張建成 李萍 胡海慈 呂自新 陳文生

(1南陽市第一人民醫(yī)院眼科,河南 南陽 473000;2南陽市第二人民醫(yī)院眼科)

白內(nèi)障是導(dǎo)致失明的眼部疾病重要原因之一,其發(fā)病率與年齡密切相關(guān),伴隨年齡增長,其發(fā)病率呈上升態(tài)勢〔1〕。目前,有關(guān)白內(nèi)障治療方法主要是通過手術(shù)摘除晶狀體后采用人工晶狀體替換,但是此方法容易導(dǎo)致角膜水腫和高眼壓等副作用〔2〕。因此,積極尋找白內(nèi)障有效的治療方案及藥物對于改善白內(nèi)障患者臨床癥狀具有重大意義。

白內(nèi)障的主要病因與晶狀體氧化應(yīng)激〔3〕、炎癥損傷〔4〕及細(xì)胞死亡〔5〕等相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn),鐵死亡參與白內(nèi)障的形成。鐵死亡是一種鐵依賴性細(xì)胞程序性細(xì)胞死亡方式,是以細(xì)胞內(nèi)鐵離子穩(wěn)態(tài)被打破,進(jìn)而導(dǎo)致活性氧及脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物增多,從而損害細(xì)胞內(nèi)生物大分子,導(dǎo)致細(xì)胞死亡〔6〕。谷胱甘肽過氧物化酶(GPX)4是細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的關(guān)鍵調(diào)節(jié)酶,GPX4表達(dá)降低會誘發(fā)活性氧產(chǎn)生增多,導(dǎo)致細(xì)胞脂質(zhì)過氧化損傷,引起細(xì)胞鐵死亡發(fā)生〔7〕。既往多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn),白內(nèi)障發(fā)病過程中晶狀體上皮細(xì)胞中GPX4蛋白表達(dá)水平顯著降低,細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激水平顯著增加,且白內(nèi)障患者鐵過載可導(dǎo)致白內(nèi)障形成加快〔8,9〕。因此闡明鐵死亡與晶狀體損傷的關(guān)系可以為白內(nèi)障預(yù)防提供新的思路。橘皮素(TAN)是柑橘類果皮中最豐富的多甲氧基黃酮之一,具有廣泛的藥理活性。多項(xiàng)研究表明,TAN具有抗炎、抗氧化、調(diào)節(jié)代謝及神經(jīng)保護(hù)等藥理作用〔10,11〕。但有關(guān)TAN對白內(nèi)障形成的影響尚不清楚。本研究基于鐵死亡機(jī)制探究TAN對D-半乳糖誘導(dǎo)白內(nèi)障模型大鼠晶狀體的保護(hù)作用。

1 材料與方法

1.1動物 雄性SPF級Wistar大鼠60只,周齡6～8 w,平均體質(zhì)量(200±10)g,購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司〔SCXK(京)2020-0015〕,飼養(yǎng)于環(huán)境溫度24～26 ℃,相對濕度(60±5)%,12 h晝夜交替光照。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)過醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會審批(審查號:2021LLSC0003)。

1.2試劑 TAN(化合物純度≥99.7%,Target Molecule公司);D-半乳糖(純度≥99%,浙江一新制藥股份有限公司);鐵死亡抑制劑(Ferrostatin-1,Med Chem Express公司,貨號:HY-100579/CS-0019733);戊巴比妥鈉(德國Merck公司,貨號:4390-16-3);Fe2+檢測試劑盒(北京索萊寶科技有限公司,批號:20220014);超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)、丙二醛(MDA)檢測試劑盒(南京建成生物工程研究所,貨號:A001-3-2、A005-1-2、A003-1-2);轉(zhuǎn)鐵蛋白受體(TFR)1一抗、溶質(zhì)載體家族7成員(SLC7A)11、GPX4一抗(碧云天生物技術(shù),貨號:AF8136、AF7992、AF7020)。

1.3儀器 裂隙燈顯微鏡(上海涵飛醫(yī)療器械有限公司,型號:YZ5G);酶標(biāo)儀(山東萊恩德智能科技有限公司,型號:LD-96A);離心機(jī)(湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司,型號:H-2050R-1);凝膠成像系統(tǒng)(美國Bio-Rad公司,型號:Gel dox XR+);熒光倒置顯微鏡(日本/奧林巴斯Olympus,型號:CKX53)。

1.4白內(nèi)障模型大鼠構(gòu)建、分組及給藥 依據(jù)參考文獻(xiàn)〔1〕復(fù)制D-半乳糖誘導(dǎo)的白內(nèi)障大鼠模型。50只Wistar大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1 w,隨機(jī)選取40只大鼠于皮下注射D-半乳糖(200 mg/kg),1次/d。另取10只大鼠為對照(control)組,給予等量生理鹽水,其余操作相同。4 w后,在裂隙燈照射下觀察大鼠晶狀體渾濁程度,若晶狀體出現(xiàn)渾濁則判定模型構(gòu)建成功。將模型成功大鼠隨機(jī)分為模型(model)組、TAN低劑量(TAN-L)組、TAN高劑量(TAN-H)組及鐵死亡抑制劑(Ferrostatin-1)組各10只。TAN-L、H組分別以5、20 mg/kg的TAN灌胃給藥〔12〕,1次/d。Ferrostatin-1組腹腔注射2 mg/kg Ferrostatin-1〔13〕,1次/d。Control組和model組腹腔注射等量生理鹽水,1次/d。以上各組均連續(xù)給藥4 w。

1.5白內(nèi)障形成評估 給藥干預(yù)4 w后,1%的戊巴比妥鈉麻醉大鼠,采用0.5%托吡卡胺和2.5%鹽酸去氧腎上腺素混合滴眼液加入各組大鼠眼球進(jìn)行散瞳,觀察白內(nèi)障形成及晶狀體渾濁程度。

1.6組織病理學(xué)染色 將各組左眼晶狀體組織磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗后放置于4%的多聚甲醛溶液中固定,經(jīng)梯度乙醇脫水、石蠟包埋、切片(厚度約3 μm),之后進(jìn)行蘇木素-伊紅(HE)染色觀察組織病理學(xué)變化。

1.7晶狀體渾濁程度評估 實(shí)驗(yàn)結(jié)束后,1%的戊巴比妥鈉麻醉大鼠,采用0.5%托吡卡胺和2.5%鹽酸去氧腎上腺素混合滴眼液加入各組眼球進(jìn)行散瞳,裂隙燈顯微鏡下觀察晶狀體渾濁程度。渾濁程度等級:0、1、2、3、4,等級越高表示晶狀體渾濁程度越高。

1.8可溶性、不可溶性蛋白含量測定 依據(jù)參考文獻(xiàn)〔14〕檢測方法,采用蛋白質(zhì)檢測試劑盒對各組晶狀體中可溶性蛋白和不可溶性蛋白含量進(jìn)行測定。

1.9Fe2+、MDA含量及SOD、GSH-Px活性測定 依據(jù)檢測試劑盒說明書,分別對各組大鼠晶狀體中Fe2+、MDA含量及SOD、GSH-Px活性進(jìn)行測定。

1.10Western印跡檢測晶狀體中TFR1、SLC7A11和GPX4蛋白表達(dá) 將晶狀體組織勻漿裂解,離心后得到上清液,測定蛋白質(zhì)濃度。之后按照每組蛋白上樣量為30 μg,計(jì)算各自的上樣體積;凝膠電泳約120 min,之后進(jìn)行濕轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)膜將目的蛋白從凝膠上轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜上,5%的脫脂牛奶進(jìn)行封閉非特異性抗體,洗膜,每次3 min,共5次;4 ℃條件下,孵育對應(yīng)一抗抗體(TFR1、SLC7A11、GPX4、β-actin,稀釋比例為1∶1 000)16 h;磷酸鹽緩沖溶液洗滌PVDF膜3次,每次5 min;室溫條件下,孵育一抗抗體對應(yīng)的二抗1 h;去除二抗,滴加顯影液顯影,最后對顯影照片采用Image Pro Plus6.0軟件進(jìn)行蛋白相對表達(dá)定量。

1.11統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS22.0軟件進(jìn)行方差分析、t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1TAN對白內(nèi)障大鼠形成的形態(tài)學(xué)影響 control組晶狀體結(jié)構(gòu)清晰,清澈透明;model組晶狀體出現(xiàn)典型的白內(nèi)障,且晶狀體渾濁程度等級顯著增加,透明度明顯降低。與model組相比,TAN-L、TAN-H、Ferrostatin-1組白內(nèi)障嚴(yán)重程度明顯減輕,且晶狀體渾濁程度等級降低,透明度明顯增加。與TAN-L組相比,TAN-H組白內(nèi)障改善程度更為顯著。見圖1。

圖1 TAN對D-半乳糖誘導(dǎo)大鼠白內(nèi)障形成的影響

2.2TAN對白內(nèi)障大鼠晶狀體組織病理學(xué)的影響 control組晶狀體組織結(jié)構(gòu)完整,上皮細(xì)胞排列有序,無空泡。model組晶狀體組織結(jié)構(gòu)損壞嚴(yán)重,上皮細(xì)胞數(shù)目明顯減少,排列紊亂,且晶狀體后極出現(xiàn)大量空泡。與model組相比,TAN-L、TAN-H、Ferrostatin-1組晶狀體病理性損傷得到明顯改善,僅TAN-L組晶狀體纖維化有輕微腫脹。與TAN-L組相比,TAN-H組晶狀體組織損傷程度進(jìn)一步減輕。見圖2。

圖2 各組晶狀體組織病理學(xué)(HE染色,×200)

2.3TAN對白內(nèi)障大鼠晶狀體組織渾濁程度的影響 與control組相比,model組晶狀體渾濁程度明顯增加(P<0.05)。與model組相比,TAN-L、TAN-H和Ferrostatin-1組晶狀體渾濁程度均明顯降低(P<0.05)。與TAN-L組相比,TAN-H組晶狀體渾濁程度明顯降低(P<0.05)。見表1。

2.4TAN對白內(nèi)障大鼠晶狀體可溶性和不可溶性蛋白含量的影響 與control組相比,model組晶狀體不可溶性蛋白含量明顯增加,可溶性蛋白含量明顯降低(P<0.05)。與model組相比,TAN-L、TAN-H和Ferrostatin-1組晶狀體不可溶性蛋白含量明顯降低,可溶性蛋白含量明顯增加(P<0.05)。與TAN-L組相比,TAN-H組晶狀體不可溶性蛋白含量明顯降低,可溶性蛋白含量明顯增加(P<0.05)。見表1。

表1 各組晶狀體渾濁程度及可溶性、不可溶性蛋白含量比較

2.5TAN對白內(nèi)障大鼠氧化應(yīng)激及Fe2+水平的影響 與control組相比,model組Fe2+、MDA水平明顯升高,SOD、GSH-Px活性明顯降低(P<0.05)。與model組相比,各干預(yù)組Fe2+、MDA水平明顯降低,SOD、GSH-Px活性明顯增強(qiáng)(P<0.05)。與TAN-L組相比,TAN-H組上述指標(biāo)明顯改善(P<0.05)。見表2。

2.6TAN對白內(nèi)障大鼠提死亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響 與control組相比,model組TFR1蛋白表達(dá)明顯升高,SLC7A11、GPX4蛋白表達(dá)明顯降低(P<0.05)。與model組相比,各干預(yù)組TFR1蛋白表達(dá)明顯降低,SLC7A11、GPX4蛋白表達(dá)明顯升高(P<0.05)。與TAN-L組相比,TAN-H組上述蛋白表達(dá)明顯改善(P<0.05)。見表2、圖3。

表2 各組晶狀體中Fe2+、MDA含量和SOD、GSH-Px活性及TFR1、SLC7A11、GPX4蛋白相對表達(dá)比較

1～5:control組、model組、TAN-L組、TAN-H組、Ferrostatin-1組

3 討 論

白內(nèi)障是誘發(fā)失明的主要原因之一,與晶狀體的氧化應(yīng)激性損傷相關(guān),主要表現(xiàn)為晶狀體渾濁、視力障礙及光散射等。研究發(fā)現(xiàn),全球范圍內(nèi)大約40%的失明患者是由白內(nèi)障引起,且多發(fā)于老年人群,而氧化應(yīng)激狀態(tài)是導(dǎo)致白內(nèi)障患者晶狀體嚴(yán)重受損的重要機(jī)制〔15〕。因此,深入探究白內(nèi)障晶狀體損傷的病變機(jī)制并對其防治具有重要意義。本研究表明,白內(nèi)障大鼠模型構(gòu)建成功。TAN是從果實(shí)橘皮中提取得到的一種天然活性單體化合物,具有廣泛的藥理學(xué)作用〔16〕。

鐵死亡是白內(nèi)障晶狀體損傷的新機(jī)制,主要是由于細(xì)胞內(nèi)抗氧化系統(tǒng)的失衡,導(dǎo)致谷胱甘肽(GSH)合成不足及GPX4失活引發(fā)細(xì)胞脂質(zhì)過氧化物代謝受阻〔17〕。在此基礎(chǔ)上,細(xì)胞內(nèi)不穩(wěn)定鐵池儲存的大量Fe2+會釋放至細(xì)胞內(nèi),并通過芬頓(Fenton)反應(yīng)產(chǎn)生大量活性氧,促進(jìn)脂質(zhì)過氧化物產(chǎn)生增多,最終細(xì)胞膜機(jī)構(gòu)改變,誘發(fā)細(xì)胞死亡〔18〕。本研究結(jié)果表明,TAN能夠通過降低Fe2+水平,改善白內(nèi)障大鼠晶狀體損傷。鐵死亡也被認(rèn)為是一種氧化應(yīng)激性損傷,MDA是紙質(zhì)過氧化產(chǎn)物,氧化應(yīng)激后受自由基影響而顯著升高,其含量高低是反映細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷的關(guān)鍵指標(biāo)〔19〕。SOD、GSH-Px是抗氧化性損傷關(guān)鍵調(diào)節(jié)酶〔20〕。既往研究證實(shí),TFR1、SLC7A11和GPX4被認(rèn)為是細(xì)胞鐵死亡的關(guān)鍵調(diào)控蛋白。TFR1能夠通過將細(xì)胞外Fe2+轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞內(nèi),導(dǎo)致細(xì)胞鐵超載,進(jìn)而誘發(fā)Fenton反應(yīng),導(dǎo)致細(xì)胞發(fā)生脂質(zhì)過氧化反應(yīng),誘導(dǎo)細(xì)胞死亡〔21〕。SLC7A11通過介導(dǎo)胱氨酸/谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)合成GSH所需胱氨酸,而抑制SLC7A11表達(dá)后會顯著抑制GSH生物合成,進(jìn)而導(dǎo)致GPX4蛋白表達(dá)下調(diào),抗氧化能力減低,并最終導(dǎo)致鐵死亡發(fā)生〔22〕。多項(xiàng)研究已證實(shí),鐵死亡參與白內(nèi)障形成,被認(rèn)為是晶狀體損傷的重要病理機(jī)制〔23,24〕。本研究結(jié)果表明,TAN能夠通過抑制細(xì)胞鐵死亡,進(jìn)而減輕白內(nèi)障大鼠晶狀體損傷。Liu等〔25〕研究發(fā)現(xiàn),脂多糖能夠誘導(dǎo)人支氣管上皮細(xì)胞鐵死亡,給予鐵死亡抑制劑Ferrostatin-1處理后能夠逆轉(zhuǎn)脂多糖誘導(dǎo)的人支氣管上皮細(xì)胞鐵死亡。本研究結(jié)果表明,鐵死亡抑制劑Ferrostatin-1能夠抑制白內(nèi)障大鼠上述指標(biāo)變化,改善晶狀體損傷,從而發(fā)揮與TAN同向的保護(hù)效應(yīng)。

綜上,TAN能夠改善白內(nèi)障大鼠模型晶狀體損傷,其機(jī)制與抑制細(xì)胞鐵死亡相關(guān)。但本研究也存在一定的局限性,未在細(xì)胞層面上揭示TAN對晶狀體損傷的影響。后續(xù)將通過體外培養(yǎng)晶狀體上皮細(xì)胞,揭示TAN對氧化應(yīng)激誘導(dǎo)晶狀體上皮細(xì)胞鐵死亡的影響。