代宇 范偉

(貴州省人民醫(yī)院肝膽外科,貴州 貴陽 550002)

非酒精性脂肪肝(NAFLD)屬于較常見的慢性肝病,隨著物質生活提升,其發(fā)病率不斷升高,表現(xiàn)為肝細胞脂肪過度沉淀及脂肪樣變化,后期可能發(fā)展為肝硬化〔1,2〕。NAFLD不僅僅歸類于肝臟疾病,更屬于全身代謝類疾病,與高血壓、糖尿病等多種疾病存在關聯(lián)〔3〕。miR-34a與肝臟疾病具有顯著相關性,參與脂質代謝的過程〔4〕。研究顯示〔5〕,自噬可以降解肝細胞內脂滴,減輕肝臟脂質蓄積,進而改善肝功能,降低膽固醇水平,而AMP活化蛋白激酶(AMPK)/哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)信號通路屬于自噬相關信號通路。本研究探究AMPK/mTOR下調miR-34a對NAFLD大鼠的干預效果。

1 材料與方法

1.1實驗動物 選取43只雄性SD大鼠,體質量180～213 g,平均(195.94±10.26)g,鼠齡(8.21±0.64)個月,生產許可證號:SCXK(粵)2020-0055;使用許可證號:SYXK(粵)2020-0242;購自廣州賽業(yè)百沐生物科技有限公司,標準飼養(yǎng),自由飲水,在相對濕度為30%～35%、溫度為(23.51±1.51)℃下飼養(yǎng)1 w,陰暗交替12 h/12 h,本次實驗操作均嚴格按照動物實驗倫理相關要求進行。

1.2主要試劑 miR-34a慢病毒(上海吉凱基因化學技術有限公司),逆轉錄試劑盒(美國Fermentas公司),三酰甘油(TG)、總膽固醇(TC)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)檢測試劑盒(南京建成生物工程研究所),兔抗小鼠單克隆抗體磷酸化(p)-mTOR、p-AMPK(Cell Signal公司),蘇木素染液(武漢賽維爾生物科技有限公司),二喹啉甲酸(BCA)蛋白濃度試劑盒(上海碧云天生物技術有限公司)。

1.3主要儀器 冰凍切片機(德國Leica公司),病理組織包埋機(安徽電子科學研究所,型號:BM-Ⅱ型),高速冷凍離心機(德國Hettich公司),血糖儀及配套試紙(強生醫(yī)療器材有限公司)。

1.4miR-34a慢病毒載體構建 獲取基因序列,構建miR-34a沉默轉染質粒、miR-34a過表達轉染質粒,設計并合成,并做慢病毒滴度測定(病毒滴度為5×108TU/ml)。

1.5動物造?！?〕、分組及轉染 大鼠適應性喂養(yǎng)7 d隨機選取10只作為空白組,自由飲水,給予普通飼料,其余大鼠進行NAFLD模型建立,均自由飲水,給予高脂飼料(包含84%的基礎飼料,4%蛋黃粉,10%豬油,2%膽固醇),進行喂養(yǎng)。選取造模大鼠2只,處死,通過肝組織病理蘇木素-伊紅(HE)染色確定造模成功,將30只造模成功的大鼠隨機分為模型組、上調miR-34a組、下調miR-34a組,將10 μl miR-34a過表達慢病毒懸液、miR-34a沉默慢病毒懸液分別靜脈注入上調miR-34a組、下調miR-34a組大鼠尾部,空白組、模型組注射同劑量的蒸餾水。各組大鼠均干預4 w后進行后續(xù)實驗。

1.6葡萄糖耐受試驗(OGTT) OGTT前大鼠禁食12 h,進行操作時在各組大鼠腹腔內注射2 g/kg的葡糖糖,0、30、60、120 min采集尾部靜脈血,使用血糖儀進行血糖濃度的檢查,并繪制濃度曲線,計算曲線下面積(AUC)。

1.7血清中生化指標檢測 各組大鼠進行麻醉,取尾部靜脈血,3 000 r/min離心10 min,離心半徑5 cm,取上層血清,測定血清中TC、TG、LDL-C、HDL-C、空腹胰島素(FINS)含量,計算胰島素抵抗指數(shù)(HOMA-IR)。

1.8臟器系數(shù) 取各組大鼠進行脫臼處死,取肝臟、胰腺,稱質量,臟器系數(shù)=臟器濕質量(g)/體質量(g)×100%。

1.9miR-34a轉染效率鑒定 取各組大鼠肝組織,應用TRIzoI進行提取總RNA,依照反轉錄試劑盒轉錄為cDNA,PCR條件為:95 ℃10 s,95 ℃變性5 s,55 ℃退火,60 ℃延伸34 s,共40個循環(huán),miR-34a上游引物5′-TCGTGACTGGGATGCTGC-3′,下游5′-TCGGCATGCATTGATTGC-3′。以β-actin基因為內參,β-actin 基因上游引物5′-CACGATGGAGGGGCCGGACTCATC-3′,下游5′-TAAAGACCTCTATGCCAACACAGT-3′。采用2-△△Ct方法計算出miR-34a的表達量。

1.10病理學觀察 取各組大鼠相同肝組織,采用10%甲醛進行固定,脫水、包埋、切片,行HE染色,觀察大鼠脂肪變性、小葉炎癥、氣球樣變,評估標準依照NAFLD活動度積分(NAS)評分,標準為:(1)肝細胞呈現(xiàn)脂肪變性:<5%為0分;5%～33%為1分;34%～66%為2分;>66%為3分。(2)肝小葉內炎癥程度:無為0分;<2個為1分;2～4個為2分;>4個為3分。(3)肝細胞呈氣球樣變性:無為0分;少見為1分;多見為2分。

1.11AMPK/mTOR信號通路相對蛋白表達量 Western印跡檢測大鼠肝組織 AMPK、mTOR蛋白表達,加入裂解液進行組織蛋白提取,用BCA法測定各樣本蛋白濃度,檢測蛋白濃度,將樣品上樣至8%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)凝膠上,經電泳后轉移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜上,用磷酸鹽緩沖液(PBS)封閉2 h后,加入分別加入兔抗p-mTOR、p-AMPK、β-actin抗體,4 ℃孵育過夜,洗膜,加二抗,室溫孵育60 min。重復試驗5次,顯色曝光,計算目的蛋白的相對表達量。

1.12統(tǒng)計學處理 采用SPSS19.0軟件進行配對t檢驗、χ2檢驗。

2 結 果

2.1病理學觀察 如圖1所示,空白組肝臟膜完整,肝索排列整齊,肝細胞形態(tài)正常細胞核大、圓,居于中,無病理變化;模型組肝索排列較為凌亂,肝細胞呈現(xiàn)較為嚴重的脂肪變性,細胞結構較為模糊不清,細胞核縮小,炎性細胞浸潤較為明顯;下調miR-34a組肝細胞脂肪變性嚴重,細胞結構模糊,炎性細胞浸潤非常明顯;上調miR-34a組肝索形態(tài)相對較齊,肝細胞脂肪變性較輕微,病理變化較輕。

圖1 各組肝組織病理特征(HE染色,×400)

2.2miR-34a轉染效率鑒定 如表1所示,與空白組相比,模型組、下調miR-34a組、上調miR-34a組miR-34a表達量上升,具有統(tǒng)計學差異(P<0.05);與模型組相比,上調miR-34a組miR-34a表達量升高,下調miR-34a組miR-34a表達量下降,具有統(tǒng)計學差異(P<0.05);與上調miR-34a組相比,下調miR-34a組miR-34a表達量下降,具有統(tǒng)計學差異(P<0.05),說明轉染成功。

2.3各組活動度積分對比 如表1所示,與空白組相比,模型組、下調miR-34a組、上調miR-34a組肝臟系數(shù)、脂肪變性、小葉內炎癥、氣球樣變積分均上升,具有統(tǒng)計學差異(P<0.05);與模型組相比,上調miR-34a組肝臟系數(shù)、脂肪變性、小葉內炎癥、氣球樣變積分升高,下調miR-34a組肝臟系數(shù)、脂肪變性、小葉內炎癥、氣球樣變積分下降,具有統(tǒng)計學差異(P<0.05);與上調miR-34a組相比,下調miR-34a組肝臟系數(shù)、脂肪變性、小葉內炎癥、氣球樣變積分下降,具有統(tǒng)計學差異(P<0.05),說明下調miR-34a可改善大鼠肝臟病變。

表1 各組miR-34a轉染效率鑒定、活動度積分對比

2.4各組血脂水平對比 如表2所示,與空白組相比,模型組、下調miR-34a組、上調miR-34a組TC、TG、LDL-C水平均上升,HDL-C水平降低,具有統(tǒng)計學差異(P<0.05);與模型組相比,上調miR-34a組TC、TG、LDL-C水平均上升,HDL-C水平降低,下調miR-34a組TC、TG、LDL-C水平均降低,HDL-C水平上升,具有統(tǒng)計學差異(P<0.05);與上調miR-34a組相比,下調miR-34a組TC、TG、LDL-C水平均降低,HDL-C水平上升,具有統(tǒng)計學差異(P<0.05),說明下調miR-34a對血脂紊亂調控效果較好。

2.5各組血糖水平及AUC比較 如表2所示,與空白組相比,模型組、下調miR-34a組、上調miR-34a組血糖、AUC均上升,具有統(tǒng)計學差異(P<0.05);與模型組相比,上調miR-34a組血糖、AUC水平均上升,下調miR-34a組血糖、AUC水平均降低,具有統(tǒng)計學差異(P<0.05);與上調miR-34a組相比,下調miR-34a組血糖、AUC水平均降低,具有統(tǒng)計學差異(P<0.05)。

表2 各組血脂、血糖水平、AUC對比

2.6各組胰腺系數(shù)、FINS、HOMA-IR對比 如表3所示,與空白組相比,模型組、下調miR-34a組、上調miR-34a組胰腺系數(shù)、FINS、HOMA-IR均上升,具有統(tǒng)計學差異(P<0.05);與模型組相比,上調miR-34a組胰腺系數(shù)、FINS、HOMA-IR均上升,下調miR-34a組胰腺系數(shù)、FINS、HOMA-IR均降低,具有統(tǒng)計學差異(P<0.05);與上調miR-34a組相比,下調miR-34a組胰腺系數(shù)、FINS、HOMA-IR均降低,具有統(tǒng)計學差異(P<0.05),說明下調miR-34a可減輕胰島素抵抗,提高口服糖耐量。

2.7各組AMPK/mTOR信號通路相對蛋白表達量對比 如表3、圖2所示,與空白組相比,模型組、下調miR-34a組、上調miR-34a組AMPK表達降低,mTOR表達上升,具有統(tǒng)計學差異(P<0.05);與模型組相比,上調miR-34a組AMPK表達降低,mTOR表達上升,下調miR-34a組AMPK表達上升,mTOR表達降低,具有統(tǒng)計學差異(P<0.05);與上調miR-34a組相比,下調miR-34a組AMPK表達上升,mTOR表達降低,具有統(tǒng)計學差異(P<0.05)。

表3 各組胰腺系數(shù)、FINS、HOMA-IR、AMPK/mTOR信號通路相對蛋白表達量對比

圖2 各組AMPK/mTOR信號通路蛋白表達

3 討 論

NAFLD發(fā)病屬于一種多因素進行相互作用的過程,其機制可能為胰島素抵抗引起的肝臟TG積聚或脂肪變,肝細胞敏感性增高,能量代謝失衡,促進NAFLD的發(fā)生進展〔7～10〕。

研究指出〔11〕,NAFLD的發(fā)生與脂質代謝、炎癥反應高度相關。肝臟是脂質代謝的主要場所,脂質異常合成或分解時,沉積于肝細胞,進而導致NAFLD發(fā)生。研究顯示〔12〕,通過構建NAFLD小鼠模型,檢測小鼠肝組織中miR-34a的表達情況,結果顯示,NAFLD小鼠肝組織中miR-34a表達異常上調。另有研究指出〔13〕,通過抑制miR-34a表達,肝細胞中脂滴沉積顯著減少。上述研究提示,在NAFLD肝組織中miR-34a表達異常上升,抑制miR-34a表達可延緩疾病進展。本文研究結果顯示,下調miR-34a后可干預NAFLD大鼠病情的發(fā)展,HE染色指出高脂飲食可引起大鼠脂肪肝病變,經下調miR-34a干預后,脂肪病變得到緩解。有研究指出〔14〕,高脂飲食患者攝入較多的脂肪,易引起血漿中脂肪酸上升,導致胰島素抵抗,血液中TG、LDL-C等會發(fā)生異常升高,進而脂質代謝發(fā)生紊亂。肝臟累積大量脂肪后,脂質發(fā)生過氧化,肝細胞凋亡,進展為肝纖維化等疾病,嚴重可致肝硬化或肝癌〔15,16〕。本研究結果表明,下調miR-34a能調控血脂紊亂,進而改善胰島素抵抗。

AMPK為細胞能量代謝的重要因子,在NAFLD的發(fā)生發(fā)展中占據較為重要地位,活化AMPK進行合成代謝的抑制,促進分解代謝,進而使脂質沉積程度得到降低〔17〕。mTOR相關的信號通路與自噬高度相關,在自噬的發(fā)生進展發(fā)揮較為重要的作用〔18〕。當磷酸水平上升時,AMPK可抑制mTOR水平,進而加強自噬水平〔19〕。自噬與NAFLD關系密切,脂滴可轉移至溶酶體,形成自噬溶酶體,降解呈游離脂肪酸,因此,自噬激活可進一步加強脂滴降解,進而達到改善NAFLD的目的〔20〕。研究顯示,NAFLD狀態(tài)下,自噬水平較低,體內自噬水平與代謝水平紊亂相關,當機體自噬水平打破,肝臟脂質沉積進一步加重。而miR-34a與脂質代謝水平高度相關。本研究結果推測,AMPK/mTOR信號通路活性的變化參與NAFLD的疾病進程,通過慢病毒沉默miR-34a,可抑制AMPK、mTOR磷酸化的異常變化,miR-34a可能調控AMPK/mTOR的活性變化。

綜上,NAFLD發(fā)生后,伴隨脂質代謝紊亂、肝功能異常等情況,經下調miR-34a干預后,可較好的改善上述情況,延緩疾病進展,其作用機制可能與調控AMPK/mTOR通路有關。