jìn)展〔7～10〕。

研究指出〔11〕,NAFLD的發(fā)生與脂質(zhì)代謝、炎癥反應(yīng)高度相關(guān)。肝臟是脂質(zhì)代謝的主要場(chǎng)所,脂質(zhì)異常合成或分解時(shí),沉積于肝細(xì)胞,進(jìn)而導(dǎo)致NAFLD發(fā)生。研究顯示〔12〕,通過(guò)構(gòu)建NAFLD小鼠模型,檢測(cè)小鼠肝組織中miR-34a的表達(dá)情況,結(jié)果顯示,NAFLD小鼠肝組織中miR-34a表達(dá)異常上調(diào)。另有研究指出〔13〕,通過(guò)抑制miR-34a表達(dá),肝細(xì)胞中脂滴沉積顯著減少。上述研究提示,在NAFLD肝組織中miR-34a表達(dá)異常上升,抑制miR-34a表達(dá)可延緩疾病進(jìn)展。本文研究結(jié)果顯示,下調(diào)miR-34a后可干預(yù)NAFLD大鼠病情的發(fā)展,HE染色指出高脂飲食可引起大鼠脂肪肝病變,經(jīng)下調(diào)miR-34a干預(yù)后,脂肪病變得到緩解。有研究指出〔14〕,高脂飲食患者攝入較多的脂肪,易引起血漿中脂肪酸上升,導(dǎo)致胰島素抵抗,血液中TG、LDL-C等會(huì)發(fā)生異常升高,進(jìn)而脂質(zhì)代謝發(fā)生紊亂。肝臟累積大量脂肪后,脂質(zhì)發(fā)生過(guò)氧化,肝細(xì)胞凋亡,進(jìn)展為肝纖維化等疾病,嚴(yán)重可致肝硬化或肝癌〔15,16〕。本研究結(jié)果表明,下調(diào)miR-34a能調(diào)控血脂紊亂,進(jìn)而改善胰島素抵抗。

AMPK為細(xì)胞能量代謝的重要因子,在NAFLD的發(fā)生發(fā)展中占據(jù)較為重要地位,活化AMPK進(jìn)行合成代謝的抑制,促進(jìn)分解代謝,進(jìn)而使脂質(zhì)沉積程度得到降低〔17〕。mTOR相關(guān)的信號(hào)通路與自噬高度相關(guān),在自噬的發(fā)生進(jìn)展發(fā)揮較為重要的作用〔18〕。當(dāng)磷酸水平上升時(shí),AMPK可抑制mTOR水平,進(jìn)而加強(qiáng)自噬水平〔19〕。自噬與NAFLD關(guān)系密切,脂滴可轉(zhuǎn)移至溶酶體,形成自噬溶酶體,降解呈游離脂肪酸,因此,自噬激活可進(jìn)一步加強(qiáng)脂滴降解,進(jìn)而達(dá)到改善NAFLD的目的〔20〕。研究顯示,NAFLD狀態(tài)下,自噬水平較低,體內(nèi)自噬水平與代謝水平紊亂相關(guān),當(dāng)機(jī)體自噬水平打破,肝臟脂質(zhì)沉積進(jìn)一步加重。而miR-34a與脂質(zhì)代謝水平高度相關(guān)。本研究結(jié)果推測(cè),AMPK/mTOR信號(hào)通路活性的變化參與NAFLD的疾病進(jìn)程,通過(guò)慢病毒沉默miR-34a,可抑制AMPK、mTOR磷酸化的異常變化,miR-34a可能調(diào)控AMPK/mTOR的活性變化。

綜上,NAFLD發(fā)生后,伴隨脂質(zhì)代謝紊亂、肝功能異常等情況,經(jīng)下調(diào)miR-34a干預(yù)后,可較好的改善上述情況,延緩疾病進(jìn)展,其作用機(jī)制可能與調(diào)控AMPK/mTOR通路有關(guān)。