張建成 李萍 胡海慈 呂自新 陳文生

(1南陽市第一人民醫(yī)院眼科,河南 南陽 473000;2南陽市第二人民醫(yī)院眼科)

白內(nèi)障是導(dǎo)致失明的眼部疾病重要原因之一,其發(fā)病率與年齡密切相關(guān),伴隨年齡增長,其發(fā)病率呈上升態(tài)勢〔1〕。目前,有關(guān)白內(nèi)障治療方法主要是通過手術(shù)摘除晶狀體后采用人工晶狀體替換,但是此方法容易導(dǎo)致角膜水腫和高眼壓等副作用〔2〕。因此,積極尋找白內(nèi)障有效的治療方案及藥物對于改善白內(nèi)障患者臨床癥狀具有重大意義。

白內(nèi)障的主要病因與晶狀體氧化應(yīng)激〔3〕、炎癥損傷〔4〕及細胞死亡〔5〕等相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn),鐵死亡參與白內(nèi)障的形成。鐵死亡是一種鐵依賴性細胞程序性細胞死亡方式,是以細胞內(nèi)鐵離子穩(wěn)態(tài)被打破,進而導(dǎo)致活性氧及脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物增多,從而損害細胞內(nèi)生物大分子,導(dǎo)致細胞死亡〔6〕。谷胱甘肽過氧物化酶(GPX)4是細胞內(nèi)脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的關(guān)鍵調(diào)節(jié)酶,GPX4表達降低會誘發(fā)活性氧產(chǎn)生增多,導(dǎo)致細胞脂質(zhì)過氧化損傷,引起細胞鐵死亡發(fā)生〔7〕。既往多項研究發(fā)現(xiàn),白內(nèi)障發(fā)病過程中晶狀體上皮細胞中GPX4蛋白表達水平顯著降低,細胞內(nèi)氧化應(yīng)激水平顯著增加,且白內(nèi)障患者鐵過載可導(dǎo)致白內(nèi)障形成加快〔8,9〕。因此闡明鐵死亡與晶狀體損傷的關(guān)系可以為白內(nèi)障預(yù)防提供新的思路。橘皮素(TAN)是柑橘類果皮中最豐富的多甲氧基黃酮之一,具有廣泛的藥理活性。多項研究表明,TAN具有抗炎、抗氧化、調(diào)節(jié)代謝及神經(jīng)保護等藥理作用〔10,11〕。但有關(guān)TAN對白內(nèi)障形成的影響尚不清楚。本研究基于鐵死亡機制探究TAN對D-半乳糖誘導(dǎo)白內(nèi)障模型大鼠晶狀體的保護作用。

1 材料與方法

1.1動物 雄性SPF級Wistar大鼠60只,周齡6～8 w,平均體質(zhì)量(200±10)g,購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司〔SCXK(京)2020-0015〕,飼養(yǎng)于環(huán)境溫度24～26 ℃,相對濕度(60±5)%,12 h晝夜交替光照。本實驗經(jīng)過醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會審批(審查號:2021LLSC0003)。

1.2試劑 TAN(化合物純度≥99.7%,Target Molecule公司);D-半乳糖(純度≥99%,浙江一新制藥股份有限公司);鐵死亡抑制劑(Ferrostatin-1,Med Chem Express公司,貨號:HY-100579/CS-0019733);戊巴比妥鈉(德國Merck公司,貨號:4390-16-3);Fe2+檢測試劑盒(北京索萊寶科技有限公司,批號:20220014);超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)、丙二醛(MDA)檢測試劑盒(南京建成生物工程研究所,貨號:A001-3-2、A005-1-2、A003-1-2);轉(zhuǎn)鐵蛋白受體(TFR)1一抗、溶質(zhì)載體家族7成員(SLC7A)11、GPX4一抗(碧云天生物技術(shù),貨號:AF8136、AF7992、AF7020)。

1.3儀器 裂隙燈顯微鏡(上海涵飛醫(yī)療器械有限公司,型號:YZ5G);酶標儀(山東萊恩德智能科技有限公司,型號:LD-96A);離心機(湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司,型號:H-2050R-1);凝膠成像系統(tǒng)(美國Bio-Rad公司,型號:Gel dox XR+);熒光倒置顯微鏡(日本/奧林巴斯Olympus,型號:CKX53)。

1.4白內(nèi)障模型大鼠構(gòu)建、分組及給藥 依據(jù)參考文獻〔1〕復(fù)制D-半乳糖誘導(dǎo)的白內(nèi)障大鼠模型。50只Wistar大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1 w,隨機選取40只大鼠于皮下注射D-半乳糖(200 mg/kg),1次/d。另取10只大鼠為對照(control)組,給予等量生理鹽水,其余操作相同。4 w后,在裂隙燈照射下觀察大鼠晶狀體渾濁程度,若晶狀體出現(xiàn)渾濁則判定模型構(gòu)建成功。將模型成功大鼠隨機分為模型(model)組、TAN低劑量(TAN-L)組、TAN高劑量(TAN-H)組及鐵死亡抑制劑(Ferrostatin-1)組各10只。TAN-L、H組分別以5、20 mg/kg的TAN灌胃給藥〔12〕,1次/d。Ferrostatin-1組腹腔注射2 mg/kg Ferrostatin-1〔13〕,1次/d。Control組和model組腹腔注射等量生理鹽水,1次/d。以上各組均連續(xù)給藥4 w。

1.5白內(nèi)障形成評估 給藥干預(yù)4 w后,1%的戊巴比妥鈉麻醉大鼠,采用0.5%托吡卡胺和2.5%鹽酸去氧腎上腺素混合滴眼液加入各組大鼠眼球進行散瞳,觀察白內(nèi)障形成及晶狀體渾濁程度。

1.6組織病理學(xué)染色 將各組左眼晶狀體組織磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗后放置于4%的多聚甲醛溶液中固定,經(jīng)梯度乙醇脫水、石蠟包埋、切片(厚度約3 μm),之后進行蘇木素-伊紅(HE)染色觀察組織病理學(xué)變化。

1.7晶狀體渾濁程度評估 實驗結(jié)束后,1%的戊巴比妥鈉麻醉大鼠,采用0.5%托吡卡胺和2.5%鹽酸去氧腎上腺素混合滴眼液加入各組眼球進行散瞳,裂隙燈顯微鏡下觀察晶狀體渾濁程度。渾濁程度等級:0、1、2、3、4,等級越高表示晶狀體渾濁程度越高。

1.8可溶性、不可溶性蛋白含量測定 依據(jù)參考文獻〔14〕檢測方法,采用蛋白質(zhì)檢測試劑盒對各組晶狀體中可溶性蛋白和不可溶性蛋白含量進行測定。

1.9Fe2+、MDA含量及SOD、GSH-Px活性測定 依據(jù)檢測試劑盒說明書,分別對各組大鼠晶狀體中Fe2+、MDA含量及SOD、GSH-Px活性進行測定。

1.10Western印跡檢測晶狀體中TFR1、SLC7A11和GPX4蛋白表達 將晶狀體組織勻漿裂解,離心后得到上清液,測定蛋白質(zhì)濃度。之后按照每組蛋白上樣量為30 μg,計算各自的上樣體積;凝膠電泳約120 min,之后進行濕轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)膜將目的蛋白從凝膠上轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜上,5%的脫脂牛奶進行封閉非特異性抗體,洗膜,每次3 min,共5次;4 ℃條件下,孵育對應(yīng)一抗抗體(TFR1、SLC7A11、GPX4、β-actin,稀釋比例為1∶1 000)16 h;磷酸鹽緩沖溶液洗滌PVDF膜3次,每次5 min;室溫條件下,孵育一抗抗體對應(yīng)的二抗1 h;去除二抗,滴加顯影液顯影,最后對顯影照片采用Image Pro Plus6.0軟件進行蛋白相對表達定量。

1.11統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS22.0軟件進行方差分析、t檢驗。

2 結(jié) 果

2.1TAN對白內(nèi)障大鼠形成的形態(tài)學(xué)影響 control組晶狀體結(jié)構(gòu)清晰,清澈透明;model組晶狀體出現(xiàn)典型的白內(nèi)障,且晶狀體渾濁程度等級顯著增加,透明度明顯降低。與model組相比,TAN-L、TAN-H、Ferrostatin-1組白內(nèi)障嚴重程度明顯減輕,且晶狀體渾濁程度等級降低,透明度明顯增加。與TAN-L組相比,TAN-H組白內(nèi)障改善程度更為顯著。見圖1。

圖1 TAN對D-半乳糖誘導(dǎo)大鼠白內(nèi)障形成的影響

2.2TAN對白內(nèi)障大鼠晶狀體組織病理學(xué)的影響 control組晶狀體組織結(jié)構(gòu)完整,上皮細胞排列有序,無空泡。model組晶狀體組織結(jié)構(gòu)損壞嚴重,上皮細胞數(shù)目明顯減少,排列紊亂,且晶狀體后極出現(xiàn)大量空泡。與model組相比,TAN-L、TAN-H、Ferrostatin-1組晶狀體病理性損傷得到明顯改善,僅TAN-L組晶狀體纖維化有輕微腫脹。與TAN-L組相比,TAN-H組晶狀體組織損傷程度進一步減輕。見圖2。

圖2 各組晶狀體組織病理學(xué)(HE染色,×200)

2.3TAN對白內(nèi)障大鼠晶狀體組織渾濁程度的影響 與control組相比,model組晶狀體渾濁程度明顯增加(P<0.05)。與model組相比,TAN-L、TAN-H和Ferrostatin-1組晶狀體渾濁程度均明顯降低(P<0.05)。與TAN-L組相比,TAN-H組晶狀體渾濁程度明顯降低(P<0.05)。見表1。

2.4TAN對白內(nèi)障大鼠晶狀體可溶性和不可溶性蛋白含量的影響 與control組相比,model組晶狀體不可溶性蛋白含量明顯增加,可溶性蛋白含量明顯降低(P<0.05)。與model組相比,TAN-L、TAN-H和Ferrostatin-1組晶狀體不可溶性蛋白含量明顯降低,可溶性蛋白含量明顯增加(P<0.05)。與TAN-L組相比,TAN-H組晶狀體不可溶性蛋白含量明顯降低,可溶性蛋白含量明顯增加(P<0.05)。見表1。

表1 各組晶狀體渾濁程度及可溶性、不可溶性蛋白含量比較

2.5TAN對白內(nèi)障大鼠氧化應(yīng)激及Fe2+水平的影響 與control組相比,model組Fe2+、MDA水平明顯升高,SOD、GSH-Px活性明顯降低(P<0.05)。與model組相比,各干預(yù)組Fe2+、MDA水平明顯降低,SOD、GSH-Px活性明顯增強(P<0.05)。與TAN-L組相比,TAN-H組上述指標明顯改善(P<0.05)。見表2。

2.6TAN對白內(nèi)障大鼠提死亡相關(guān)蛋白表達的影響 與control組相比,model組TFR1蛋白表達明顯升高,SLC7A11、GPX4蛋白表達明顯降低(P<0.05)。與model組相比,各干預(yù)組TFR1蛋白表達明顯降低,SLC7A11、GPX4蛋白表達明顯升高(P<0.05)。與TAN-L組相比,TAN-H組上述蛋白表達明顯改善(P<0.05)。見表2、圖3。

表2 各組晶狀體中Fe2+、MDA含量和SOD、GSH-Px活性及TFR1、SLC7A11、GPX4蛋白相對表達比較

1～5:control組、model組、TAN-L組、TAN-H組、Ferrostatin-1組

3 討 論

白內(nèi)障是誘發(fā)失明的主要原因之一,與晶狀體的氧化應(yīng)激性損傷相關(guān),主要表現(xiàn)為晶狀體渾濁、視力障礙及光散射等。研究發(fā)現(xiàn),全球范圍內(nèi)大約40%的失明患者是由白內(nèi)障引起,且多發(fā)于老年人群,而氧化應(yīng)激狀態(tài)是導(dǎo)致白內(nèi)障患者晶狀體嚴重受損的重要機制〔15〕。因此,深入探究白內(nèi)障晶狀體損傷的病變機制并對其防治具有重要意義。本研究表明,白內(nèi)障大鼠模型構(gòu)建成功。TAN是從果實橘皮中提取得到的一種天然活性單體化合物,具有廣泛的藥理學(xué)作用〔16〕。

鐵死亡是白內(nèi)障晶狀體損傷的新機制,主要是由于細胞內(nèi)抗氧化系統(tǒng)的失衡,導(dǎo)致谷胱甘肽(GSH)合成不足及GPX4失活引發(fā)細胞脂質(zhì)過氧化物代謝受阻〔17〕。在此基礎(chǔ)上,細胞內(nèi)不穩(wěn)定鐵池儲存的大量Fe2+會釋放至細胞內(nèi),并通過芬頓(Fenton)反應(yīng)產(chǎn)生大量活性氧,促進脂質(zhì)過氧化物產(chǎn)生增多,最終細胞膜機構(gòu)改變,誘發(fā)細胞死亡〔18〕。本研究結(jié)果表明,TAN能夠通過降低Fe2+水平,改善白內(nèi)障大鼠晶狀體損傷。鐵死亡也被認為是一種氧化應(yīng)激性損傷,MDA是紙質(zhì)過氧化產(chǎn)物,氧化應(yīng)激后受自由基影響而顯著升高,其含量高低是反映細胞氧化應(yīng)激損傷的關(guān)鍵指標〔19〕。SOD、GSH-Px是抗氧化性損傷關(guān)鍵調(diào)節(jié)酶〔20〕。既往研究證實,TFR1、SLC7A11和GPX4被認為是細胞鐵死亡的關(guān)鍵調(diào)控蛋白。TFR1能夠通過將細胞外Fe2+轉(zhuǎn)運至細胞內(nèi),導(dǎo)致細胞鐵超載,進而誘發(fā)Fenton反應(yīng),導(dǎo)致細胞發(fā)生脂質(zhì)過氧化反應(yīng),誘導(dǎo)細胞死亡〔21〕。SLC7A11通過介導(dǎo)胱氨酸/谷氨酸轉(zhuǎn)運系統(tǒng)合成GSH所需胱氨酸,而抑制SLC7A11表達后會顯著抑制GSH生物合成,進而導(dǎo)致GPX4蛋白表達下調(diào),抗氧化能力減低,并最終導(dǎo)致鐵死亡發(fā)生〔22〕。多項研究已證實,鐵死亡參與白內(nèi)障形成,被認為是晶狀體損傷的重要病理機制〔23,24〕。本研究結(jié)果表明,TAN能夠通過抑制細胞鐵死亡,進而減輕白內(nèi)障大鼠晶狀體損傷。Liu等〔25〕研究發(fā)現(xiàn),脂多糖能夠誘導(dǎo)人支氣管上皮細胞鐵死亡,給予鐵死亡抑制劑Ferrostatin-1處理后能夠逆轉(zhuǎn)脂多糖誘導(dǎo)的人支氣管上皮細胞鐵死亡。本研究結(jié)果表明,鐵死亡抑制劑Ferrostatin-1能夠抑制白內(nèi)障大鼠上述指標變化,改善晶狀體損傷,從而發(fā)揮與TAN同向的保護效應(yīng)。

綜上,TAN能夠改善白內(nèi)障大鼠模型晶狀體損傷,其機制與抑制細胞鐵死亡相關(guān)。但本研究也存在一定的局限性,未在細胞層面上揭示TAN對晶狀體損傷的影響。后續(xù)將通過體外培養(yǎng)晶狀體上皮細胞,揭示TAN對氧化應(yīng)激誘導(dǎo)晶狀體上皮細胞鐵死亡的影響。