唐國(guó)玲 黃山鷹 劉剴 胡海燕 曾薇薇 蘇圣梅 閻愷

(南方醫(yī)科大學(xué)附屬深圳婦幼保健院婦科,廣東 深圳 518000)

卵巢癌發(fā)病初期無特異性癥狀,約2/3的患者就診時(shí)已達(dá)到國(guó)際婦產(chǎn)科聯(lián)盟(FIGO)分期Ⅲ～Ⅳ期,手術(shù)治療效果不佳,需要聯(lián)合術(shù)后化療,對(duì)順鉑、紫杉醇等化療藥物耐藥性增加時(shí)不良預(yù)后的主要原因之一〔1〕。程序性細(xì)胞死亡蛋白(PD)-1與其配體結(jié)合后能夠抑制T細(xì)胞活性,誘發(fā)腫瘤免疫逃逸〔2〕;PD-1抗體能夠降低PD-1活性,提高免疫細(xì)胞的抗腫瘤作用;但由于PD-1抗體的組織穿透性較差,難以達(dá)到腫瘤病灶處,降低了其療效〔3〕。溶瘤病毒具有抗癌作用的同時(shí)還能夠增強(qiáng)活化T細(xì)胞浸潤(rùn),與抗PD-1抗體結(jié)合后可提高其組織穿透性,增強(qiáng)抗腫瘤作用〔4〕。本研究探討PD-1溶瘤病毒對(duì)卵巢癌的抗腫瘤活性。

1 材料與方法

1.1動(dòng)物與主要試劑 SPF級(jí)雄性C57BL/6J小鼠,體質(zhì)量(20±2)g,購(gòu)于上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心,許可證號(hào):SYXK(滬)2023-0007。人卵巢癌SKOV-3細(xì)胞株購(gòu)于上海昆盟生物科技有限公司。PD-1、溶瘤單純皰疹病毒(oHSV)購(gòu)買以及PD-1溶瘤病毒構(gòu)建由上海和元生物技術(shù)有限公司完成。DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基、胎牛血清購(gòu)于青島捷世康生物科技有限公司;淋巴細(xì)胞分離液、PE標(biāo)記小鼠抗人CD4單克隆抗體、PE標(biāo)記小鼠抗人CD8單克隆抗體均購(gòu)于天津梅德生物科技有限公司;酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒〔白細(xì)胞介素(IL)-2、IL-10、干擾素(IFN)-γ〕均購(gòu)于仁捷(上海)生物科技有限公司;免疫組化(SP)檢測(cè)試劑盒(P53、Ki67)購(gòu)于北京拜爾迪生物技術(shù)有限公司。

1.2造模及PD-1溶瘤病毒最佳滴度篩選 復(fù)蘇人卵巢癌SKOV-3細(xì)胞株后使用含胎牛血清的DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基培養(yǎng)、傳代,調(diào)整細(xì)胞密度為1×107/ml,向小鼠右前腋下注射0.2 ml細(xì)胞懸液,繼續(xù)培養(yǎng)14 d后篩選出現(xiàn)移植瘤的小鼠進(jìn)行后續(xù)研究。為篩選PD-1溶瘤病毒最佳滴度,分別將滴度為5×105、1×106、5×106、1×107、5×107、1×108的PD-1溶瘤病毒注射入卵巢癌腫瘤內(nèi)部,每個(gè)滴度5只小鼠,同時(shí)設(shè)置5只小鼠為空白對(duì)照。每2 d注射1次,注射3次,末次注射結(jié)束后繼續(xù)培養(yǎng)7 d,測(cè)量腫瘤長(zhǎng)徑、短徑,計(jì)算卵巢癌腫瘤體積。

1.3分組與腫瘤體積測(cè)量 取卵巢癌造模成功的小鼠64只,隨機(jī)分為模型組(靜脈注射等量生理鹽水),PD-1抗體組(靜脈注射PD-1單克隆抗體,200 μg),單獨(dú)溶瘤病毒組(瘤內(nèi)注射oHSV病毒,滴度5×107),PD-1溶瘤病毒組(瘤內(nèi)注射PD-1溶瘤病毒,PD-1溶瘤病毒),每組16只。同時(shí)設(shè)置對(duì)照組(正常喂養(yǎng)的小鼠,靜脈注射等量生理鹽水)16只。每2 d注射1次,注射3次,末次注射結(jié)束后繼續(xù)培養(yǎng)7 d,測(cè)量腫瘤長(zhǎng)徑、短徑,計(jì)算卵巢癌腫瘤體積。

1.4標(biāo)本采集與處理 測(cè)量完腫瘤長(zhǎng)徑、短徑后麻醉小鼠并稱重,腹主動(dòng)脈取血后處死小鼠,剪下腫瘤組織并稱重,記錄腫瘤質(zhì)量;取出脾臟、胸腺并稱重,計(jì)算脾指數(shù)、胸腺指數(shù)。將收集的部分血液標(biāo)本離心處理,-80 ℃保存待測(cè);另外一部分血液標(biāo)本放于適量的紅細(xì)胞裂解液中,得到外周血T淋巴細(xì)胞,磷酸緩沖液重懸、混合均勻后計(jì)數(shù)備用。將腫瘤組織常規(guī)制成石蠟切片,用于免疫組化檢測(cè)。

1.5各組小鼠T淋巴細(xì)胞亞群檢測(cè) 取各組小鼠的外周血T淋巴細(xì)胞約1×107個(gè),配制成500 μl的細(xì)胞懸液,分別加入PE標(biāo)記小鼠抗人CD4單克隆抗體、PE標(biāo)記小鼠抗人CD8單克隆抗體后混合均勻,避光靜置30 min,離心后棄去沉淀,磷酸緩沖液重懸后上流式細(xì)胞儀檢測(cè)T淋巴細(xì)胞亞群,記錄CD4+、CD8+比例,計(jì)算CD4+/CD8+比值。

1.6各組小鼠血清IL-2、IL-10、IFN-γ濃度檢測(cè) 取各組小鼠-80 ℃保存的血清樣本,復(fù)溫后吸出0.3 ml,按試劑盒說明書中的步驟,酶聯(lián)免疫吸附法測(cè)定血清IL-2、IL-10、IFN-γ濃度。

1.7SP法檢測(cè)各組小鼠P53、Ki67表達(dá)檢測(cè) 取腫瘤組織石蠟切片,烤片30 min,二甲苯浸泡后梯度濃度的酒精脫水,過氧化氫去除內(nèi)源性過氧化物酶活性,修復(fù)抗原后封閉非特異性抗原;滴加一抗:鼠抗人P53單克隆抗體(1∶1 000倍稀釋),鼠抗人Ki67單克隆抗體(1∶500倍稀釋),鼠抗人β-actin單克隆抗體(1∶4 000倍稀釋),室溫下孵育1 h,滴加辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的山羊抗屬IgG(1∶4 000倍稀釋),顯色、復(fù)染、脫水、透明后封片。顯微鏡下隨機(jī)計(jì)數(shù)200個(gè)細(xì)胞,計(jì)算陽性細(xì)胞比例,根據(jù)陽性細(xì)胞比例和染色強(qiáng)度進(jìn)行評(píng)分,使用兩者的乘積判定結(jié)果,陰性(0分)、弱陽性(1～2分)、中等陽性(3～4分)、強(qiáng)陽性(>4分),將中等陽性和強(qiáng)陽性記為陽性。

1.8統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS25.0軟件進(jìn)行χ2檢驗(yàn)、方差分析,組間兩兩比較進(jìn)行LSD-t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1不同滴度PD-1溶瘤病毒對(duì)腫瘤體積的影響 PD-1溶瘤病毒滴度0、5×105、1×106、5×106、1×107、5×107、1×108時(shí)腫瘤體積依次為(308.51±12.80)、(269.83±15.65)、(236.24±11.97)、(213.69±9.41)、(189.47±8.29)、(173.59±7.85)、(171.06±8.53)mm3。不同PD-1溶瘤病毒滴度的卵巢癌小鼠之間腫瘤體積比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=30.958,P=0.000);隨著PD-1溶瘤病毒滴度的升高腫瘤體積逐漸降低。當(dāng)PD-1溶瘤病毒滴度達(dá)到5×107時(shí)卵巢癌小鼠腫瘤體積不再明顯降低,與1×108時(shí)腫瘤體積之間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),因此后續(xù)實(shí)驗(yàn)以PD-1溶瘤病毒滴度5×107處理卵巢癌小鼠。

2.2各組腫瘤體積、腫瘤質(zhì)量比較 各組腫瘤體積、腫瘤質(zhì)量比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001);模型組腫瘤體積、腫瘤質(zhì)量明顯高于對(duì)照組(P<0.05),PD-1抗體組、單獨(dú)溶瘤病毒組、PD-1溶瘤病毒組腫瘤體積、腫瘤質(zhì)量明顯低于模型組,PD-1溶瘤病毒組腫瘤體積、腫瘤質(zhì)量明顯低于PD-1抗體組、單獨(dú)溶瘤病毒組(均P<0.05)。見表1。

2.3各組脾臟指數(shù)、胸腺指數(shù)水平比較 各組脾臟指數(shù)、胸腺指數(shù)比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);模型組脾臟指數(shù)、胸腺指數(shù)明顯低于對(duì)照組(P<0.05);PD-1抗體組、單獨(dú)溶瘤病毒組、PD-1溶瘤病毒組脾臟指數(shù)、胸腺指數(shù)明顯高于模型組,PD-1溶瘤病毒組脾臟指數(shù)、胸腺指數(shù)明顯高于PD-1抗體組、單獨(dú)溶瘤病毒組(P<0.05)。見表1。

2.4各組T淋巴細(xì)胞亞群比較 各組CD4+、CD8+、CD4+/CD8+比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);模型組CD4+、CD4+/CD8+明顯低于對(duì)照組,CD8+明顯高于對(duì)照組(P<0.05);PD-1抗體組、單獨(dú)溶瘤病毒組、PD-1溶瘤病毒組CD4+、CD4+/CD8+明顯高于模型組,CD8+明顯低于模型組(P<0.05);PD-1溶瘤病毒組CD4+、CD4+/CD8+明顯高于PD-1抗體組、單獨(dú)溶瘤病毒組,CD8+明顯低于PD-1抗體組、單獨(dú)溶瘤病毒組(P<0.05)。見表1。

表1 各組腫瘤體積、腫瘤質(zhì)量、脾臟指數(shù)、胸腺指數(shù)水平、T細(xì)胞浸潤(rùn)水平比較(n=16)

2.5各組血清IL-2、IL-10、IFN-γ水平比較 各組血清IL-2、IL-10、IFN-γ比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);模型組血清IL-2、IFN-γ明顯低于對(duì)照組,IL-10明顯高于對(duì)照組(P<0.05);PD-1抗體組、單獨(dú)溶瘤病毒組、PD-1溶瘤病毒組血清IL-2、IFN-γ明顯高于模型組,IL-10明顯低于模型組;PD-1溶瘤病毒組血清IL-2、IFN-γ明顯高于PD-1抗體組、單獨(dú)溶瘤病毒組,IL-10明顯低于PD-1抗體組、單獨(dú)溶瘤病毒組(P<0.05)。見表2。

2.6各組P53、Ki67陽性表達(dá)比較 各組P53、Ki67陽性率比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);模型組P53、Ki67陽性率明顯高于對(duì)照組(P<0.05);PD-1抗體組、單獨(dú)溶瘤病毒組、PD-1溶瘤病毒組P53、Ki67陽性率明顯低于模型組;PD-1溶瘤病毒組P53、Ki67陽性率明顯低于PD-1抗體組、單獨(dú)溶瘤病毒組(P<0.05)。見表2。

表2 各組血清IL-2、IL-10、IFN-γ水平、P53、Ki67陽性表達(dá)比較

3 討 論

卵巢癌發(fā)病早期癥狀隱匿,診斷難度高,導(dǎo)致患者無法得到及時(shí)治療、致死率高。相關(guān)研究顯示,無盆腔淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的卵巢癌患者5年生存率在40%左右,當(dāng)出現(xiàn)盆腔淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移后患者的5年生存率下降至10%左右〔5〕。手術(shù)難以根治卵巢癌是患者不良預(yù)后的主要原因之一,需要聯(lián)合術(shù)后化療(順鉑、紫杉醇等),但耐藥性發(fā)生率高,還可能引發(fā)外周免疫系統(tǒng)功能抑制〔6〕;因此,探尋新的治療手段對(duì)延長(zhǎng)患者的生存時(shí)間具有重要意義。本研究結(jié)果提示,PD-1抗體、單獨(dú)溶瘤病毒、PD-1溶瘤病毒干預(yù)均能夠控制卵巢癌小鼠病情進(jìn)展,其中PD-1溶瘤病毒效果最明顯。

脾臟和胸腺在腫瘤免疫治療中發(fā)揮重要作用,脾臟指數(shù)、胸腺指數(shù)減小會(huì)導(dǎo)致外周血白細(xì)胞比例下降、免疫功能減退,抗腫瘤活性降低〔7,8〕。T淋巴細(xì)胞主要包括CD4+、CD8+,在腫瘤免疫微環(huán)境中發(fā)揮抗腫瘤作用〔9〕。激活T淋巴細(xì)胞能夠殺滅腫瘤相關(guān)的自身抗原,但多數(shù)惡性腫瘤患者無法自發(fā)激活抗原特異性T淋巴細(xì)胞〔10〕。IL-2與IFN-γ具有免疫效應(yīng)細(xì)胞活性,能夠提高人體的免疫功能,與免疫治療效果密切相關(guān)〔11〕。IL-10具有免疫抑制作用,其高表達(dá)會(huì)降低腫瘤免疫治療效果〔12〕。PD-1是免疫負(fù)調(diào)控因子,能夠抑制免疫系統(tǒng)功能,降低免疫細(xì)胞對(duì)腫瘤的殺傷活性〔13〕?？筆D-1抗體能夠抑制PD-1活性,提高免疫細(xì)胞的抗腫瘤作用。但單克隆PD-1抗體組織穿透力較弱,難以到達(dá)腫瘤病灶;溶瘤病毒組織穿透力強(qiáng),在具有抗腫瘤活性的同時(shí)還可作為載體工具〔14〕。本研究中通過構(gòu)建PD-1溶瘤病毒,明顯提高了對(duì)卵巢癌的免疫調(diào)節(jié)作用,增強(qiáng)特異性抗腫瘤免疫細(xì)胞的殺傷能力,提高療效。

P53基因是與人體腫瘤相關(guān)性最高的基因,引發(fā)腫瘤形成和惡性轉(zhuǎn)化的P53蛋白是P53基因突變的產(chǎn)物,發(fā)揮腫瘤促進(jìn)作用,會(huì)抵消野生型P53基因的抑癌作用〔15〕。相關(guān)研究顯示,50%以上高惡性程度的漿液性卵巢癌組織中存在P53突變〔16〕。Ki67陽性表達(dá)于細(xì)胞核中,與核糖體轉(zhuǎn)錄相關(guān),是評(píng)估腫瘤細(xì)胞活性的指標(biāo)〔17〕。研究顯示,Ki67代表有絲分裂指數(shù),在G0靜息期外的循環(huán)細(xì)胞中均有表達(dá),腫瘤細(xì)胞增殖活性的提升說明惡性程度的增加〔18〕。本研究結(jié)果提示,PD-1溶瘤病毒可通過下調(diào)P53、Ki67表達(dá)來抑制卵巢癌的發(fā)展,且相比于單獨(dú)PD-1抗體、溶瘤病毒作用更強(qiáng)。