張予心 楊蘭 靳雯棋 趙一名 孫立偉 劉芳兵

(長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué) 1附屬醫(yī)院實(shí)驗(yàn)中心,吉林 長(zhǎng)春 130012;2藥學(xué)院;3東北亞中醫(yī)藥研究院)

燥性反應(yīng)常出現(xiàn)口腔潰瘍、牙齦及咽喉腫痛、眼睛紅腫干澀、流鼻血、尿赤、便干等一系列癥狀,時(shí)常伴有全身性反應(yīng)癥候〔1,2〕?，F(xiàn)有研究表明,引起燥性反應(yīng)的生物機(jī)制與體內(nèi)炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激、激素調(diào)節(jié)、能量代謝等密切相關(guān)〔3～6〕,這一系列生理生化反應(yīng)的失衡造成了人體亞健康狀態(tài)〔4～6〕。導(dǎo)致燥性反應(yīng)的因素有很多,如環(huán)境、飲食、精神狀態(tài)等,而其中最關(guān)鍵的因素是體質(zhì)。老年人體質(zhì)逐漸衰弱,身體代謝能力、抗應(yīng)激能力均不足,體內(nèi)微環(huán)境長(zhǎng)期處于炎癥狀態(tài)或自由基過(guò)剩,更容易產(chǎn)生燥性反應(yīng)〔7,8〕。據(jù)《本草綱目》記載,枸杞子“能補(bǔ)腎、潤(rùn)肺、生精、益氣”,其作為藥食同源的滋補(bǔ)佳品深受民眾喜愛(ài)〔6〕,特別是老年群體多喜用枸杞子泡水代茶或煲湯等。但確有部分人群服用枸杞子后出現(xiàn)燥性反應(yīng)癥狀,表現(xiàn)為流鼻血、口干、咽喉腫脹、眼睛紅脹不舒服等癥狀,極大地制約了枸杞子的廣泛應(yīng)用〔9,10〕。目前,服用枸杞子發(fā)生燥性反應(yīng)現(xiàn)象的描述尚不完全。為更好認(rèn)識(shí)枸杞子產(chǎn)生燥性反應(yīng)的實(shí)質(zhì),本研究選擇最具代表性的干姜、肉桂、附子熱性藥方劑作為誘發(fā)燥性反應(yīng)的陽(yáng)性對(duì)照藥,其藥性辛熱燥烈,長(zhǎng)期服用會(huì)誘發(fā)燥性反應(yīng)癥狀〔11〕。本研文擬分析枸杞子潛在燥性反應(yīng)對(duì)小鼠特性表征的影響。

1 材料與方法

1.1材料 儀器:真空凍干機(jī),SCANVAC,沈陽(yáng)基因有限公司;離心機(jī),Centrifuge 5810 R,德國(guó)Eppendorf AG;酶標(biāo)儀,Infinite M200 PRO,澳大利亞TECAN;石蠟包埋機(jī),JB-P5,武漢俊杰電子有限公司;組織切片機(jī),RM2016,上海徠卡儀器有限公司;光學(xué)顯微鏡,M8,德國(guó)PreciPoint。試劑:枸杞子、肉桂、附子、干姜購(gòu)于北京同仁大藥房;酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)試劑盒購(gòu)于江蘇酶免實(shí)業(yè)有限公司;4%多聚甲醛、蘇木素-伊紅(HE)染色試劑盒、Triton-X-100購(gòu)于北京索萊寶科技有限公司;羊血清購(gòu)于美國(guó)Thermo Scientific;CD68一抗和二抗購(gòu)于武漢Proteintech。動(dòng)物:雄性10月齡C57BL/6小鼠購(gòu)自沈陽(yáng)長(zhǎng)生生物技術(shù)有限公司,飼養(yǎng)于SPF級(jí)動(dòng)物房,恒溫(25±2)℃,恒濕(55±5)%,光照周期12 h,自由攝取食水,適應(yīng)期7 d。本研究所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)操作符合長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物倫理委員會(huì)規(guī)定。

1.2枸杞子提取物的制備 將100 g枸杞子以1 L水煮沸1 h,將煎液倒出,再加1 L水煮沸1 h,將兩次煎液合并,以8 000 r/min離心,棄沉淀,將提取物制成凍干粉,稱量后置于干燥處備用。

1.3熱性藥煎液的制備 取肉桂、附子、干姜各30 g,加水900 ml,同1.2中方法制備。

1.4動(dòng)物實(shí)驗(yàn) 將40只小鼠隨機(jī)分為空白組、熱性藥方組(1.5 g/kg)、枸杞低劑量組(1.8 g/kg)、枸杞高劑量組(3.6 g/kg),每組10只,每天上午灌胃給藥,空白組給予等量鹽水。每天灌胃1次,稱體質(zhì)量、食物重量、飲水量,測(cè)量肛溫,連續(xù)14 d。第15天處死小鼠,取血液與組織樣本。

1.5糞便含水量 收集各組小鼠新鮮糞便,稱量等量新鮮糞便,經(jīng)凍干,稱量?jī)龈杉S便重量,含水量=新鮮糞便重量-凍干糞便重量。

1.6生化指標(biāo)檢測(cè) 各組血液在37 ℃放置30 min,3 000 r/min離心10 min取血清。按照ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)步驟,于450 nm波長(zhǎng)處,分別檢測(cè)腫瘤壞死因子(TNF)-α、白介素(IL)-1β、IL-6、CC家族趨化因子配體(CCL)2、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GSH-px)、丙二醛(MDA)、過(guò)氧化氫酶(CAT)。

1.7脾臟指數(shù) 稱量各組脾臟重量,取與第15天各自體質(zhì)量的比值,脾臟指數(shù)=脾質(zhì)量/第15天體質(zhì)量×100%。

1.8HE染色 將脾組織放入4%多聚甲醛,浸泡24 h,然后經(jīng)酒精脫水、二甲苯透明化、石蠟包埋后,制成5 μm厚的冠狀切片,再經(jīng)二甲苯與酒精脫水,然后進(jìn)行蘇木素染色,氨水返藍(lán),伊紅染色,最后風(fēng)干封片,光學(xué)顯微鏡下觀察組織結(jié)構(gòu)。

1.9免疫組化 將脫水后的石蠟切片用0.3% Triton-X-100孵育30 min,用5%羊血清封閉2 h,然后在4 ℃孵育CD68一抗過(guò)夜,第2天室溫孵育二抗2 h,最后光學(xué)顯微鏡下觀察染色結(jié)果。

1.10統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS19.0軟件進(jìn)行ANOVA檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1枸杞子提取物引起小鼠燥性反應(yīng)體征變化 從小鼠形態(tài)上觀察,空白組毛發(fā)順滑油亮,熱性藥方組毛發(fā)干燥,枸杞低劑量組毛發(fā)未見(jiàn)異常,然而枸杞高劑量組干燥。與空白組比較,熱性藥方組、枸杞子高劑量組體質(zhì)量顯著下降,飲水量顯著升高,熱性藥方組進(jìn)食量顯著降低(P<0.05);體溫略有升高但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。各組糞便含水量均無(wú)顯著差異(P>0.05)。見(jiàn)表1。

表1 各組燥性反應(yīng)體征及脾臟CD68表達(dá)、脾臟指數(shù)比較

2.2枸杞子提取物引起小鼠脾臟的病理變化 空白組脾臟紅髓與白髓界限分明,脾小體清晰完整,無(wú)巨噬細(xì)胞浸潤(rùn),脾竇無(wú)異常擴(kuò)張,細(xì)胞分布均勻。熱性藥方組脾血竇增多,細(xì)胞排列略散亂,但紅髓與白髓較分明,無(wú)巨噬細(xì)胞浸潤(rùn),與空白組相比無(wú)顯著差別。枸杞低劑量組無(wú)明顯異常,與空白組相比紅細(xì)胞更充盈。枸杞高劑量組脾臟紅髓與白髓界限模糊,脾小體輪廓不清晰,有巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)(黑色箭頭),有幾處血竇擴(kuò)張(黃色箭頭)。見(jiàn)圖1?？瞻捉M、熱性藥方組與枸杞低劑量組脾臟中單核/巨噬細(xì)胞標(biāo)志物CD68表達(dá)量很低,而枸杞高劑量組較空白組顯著升高(P<0.05)。枸杞高劑量組脾臟指數(shù)也顯著高于空白組(P<0.05),陽(yáng)性藥方組、低劑量組與空白組無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。見(jiàn)表1。

圖1 各組脾臟病理

2.3枸杞子提取物引起小鼠體內(nèi)炎癥反應(yīng) 熱性藥方組和枸杞高劑量組TNF-α、IL-1β、IL-6及CCL2水平顯著高于空白組(P<0.05);枸杞低劑量組TNF-α和IL-1β水平顯著高于空白組(P>0.05),見(jiàn)表2。

2.4枸杞子提取物引起小鼠體內(nèi)氧化應(yīng)激損傷 與空白組相比,熱性藥方組及枸杞高劑量組SOD、CAT及GSH-px水平顯著降低,MDA水平顯著升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);枸杞低劑量組CAT水平顯著降低(P>0.05),見(jiàn)表2。

表2 各組炎癥因子及氧化應(yīng)激反應(yīng)指標(biāo)比較

3 討 論

枸杞子作為補(bǔ)品深受老年人喜愛(ài),但過(guò)量攝入可能會(huì)出現(xiàn)燥性反應(yīng)癥狀,如口干咽痛、眼睛腫脹、頭疼等〔9〕。本研究顯示,給予老年小鼠低劑量(藥典規(guī)定劑量)和高劑量(2倍藥典規(guī)定劑量)枸杞子提取物,與經(jīng)典熱性藥方體征相似。結(jié)合現(xiàn)代醫(yī)學(xué)理論,燥性反應(yīng)是一種機(jī)體穩(wěn)態(tài)失衡的表現(xiàn),然而老年人機(jī)體很容易因?yàn)轱嬍巢划?dāng)而產(chǎn)生穩(wěn)態(tài)失衡〔3,8〕。機(jī)體的穩(wěn)態(tài)是由體內(nèi)各種生理生化反應(yīng)及各個(gè)組織相互維系,任何一個(gè)器官或生理反應(yīng)的異常,都會(huì)導(dǎo)致燥性反應(yīng)證候〔4,6〕。脾是人體重要的免疫器官,脾臟組織的變化可直接影響機(jī)體免疫功能,脾胃不和者過(guò)量食用枸杞子容易燥性反應(yīng)〔9,12〕。

炎癥反應(yīng)是機(jī)體進(jìn)行自我保護(hù)的最重要反應(yīng)之一,當(dāng)受到異物入侵,多種炎癥因子、趨化因子水平升高,參與抵抗外物侵襲〔13〕。當(dāng)機(jī)體內(nèi)自由基過(guò)多,氧化反應(yīng)超過(guò)抗氧化作用會(huì)導(dǎo)致氧化應(yīng)激,抗氧化酶類活性降低,機(jī)體產(chǎn)生大量氧化中間產(chǎn)物,參與多種疾病過(guò)程,還促進(jìn)牙齦腫痛、大便干結(jié)等燥性反應(yīng)癥狀〔14〕。

枸杞子雖滋補(bǔ),但過(guò)量食用會(huì)導(dǎo)致脾濕加重,滋生內(nèi)火,老年人陰液不足者更易引發(fā)燥性反應(yīng)。依據(jù)現(xiàn)代醫(yī)學(xué)理論,過(guò)量食用枸杞子引發(fā)炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激,然而老年人抵抗應(yīng)激能力下降,易誘發(fā)“燥性反應(yīng)”證候。本研究通過(guò)對(duì)小鼠體征變化、脾組織病理變化的觀察及炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激檢測(cè),首次闡釋了過(guò)量食用枸杞子引起燥性反應(yīng)的作用機(jī)理。然而,燥性反應(yīng)的生物內(nèi)涵十分復(fù)雜,更深層的作用機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。