廖兵 楊春平 易韻 劉月輝 朱新華 劉建國 汪美群 劉軻 陳旭波 張皓 田小燕

(1南昌大學(xué)第二附屬醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科,江西 南昌 330006;2江西省腫瘤醫(yī)院婦瘤科)

變應(yīng)性鼻炎(AR)是接觸過敏原后,特異性個(gè)體產(chǎn)生大量IgE抗體,后者可介導(dǎo)組胺等炎癥介質(zhì)釋放,激活免疫活性細(xì)胞和促炎細(xì)胞,在鼻黏膜發(fā)生Ⅰ型變態(tài)反應(yīng)性的疾病。我國是AR高發(fā)地區(qū),患病率較高,并且隨著國家工業(yè)化程度提高而呈逐年上升趨勢(shì)〔1〕,嚴(yán)重影響患者工作和生活質(zhì)量。目前研究已了解變應(yīng)性疾病的發(fā)病機(jī)制,但影響免疫反應(yīng)的因素多樣且復(fù)雜,尚有較多的關(guān)鍵問題亟待深入了解。目前尚未有研究對(duì)RNA 干擾(RNAi)基因沉默CC趨化因子受體(CCR)3對(duì)AR嗜堿性粒細(xì)胞功能進(jìn)一步探討,本研究使用RNAi技術(shù)沉默CCR3 基因來阻斷CCR3/嗜酸性粒細(xì)胞趨化因子(Eotaxin)路徑,探索此過程中嗜堿性粒細(xì)胞在骨髓、外周血及鼻腔的募集、遷移及成熟過程的變化,探討RNAi 沉默CCR3對(duì)AR嗜堿性粒細(xì)胞遷移、活化及脫顆粒的影響。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物:8周齡的SPF級(jí)雄性健康小鼠共48只,由湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供。恒溫恒濕環(huán)境下分籠飼養(yǎng),提供無菌飼料及飲水。本研究通過倫理委員會(huì)批準(zhǔn),符合動(dòng)物倫理要求。主要試劑:Trizol 試劑購自上海信乎生物科技有限公司,蘇木素-伊紅(HE)試劑盒購自深圳逗點(diǎn)生物技術(shù)有限公司,放射免疫沉淀(RIPA)裂解液購自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司,二喹啉甲酸(BCA)蛋白測(cè)定試劑盒購自廣州翔博生物科技有限公司,逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司,慢病毒購自蘇州吉瑪基因科技有限公司。主要儀器:全自動(dòng)研磨儀購自武漢賽維爾科技有限公司,凝膠成像系統(tǒng)購自美國Bio-Rad公司,蛋白電泳儀購自美國Bio-Rad公司,透射電子顯微鏡購自日本HITACHI公司。

1.2構(gòu)建AR模型 參考文獻(xiàn)方法〔2〕,取36只小鼠建立AR模型:腹腔注射10 μg卵清白蛋白/4 mg氫氧化鋁混合液進(jìn)行基礎(chǔ)致敏,2次/d,共14 d;于第21～27天以卵清白蛋白在鼻腔內(nèi)進(jìn)行局部激發(fā)。另取12只正常小鼠腹部注射或鼻腔滴入等體積生理鹽水進(jìn)行對(duì)照。最后1次激發(fā)試驗(yàn)后,觀察小鼠鼻部癥狀表現(xiàn),如短時(shí)間內(nèi)出現(xiàn)持續(xù)抓鼻、摩擦、打噴嚏、鼻腔內(nèi)有較多分泌物則判定為AR模型建立成功。

1.3設(shè)計(jì)并合成小鼠CCR3siRNA 根據(jù)NCBI 數(shù)據(jù)庫,查出小鼠CCR3 mRNA 序列全長,并合成設(shè)計(jì)其siRNA基因引物序列(5′-3′)為:CCR3siRNA1正義鏈:GGGCUCUUUAGAUGUUUGATT,反義鏈:UC-AAACAUCUAAAGAGCCCTT;CCR3siRNA2正義鏈:GCUGAGAUGUCCCAAUAAATT,反義鏈:UUUAUU-GGGACAUCUCAGCTT;CCR3siRNA3正義鏈:GCCUGUGUUUCUAUCAUUATT,反義鏈:UAAUGAUAGA-AACACAGGCTT;CCR3siRNA4正義鏈:GCUGUA-UUAAUCCAGUAAUTT,反義鏈:AUUACUGGAU-UAAUACAGCTT。經(jīng)前期實(shí)驗(yàn),確定CCR3siRNA3抑制CCR3表達(dá)效果最好,故選用CCR3siRNA3作為本次研究的目標(biāo)基因序列。

1.4CCR3siRNA干預(yù)及分組 建AR模型同時(shí),于第0、7、14天,經(jīng)鼻緩慢滴入20 μl CCR3siRNA對(duì)照試劑(對(duì)照組)、CCR3siRNA(干預(yù)組)和等量生理鹽水(模型組);且在第21～28天激發(fā)試驗(yàn)3 h前,相應(yīng)組別小鼠再次經(jīng)鼻緩慢滴入20 μl CCR3siRNA對(duì)照試劑、CCR3siRNA和生理鹽水,左右鼻側(cè)各滴入10 μl。正常對(duì)照的小鼠在同樣時(shí)間滴入生理鹽水(正常組)。

1.5外周血、骨髓和鼻黏膜相關(guān)指標(biāo)檢測(cè) 實(shí)驗(yàn)結(jié)束后,利用異氟烷對(duì)小鼠進(jìn)行麻醉,摘取眼球取外周血,室溫條件下3 000 r/min離心10 min,收集上清液備用。利用頸椎脫臼法處死小鼠,取出鼻中隔黏膜組織,保存于冰箱中備用。暴露并剪取小鼠股骨和脛骨,往骨腔內(nèi)注入生理鹽水,收集骨髓沖洗液,保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5.1Western印跡檢測(cè)CCR3蛋白表達(dá) 提取本實(shí)驗(yàn)獲得的組織勻漿或血清總蛋白,使用BCA蛋白定量法,對(duì)提取的總蛋白進(jìn)行定量測(cè)定。設(shè)置好濃縮膠電壓和分離膠電壓,進(jìn)行烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳,轉(zhuǎn)印。取聚偏氟乙烯膜用洗滌緩沖液洗膜,封閉、室溫?fù)u床孵育。 洗膜后,先后加入一抗、二抗,孵育后。聚偏氟乙烯膜表面滴入新鮮配制的化學(xué)發(fā)光液滴,并轉(zhuǎn)移至成像分析系統(tǒng)中,采集圖像并分析CCR3蛋白相對(duì)表達(dá)量。

1.5.2實(shí)時(shí)熒光定量-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-qPCR)檢測(cè)CCR3 mRNA表達(dá) 提取本實(shí)驗(yàn)獲得的組織勻漿或血清總RNA,根據(jù)cDNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書將RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA,再用熒光定量試劑盒擴(kuò)增和定量,PCR引物序列(5′-3′)為:CCR3上游:5′-GCGTTTGGACATCAGCTTGA-3′,下游:5′-ACGAT-TGTTCCGAAGCTTTGG-3′;GAPDH上游:GAAGGTGAAGGTCGGAGT,下游:GAAGATGGTGATGGGAT-TTC;設(shè)置好PCR體系和反應(yīng)條件。以2-ΔΔCt公式計(jì)算CCR3 mRNA相對(duì)表達(dá)量。

1.5.3ELISA檢測(cè)組胺、類胰蛋白酶、白細(xì)胞介素(IL)-3和IL-5水平將本實(shí)驗(yàn)獲得的組織勻漿或血清,用相應(yīng)的ELISA試劑盒檢測(cè)外周血和鼻黏膜組胺、IL-3、IL-5和類胰蛋白酶濃度。

1.5.4鼻黏膜形態(tài)學(xué)觀察 收集鼻黏膜組織,用4%多聚甲醛固定,脫水、包埋、切片,制作鼻黏膜標(biāo)本,并使用HE進(jìn)行染色,在光學(xué)顯微鏡下觀察小鼠鼻黏膜的病理變化。

1.5.5流式細(xì)胞儀檢測(cè)CD34+細(xì)胞水平 收集骨髓和外周血,制作單個(gè)核細(xì)胞懸液,加入抗CD34+體標(biāo)記細(xì)胞,采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)CD34+細(xì)胞水平。

1.6細(xì)胞實(shí)驗(yàn) 模型組最后1次激發(fā)結(jié)束時(shí),提取骨髓嗜堿性粒細(xì)胞體外培養(yǎng),在體外利用小鼠骨髓干細(xì)胞誘導(dǎo)獲得高純度的嗜堿性粒細(xì)胞。取對(duì)數(shù)期生長的的細(xì)胞分別加入CCR3siRNA(CCR3siRNA組)、CCR3siRNA對(duì)照試劑(CCR3siRNA對(duì)照組)和PBS 液(空白組)進(jìn)行培養(yǎng)。采用甲苯胺藍(lán)染色法觀察細(xì)胞的成熟度,并按公式(脫顆粒百分率=脫顆粒細(xì)胞數(shù)/所計(jì)數(shù)的100 個(gè)細(xì)胞×100%)計(jì)算其百分率。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS22.0軟件進(jìn)行方差分析、LSD-t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1CCR3siRNA對(duì)AR小鼠CCR3表達(dá)的影響 在小鼠外周血、鼻黏膜和骨髓中,與正常組比較,模型組、對(duì)照組和干預(yù)組CCR3蛋白和mRNA表達(dá)水平明顯升高(均P<0.05);與模型組和對(duì)照組比較,干預(yù)組CCR3蛋白和mRNA表達(dá)水平明顯降低(均P<0.05)。見圖1、表1。

圖1 各組外周血、鼻黏膜、骨髓CCR3蛋白表達(dá)

表1 各組外周血、鼻黏膜、骨髓中CCR3蛋白及mRNA表達(dá)

2.2CCR3siRNA對(duì)AR小鼠鼻黏膜形態(tài)學(xué)的影響 正常組鼻黏膜組織結(jié)構(gòu)完整,排列整齊,黏膜及黏膜下組織未見腫脹,組織少許或無炎性細(xì)胞浸潤。與正常組比較,模型組和對(duì)照組鼻黏膜結(jié)構(gòu)不清,黏膜及黏膜下層腫脹,可見炎性細(xì)胞浸潤。干預(yù)組上述鼻黏膜結(jié)構(gòu)被破壞,但較模型組和對(duì)照組有所改善。見圖2。

圖2 各組鼻黏膜(HE染色,×100)

2.3CCR3siRNA對(duì)AR小鼠組胺、類胰蛋白酶、IL-3和IL-5水平的影響 在小鼠外周血、鼻黏膜和骨髓中,與正常組比較,模型組、對(duì)照組和干預(yù)組組胺、類胰蛋白酶、IL-3和IL-5水平明顯升高(均P<0.05)。與模型組和對(duì)照組比較,干預(yù)組組胺、類胰蛋白酶、IL-3和IL-5表達(dá)水平明顯降低(均P<0.05)。見表2。

2.4CCR3siRNA對(duì)AR小鼠外周血和骨髓CD34+細(xì)胞表達(dá)的影響 在外周血和骨髓中,與正常組比較,模型組、對(duì)照組和干預(yù)組CD34+細(xì)胞百分率明顯升高(P<0.05)。與模型組和對(duì)照組比較,干預(yù)組CD34+細(xì)胞百分率明顯降低(P<0.05)。見表2。

表2 各組外周血和鼻黏膜中組胺、類胰蛋白酶、IL-3、IL-5水平及外周血和骨髓CD34+細(xì)胞百分率比較

2.5CCR3siRNA對(duì)嗜堿性粒細(xì)胞脫顆粒的影響 與CCR3siRNA對(duì)照組〔(3.51±1.01)%〕和空白組〔(3.93±1.25)%〕比較,CCR3siRNA組脫顆粒細(xì)胞百分率〔(0.97±0.46)%〕明顯降低(均P<0.05)。見圖3。

圖3 各組嗜堿性粒細(xì)胞脫顆粒(甲苯胺藍(lán)染色,×200)

3 討 論

以往研究中,過敏性鼻炎、過敏性哮喘、過敏性皮炎等變態(tài)反應(yīng)疾病中的炎癥組織均發(fā)現(xiàn)嗜堿性粒細(xì)胞的浸潤〔3～6〕。有證據(jù)表明,在鼻腔受到變應(yīng)原激發(fā)后輔助型T細(xì)胞(Th)2細(xì)胞連續(xù)性激活,嗜堿性粒細(xì)胞、T 細(xì)胞和樹突細(xì)胞(DCs)的數(shù)量增多,在受到變應(yīng)原激發(fā)后發(fā)揮效應(yīng)細(xì)胞作用〔3〕。在正常情況下,嗜堿性粒細(xì)胞只存在于外周血中,且只有較少的數(shù)量,但其在發(fā)生變態(tài)反應(yīng)疾病時(shí),其亦迅速募集到炎癥部位,同時(shí)釋放足夠數(shù)量的炎癥介質(zhì),促使超敏反應(yīng)發(fā)生。研究證明,CCR3/Eotaxin 軸在Th2 淋巴細(xì)胞浸潤過敏的組織中具有重要作用,CCR3 作為Eotaxin 唯一結(jié)合的受體〔7,8〕,在介導(dǎo)嗜堿性粒細(xì)胞遷移具有關(guān)鍵作用,因此下調(diào)CCR3表達(dá)對(duì)改善AR癥狀具有潛在的治療意義。RNAi是目前熱門的基因阻斷技術(shù),具有沉默基因表達(dá)的功能。 RNAi 通過抑制重要基因表達(dá),有望成為干預(yù)治療變應(yīng)性疾病的新方法。目前已有利用 siRNA 來治療臨床疾病的研究,其具有持續(xù)時(shí)間長的特點(diǎn)〔9,10〕。因此設(shè)想針對(duì)嗜堿性粒細(xì)胞趨化、合成、釋放介質(zhì)等功能的關(guān)鍵基因,采用 RNAi 抑制基因表達(dá)進(jìn)行RNA 干預(yù),控制嗜堿性粒細(xì)胞產(chǎn)生,從而消除其在變應(yīng)性疾病發(fā)生發(fā)展機(jī)制中的作用。本研究結(jié)果提示,CCR3siRNA干預(yù)利于改善AR癥狀。此外,CCR3siRNA具有抑制CCR3表達(dá)的作用。

從免疫學(xué)角度了解AR,機(jī)體受到過敏源等體外環(huán)境因素影響,造成Th1/Th2 平衡失調(diào)〔11,12〕,導(dǎo)致以Th2 免疫反應(yīng)為主導(dǎo)變應(yīng)性炎癥反應(yīng)〔13〕。其他研究顯示,Th2 細(xì)胞可分泌IL-3 、IL-5和IL-13 等細(xì)胞因子〔14〕,后者作用于嗜堿性粒細(xì)胞、肥大細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞產(chǎn)生多種生理學(xué)效應(yīng),包括AR的變態(tài)反應(yīng)。本研究結(jié)果表明,CCR3siRNA可以減輕細(xì)胞因子引起的變應(yīng)性炎癥反應(yīng)放大效應(yīng)。嗜堿性粒細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)含嗜堿性顆粒,這些顆粒內(nèi)含有組胺等致敏性物質(zhì),當(dāng)細(xì)胞脫顆粒后胞膜隨即破裂,致敏性物質(zhì)向外周血和周圍組織釋放,持續(xù)加重過敏灶Ⅰ型變態(tài)反應(yīng)的發(fā)生發(fā)展。本研究表明,CCR3siRNA在嗜堿性粒細(xì)胞脫顆粒具有重要作用,能影響釋放組胺、類胰蛋白酶等致敏物質(zhì)的釋放。CD34+祖細(xì)胞在受到變應(yīng)原刺激后CCR3表達(dá)增加,激活CD34+祖細(xì)胞由骨髓向血液中釋放成熟的嗜堿性粒細(xì)胞〔15〕,后者經(jīng)血液循環(huán)向氣道遷移而在炎癥組織聚集。表明CCR3/Eotaxin 途徑在變應(yīng)性疾病發(fā)病過程中促使CD34+祖細(xì)胞從骨髓中釋放嗜堿性粒細(xì)胞過程中具有重要作用〔16〕。本研究表明,CCR3siRNA可以降低CD34+細(xì)胞表達(dá),間而抑制嗜堿性粒細(xì)胞細(xì)胞活化。

綜上,應(yīng)用RNAi技術(shù)可以沉默CCR3表達(dá),CCR3表達(dá)降低可抑制嗜堿性粒細(xì)胞細(xì)胞活化、遷移以及脫顆粒,利于改善AR癥狀。