肖旭 李澤濛 劉佩 李鵬程

(海南醫(yī)學(xué)院 1第一附屬醫(yī)院口腔頜面外科,海南 海口 570100;2第二附屬醫(yī)院口腔科)

口腔鱗癌全稱為口腔鱗狀細胞癌,在臨床口腔科屬于較為常見的口腔惡性腫瘤,其發(fā)生部位為人口腔頜面部位置,是由于口腔的鱗狀上皮發(fā)生了惡變,從而發(fā)展為惡性腫瘤。口腔鱗癌在發(fā)生時會存在較高的侵襲及轉(zhuǎn)移性,其發(fā)病率在口腔癌中占據(jù)90%居多〔1〕?，F(xiàn)代隨著醫(yī)學(xué)方面的不斷進步發(fā)展,已經(jīng)顯著降低該惡性腫瘤疾病的發(fā)病率,目前臨床基本控制在50%左右〔2〕。臨床對于口腔鱗癌的治療常采用放療、化療及手術(shù)等方式進行治療,但在治療后患者5年的生存率相對較低,而在進行治療的過程中通過相關(guān)的中藥、植物的提取物能夠通過實行靶向調(diào)控來達到抗癌效果〔3〕。檳榔屬于棕櫚科植物的一種,其主要生存于海南、云南西雙版納等熱帶雨林地區(qū),而作為重要的檳榔在四大南藥中位居首位〔4〕。檳榔自身存在較多人體所需的如檳榔堿、干露糖、氨基酸等多種營養(yǎng)元素及活性成分〔5〕。檳榔提取物能夠通過對順鉑引導(dǎo)的口腔癌疾病產(chǎn)生一定的功效,并且能夠升高機體內(nèi)的自噬活性進行〔6〕。MYC關(guān)聯(lián)因子X(Max)以蛋白的形態(tài)存在于機體內(nèi),會直接參與多種惡性腫瘤疾病的發(fā)生發(fā)展,但檳榔提取物是否可通過上調(diào)Max表達從而對口腔鱗癌細胞遷移、侵襲產(chǎn)生影響還尚未可知〔7〕。本研究探討檳榔提取物通過上調(diào)Max蛋白對口腔鱗癌細胞遷移、侵襲的影響。

1 材料與方法

1.1研究對象 購買CAL127人口腔鱗癌細胞。(購買于中國豐暉生物公司)。實驗試劑:(1)購買自海南新鮮干燥的檳榔果。將其進行去皮,隨后進行稱重,城中30 g的檳榔干果,將稱重過后的檳榔干果置于4 ℃的去離子水中,進行60 min的機械研磨。將研磨后的檳榔提取物同故宮離心機以12 000 r/min,離心半徑10 cm的條件下進行離心處理8 min,離心后獲取檳榔上清液,并進行過濾,帶過濾后置于-80 ℃冷凍干燥機內(nèi)進行濃縮凍干,從而獲取干燥且呈現(xiàn)出粉狀的檳榔提取物。對粉狀檳榔提取物進行稱重,稱重后將其與離子水進行溶解,回去最終的檳榔提取物水溶液,以1 mg/ml講檳榔提取物保存至-25 ℃的低溫中待用。(2)DMEM培養(yǎng)基(上海吉至生化科技有限公司),超級胎牛血清(鄭州九龍生物制品有限公司)、RIPA蛋白裂解液、四噻唑藍(購自Hyclone,美國),結(jié)晶紫染液、聚偏氟乙烯膜(購自碧云天生物技術(shù)研究所),血小板源性生長因子(P-PDGFB)、磷酸化血小板源性生長因子(PDGFR)β、細胞周期蛋白(Cyclin)D1蛋白、Max/GAPDH抗體,山羊抗大鼠ROCK一抗、兔抗鼠IgG二抗(均購自武漢純度生物科技有限公司)。

1.2儀器設(shè)備 Multi-skan MK3型酶標(biāo)儀(美國Thermo公司);Transwell小室(南京迅貝生物科技有限公司);CO2培養(yǎng)箱(河北慧采科技有限公司);培養(yǎng)板(阿爾法生物實驗器材有限公司);BX53半電動熒光顯微鏡(上海儀景通光學(xué)科技有限公司);雙垂直電泳儀(深圳市康初源有限公司)。

1.3方法 將購買的CAL127人口腔鱗癌細胞放置于含有10%的超級胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基內(nèi)進行培養(yǎng),其培養(yǎng)的條件為:37 ℃、5% CO2條件下。當(dāng)CAL127人口腔鱗癌細胞處于對數(shù)生長期時對其進行實驗,在進行飾演的過程中將實驗分為對照組、低、中、高濃度檳榔提取物(低、中、高濃度)組。對照組:將CAL127人口腔鱗癌放置于含有10%的超級胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基內(nèi)進行培養(yǎng);低濃度組:在DMEM培養(yǎng)基內(nèi)加入10 μmol/L檳榔提取物;中濃度組:在DMEM培養(yǎng)基內(nèi)加入20 μmol/L檳榔提取物;高濃度組:在DMEM培養(yǎng)基內(nèi)加入30 μmol/L檳榔提取物。各組均進行24 h的培養(yǎng)。

1.4Max相對表達量檢測 采用實時熒光定量-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-qPCR)法測定Max相對表達量,采用Max試劑盒(上海信裕生物科技有限公司)提取血液內(nèi)RNA,用RT-qPCR試劑盒進行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng),將cDNA,產(chǎn)物進行PCR擴增。條件參數(shù)為預(yù)火95 ℃預(yù)變性10 min,取出降溫至85 ℃,變性5 s,迅速降溫至60 ℃,退火15 s,溫度保持50 ℃,延伸45 s,35個循環(huán),重復(fù)實驗3次。內(nèi)參GAPDH上游引物:5＇-GTCAAGGCTGAGAACGGGAA-3＇,下游:5＇-AAATGAGCCCCAGCCTTCTC-3＇;Max上游引物:5＇-CCTGGGCCCTAGGAAATGAG-3＇,下游:5＇-TAGAGCAGGCGTGGTCCAG-3＇。以GAPDH為內(nèi)參,采用2-ΔΔCt方法計算Max相對表達量。

1.5檢測細胞遷移 通過進行劃痕實驗檢驗胃癌細胞株的遷移能力,選取胃癌細胞株用胰蛋白酶分解,獲取細胞懸液接種到6孔板上,并用1.60 ml移液器槍頭對所有單層細胞從上至下畫一條劃痕,用磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌刮下細胞,向干凈培養(yǎng)基中加入4 ml溶液,37 ℃下培育29 h,棄去培養(yǎng)液,在顯微鏡下觀察并記錄視野平均值,重復(fù)3次,取細胞遷移數(shù)平均值。

1.6檢測細胞侵襲 在24孔板中放置Transwell小室,在Transwell小室層中加入50 μl的基質(zhì)膠,并在37 ℃ 5%的CO2的培養(yǎng)箱中過夜,直到基質(zhì)膠完全凝固,然后在24孔下室中加入500 μl含有10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液,Transwell小室中加入100 μl的胃癌細胞懸液,48 h以后吸除24孔板下室中的培養(yǎng)液,用0.1%的結(jié)晶紫溶液進行染色6 min,對口腔鱗癌細胞的侵襲個數(shù)進行觀察。

1.7Western印跡法測定PDGFB、p-PDGFRβ、CyclinD1蛋白相對表達量 轉(zhuǎn)染48 h后提取蛋白,用二喹啉甲酸(BCA)法測定蛋白濃度。與緩沖液混合100 ℃煮沸5 min后電泳。在90 V、4 ℃下靶蛋白轉(zhuǎn)移至NC膜上,轉(zhuǎn)膜時間為90 min,封閉:5%胎牛血清白蛋白,室溫孵育60 min。經(jīng)NC膜放置在1∶900稀釋一抗中4 ℃進行孵育。二抗室溫1 h后顯色。對細胞凋亡相關(guān)蛋白PDGFB、p-PDGFRβ、CyclinD1相對表達量進行檢測。

1.8統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS19.0軟件進行獨立樣本t檢驗、方差分析。

2 結(jié) 果

2.1各組Max蛋白表達對比 與對照組(1.02±0.23)相比,低、中、高濃度組Max蛋白表達(2.34±0.38、3.57±0.47、4.81±0.52)均升高,具有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05);與低濃度組相比,中、高濃度組Max表達均升高,具有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05);與中濃度組相比,高濃度組Max表達升高,具有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)。

2.2各組口腔鱗癌細胞遷移能力對比 如表1、圖1所示,與對照組相比,低、中、高濃度組口腔鱗癌細胞遷移能力均降低,具有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05);與低濃度組相比,中、高濃度組口腔鱗癌細胞遷移能力均降低,具有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05);與中濃度組相比,高濃度組遷移能力降低,具有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)。

2.3各組口腔鱗癌細胞侵襲率對比 如表1、圖2所示,與對照組相比,低、中、高濃度組口腔鱗癌細胞侵襲個數(shù)均降低,具有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05);與低濃度組相比,中、高濃度組口腔鱗癌細胞侵襲個數(shù)均降低,具有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05);與中濃度組相比,高濃度組侵襲個數(shù)降低,具有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)。

2.4各組口腔鱗癌細胞周期分布情況對比 如表1所示,高濃度組口腔鱗癌細胞處于G0/G1期均高于對照組、低、中濃度組(P<0.05);高濃度組口腔鱗癌細胞處于S期均低于對照組、低、中濃度組(P<0.05);低濃度組口腔鱗癌細胞處于G2/M期高于對照組、中、高濃度組,高濃度組口腔鱗癌細胞處于G2/M期低于對照組、低、中濃度組,具有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)。

2.5各組口腔鱗癌細胞增殖、凋亡率對比 如表1所示,與對照組相比,低、中、高濃度組口腔鱗癌細胞增值率均降低,凋亡率均升高,具有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05);與低濃度組相比,中、高濃度組口腔鱗癌細胞增值率均降低,凋亡率均升高,具有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05);與中濃度組相比,高濃度組增值率均降低,凋亡率均升高,具有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)。

表1 各組口腔鱗癌細胞遷移、侵襲能力、細胞周期分布、增殖及凋亡率對比

圖1 各組口腔鱗癌細胞遷移(×200)

圖2 各組口腔鱗癌細胞侵襲(結(jié)晶紫染色,×200)

2.6各組口腔鱗癌細胞PDGFB、p-PDGFRβ、CyclinD1蛋白表達對比 如表2、圖3所示,與對照組相比,低、中、高濃度組口腔鱗癌細胞PDGFB、p-PDGFRβ、CyclinD1蛋白表達均降低,具有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05);與低濃度組相比,中、高濃度組口腔鱗癌細胞PDGFB、p-PDGFRβ、CyclinD1蛋白表達均降低,具有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05);與中濃度組相比,高濃度組口腔鱗癌細胞PDGFB、p-PDGFRβ、CyclinD1蛋白表達降低,具有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)。

表2 各組口腔鱗癌細胞PDGFB、p-PDGFRβ、CyclinD1蛋白表達對比

圖3 各組口腔鱗癌細胞PDGFB、p-PDGFRβ、CyclinD1蛋白表達

3 討 論

口腔鱗癌在當(dāng)前臨床中的發(fā)病率相對較高,并且患者在進行治療后的5年生存率相對較低,并且會出現(xiàn)癌轉(zhuǎn)移而造成死亡,臨床致死率也相對較高〔8〕。因此臨床相關(guān)醫(yī)師進行多種相關(guān)實驗尋找較具療效的治療藥物,緩解患者疾病嚴重程度〔9〕。檳榔提取物時從檳榔果中提取而來,據(jù)相關(guān)研究表明〔10〕,當(dāng)檳榔堿的濃度在10 μmol/L時,能夠?qū)谇火つこ衫w維細胞的增殖情況產(chǎn)生促進作用,但也有相關(guān)研究得出〔11〕,檳榔堿也會對口腔黏膜成纖維細胞的增殖情況進行抑制。

Max蛋白以蛋白的形態(tài)存在于機體內(nèi)的細胞中,而相關(guān)研究指出〔12,13〕,Max蛋白在機體內(nèi)屬于抑癌基因的一種,并且在機體出現(xiàn)癌變時,參與癌變?nèi)^程,能夠?qū)Π┘毎姆只蜕L進行一定程度的調(diào)控。本研究結(jié)果表明,口腔鱗癌細胞中Max蛋白表達呈現(xiàn)上調(diào)趨勢,而對Max表達進行阻斷且降低檳榔提取物的濃度,其口腔鱗癌細胞的遷移和侵襲能力相對減弱。

細胞周期分為3個:DNA合成前期(G1/G0)、合成期(S)、合成后期(G2/M),S期是機體內(nèi)細胞進行分裂增殖的重要時期,在這一時期前將細胞阻滯能夠有效地抑制癌細胞的發(fā)展〔14,15〕。相關(guān)研究顯示〔16,17〕,Max能夠有效地調(diào)控CAL127細胞改變癌細胞的周期分布。本研究結(jié)果說明,上調(diào)Max蛋白能夠降低口腔鱗癌細胞的相對表達量,能夠起到改變癌細胞周期分布的作用。

據(jù)相關(guān)研究指出〔18〕,采用不同濃度的蟲草素提取物對口腔鱗癌細胞的增殖、侵襲及遷移情況進行分析,高濃度蟲草素能夠顯著降低癌細胞的增殖率、遷移及侵襲能力〔19,20〕。本研究結(jié)果提示,檳榔提取物可能存在對口腔鱗癌細胞的遷移能力、侵襲個數(shù)進行抑制,從而達到相關(guān)治療效果。本研究還提示,不同濃度的檳榔提取物對口腔鱗癌細胞的增殖率也能夠產(chǎn)生降低作用,對腔鱗癌細胞凋亡率能夠產(chǎn)生升高作用,并且會隨著濃度升高,其增殖率會逐漸降低、凋亡率逐漸升高。并能抑制PDGFB、p-PDGFRβ、CyclinD1蛋白表達。而在高濃度下的Max蛋白表達也呈現(xiàn)升高狀態(tài),其表達高于對照組、低、中濃度中的Max表達。PDGF在機體內(nèi)以分裂原形態(tài)存在,并且能夠促進體外平滑及纖維細胞的分裂。據(jù)相關(guān)研究表明,PDGFB、p-PDGFRβ之間所產(chǎn)生的相互作用,能夠?qū)Π┘毎倪w移、侵襲能力產(chǎn)生關(guān)鍵作用。本研究結(jié)果顯示,PDGFB、p-PDGFRβ、CyclinD1蛋白在口腔鱗癌細胞遷移、侵襲中具有重要作用。

綜上,不同濃度的檳榔提取物可通過上調(diào)Max蛋白的表達而對口腔鱗癌細胞的遷移、侵襲進行不同程度的抑制。