梅冰馨 劉克華 張?zhí)?

(贛南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院口腔科,江西 贛州 341000)

口腔癌是一種預(yù)后較差的頜面部惡性腫瘤之一〔1,2〕。口腔癌病因及發(fā)病機制還未完全揭示,人們公認口腔衛(wèi)生差、吸煙、酗酒等因素均可導(dǎo)致口腔癌發(fā)病〔3〕。雖然目前關(guān)于口腔癌的臨床治療已獲得重大進步,然而該疾病患者5年生存率仍不足65%,給人類生命健康帶來巨大的打擊〔4〕。故探究口腔癌病因及發(fā)生機制已成為研究人員關(guān)注的重點課題之一。大量研究顯示,微小RNAs(miRNAs)可通過發(fā)揮腫瘤基因或腫瘤抑制基因的作用進而參與腫瘤細胞增殖、分化、侵襲等相關(guān)環(huán)節(jié)〔5〕。miR-34a已被證實在肺癌〔6〕、結(jié)腸癌〔7〕等多種實體瘤中的表達異常下調(diào),提示其可能是作為潛在的腫瘤抑制基因發(fā)揮作用。據(jù)報道,磷脂酰肌醇-3激酶(PI3K)/蛋白激酶B(AKT)通路是和細胞增殖、侵襲及遷移等密切相關(guān)的信號途徑,在腫瘤起病及演變過程中扮演關(guān)鍵角色。然而目前關(guān)于miR-34a調(diào)控PI3K/AKT通路對口腔癌細胞生物學(xué)行為的影響及機制研究較少,因此本研究對其進行探究。

1 材料與方法

1.1實驗細胞 人口腔角質(zhì)形成細胞HOK及人口腔癌細胞Tca8113、OEC-M1、OC3購于晶萊生物公司。細胞培養(yǎng)于DMEM培養(yǎng)基(含10%胎牛血清)中,然后置于細胞培養(yǎng)箱中孵育并傳代。

1.2主要試劑 Trizol試劑(北京啟衡星生物公司);聚偏氟乙烯(PVDF)膜(北京諾博萊德科技公司);PI3K、p-PI3K抗體(上海臻科生物公司);AKT、p-AKT抗體(深圳市豪地華拓生物公司);噻唑藍(MTT)細胞增殖檢測試劑盒(沈陽萬類生物公司);0.25%胰蛋白酶(武漢普諾賽生命科技公司);放射免疫沉淀(RIPA)試劑(蘇州近岸蛋白質(zhì)科技公司);磷酸鹽緩沖液(PBS)粉劑(上海信帆生物公司);十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)試劑盒(北京凱詩源生物公司);二喹啉甲酸(BCA)蛋白定量試劑盒(長沙艾碧維生物公司);聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)引物(武漢時勝生物公司)。

1.3細胞分組 將Tca8113細胞分為NC組、miR-34a NC組、miR-34a組,其中NC組不進行任何處理,然后分別將miR-34a模擬物對照物、miR-34a 模擬物染至miR-34a NC組、miR-34a組,轉(zhuǎn)染完成后24 h進行后續(xù)實驗。

1.4逆轉(zhuǎn)錄(RT)-PCR法檢測細胞中miR-34a及PI3K/AKT相關(guān)因子相對表達量 取細胞通過Trizol試劑進行裂解處理,提取細胞總RNA并進行檢測,隨后經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA,逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件:25 ℃ 10 min,48 ℃ 30 min,95 ℃ 5 min。將逆轉(zhuǎn)錄合成后的cDNA進行PCR,總反應(yīng)體積為20 μl,反應(yīng)條件:50 ℃ 2 min,95 ℃ 2 min,預(yù)變性后,95 ℃ 15 s,60 ℃ 60 s,40個循環(huán)。將GAPDH作為內(nèi)參,相對表達量公式為2-△△Ct。引物序列由武漢時勝生物公司合成。引物序列為:miR-34a:上游5′-GCCCTGGCAGTGTCTTAG-3′,下游5′-CAGTGCGTGTC-GTGGAGT-3′;PI3K上游5′-GCGTGACATGTAGGCTCTCAG-3′,下游5′-CTATACGGCCCGCACTGTAA-3′;AKT上游5′-ATGAACGACGTAGCCATTGTG-3′,下游5′-TT-GTAGCCAATAAAGGTGCCAT-3′;GAPDH上游5′-TCAAGAAGGT-GGTGAAGCAGG-3′,下游5′-TCAAAGGTG-GAGGAGTGGGT-3′。

1.5MTT法檢測細胞增殖能力 取細胞植于96孔板,同時調(diào)整細胞密度為5×107個/ml,隨后將其放入細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。分別于轉(zhuǎn)染后24、48、72 h時取20 μl MTT溶液加入96孔板,4 h后將原有的培養(yǎng)基去除,并加入150 μl二甲基亞砜(DMSO),使其充分混勻后通過酶標(biāo)儀在490 nm處檢測每孔的吸光度。

1.6流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡能力 將細胞植于6孔板并調(diào)整細胞密度為1×105個/ml,然后放入細胞培養(yǎng)箱中孵育,經(jīng)0.25%胰蛋白酶消化后以2 000 r/min的速度離心10 min,去除上清液后通過PBS沖洗。經(jīng)400 μl結(jié)合緩沖液重懸后加入5 ml膜聯(lián)蛋白Ⅴ-異硫氰酸熒光素(Annexin Ⅴ-FITC),充分混勻后置于流式細胞儀進行測定。

1.7劃痕實驗檢測細胞遷移能力 取細胞植于6孔板并調(diào)整細胞密度為1×105個/ml,通過10槍尖在垂直于孔板底部畫直線,然后通過PBS沖洗3次,每次5 min,在室溫下孵育24 h后拍照并對細胞進行計數(shù)。

1.8Transwell實驗檢測細胞侵襲能力 實驗前2 h需將小室濕化處理,2 h后將200 μl細胞懸液置于上室中,并于下室中加入細胞培養(yǎng)液(含10%胎牛血清),然后將Transwell小室置于培養(yǎng)基中孵育。24 h取PBS對小室進行沖洗并放入4%多聚甲醛中浸泡30 min。經(jīng)結(jié)晶紫染色后置于顯微鏡下觀察計數(shù)。

1.9Western印跡檢測細胞PI3K/AKT相關(guān)蛋白表達 取RIPA裂解液裂解培養(yǎng)細胞并對細胞總蛋白進行提取,然后通過考馬斯亮藍染色法(Bradford)對所提取的總蛋白進行定量。將30 μg蛋白樣品置于各個通道,經(jīng)SDS-PAGE分離蛋白質(zhì)并進一步轉(zhuǎn)至PVDF膜,電轉(zhuǎn)完成后采用含5%脫脂奶粉的封閉液封閉處理1 h,加一抗并于4 ℃環(huán)境下過夜;加二抗置于室溫下孵育1 h,隨后于曝光儀中曝光處理,經(jīng)ImageJ分析目標(biāo)蛋白PI3K、p-PI3K、AKT、p-AKT表達量,以β-actin作為內(nèi)參。

1.10統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS22.0軟件進行SNK-q檢驗、方差分析。

2 結(jié) 果

2.1miR-34a在不同細胞中的表達量比較 miR-34a在Tca8113、OEC-M1、OC3細胞中的表達(0.13±0.01、0.40±0.09、0.22±0.02)較HOK(1.00±0.15)明顯減少(P<0.05)。

2.2轉(zhuǎn)染后各組細胞miR-34a表達比較 miR-34a組細胞miR-34a表達(8.43±0.59)較NC組(1.00±0.01)明顯升高(P<0.05)。NC組細胞miR-34a表達與miR-34a NC組(1.05±0.01)差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

2.3各組不同時間點細胞增殖能力比較 在24、48、72 h時,miR-34a組細胞增殖率較NC組明顯減少(P<0.05)。NC組細胞增殖率與miR-34a NC組差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

2.4各組細胞凋亡能力比較 miR-34a組細胞凋亡率較NC組明顯增加(P<0.05)。NC組細胞凋亡率與miR-34a NC組差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表1、圖1。

圖1 各組細胞凋亡能力

2.5各組細胞遷移及侵襲能力比較 miR-34a組細胞遷移及侵襲細胞數(shù)均較NC組明顯減少(P<0.05)。NC組遷移及侵襲細胞數(shù)與miR-34a NC組差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表1、圖2。

表1 各組增殖率凋亡率、遷移與侵襲細胞數(shù)及PI3K、AKT mRNA表達比較

圖2 各組細胞遷移及侵襲(結(jié)晶紫染色,×200)

2.6各組細胞PI3K/AKT通路相關(guān)蛋白及mRNA表達 miR-34a組細胞PI3K、AKT mRNA及p-PI3K、p-AKT蛋白表達均較NC組明顯減少(P<0.05)。miR-34a NC組細胞PI3K、AKT mRNA及p-PI3K、p-AKT蛋白表達與NC組差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表1、表2、圖3。

表2 各組PI3K、p-PI3K、AKT、p-AKT蛋白達表達比較

圖3 各組PI3K、p-PI3K、AKT、p-AKT蛋白表達

3 討 論

口腔癌是世界范圍內(nèi)六大常見惡性腫瘤之一,其可誘發(fā)語言、呼吸等功能異常,給患者及家庭帶來沉重的負擔(dān)〔8〕。盧怡等〔9〕報道顯示,口腔癌形成與吸煙、飲酒、飲食結(jié)構(gòu)、遺傳等因素有關(guān)。目前臨床針對口腔癌的診斷及治療取得了進展,且患者臨床表現(xiàn)得到一定程度改善,然而患者臨床預(yù)后并未出現(xiàn)實質(zhì)性變化,其5年生存率在既往的2～3年中處于不變的情況,生存周期較短〔10,11〕。大量報道顯示,口腔癌形成及進展過程中涉及多基因、多因素相互影響〔12〕,然而關(guān)于其具體作用機制還未完全揭示,故揭示口腔癌形成及進展機制對口腔癌臨床診斷及治療尤為重要。近年來miRNAs成為腫瘤研究領(lǐng)域關(guān)注的熱點及重點,有報道顯示miRNAs在腫瘤形成及演變相關(guān)環(huán)節(jié)中扮演促癌因子或抑癌因子的角色,其可通過上調(diào)或下調(diào)靶基因表達進而參與腫瘤形成及進展過程〔13〕。miR-34a在低等生物至人類機體中均存在表達,其主要受腫瘤抑制基因p53控制,其已被證實在多類型實體瘤中表達量明顯下調(diào),可參與調(diào)控胃癌、肝癌細胞等生物學(xué)行為〔7,14〕。郝小軍等〔7〕采用慢病毒轉(zhuǎn)染的方式建立miR-34a過表達結(jié)腸癌細胞系,發(fā)現(xiàn)miR-34a可通過抑制上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化進而抑制結(jié)腸癌細胞增殖、侵襲及遷移,可為結(jié)直腸癌患者臨床治療提供分子靶點。有研究〔15〕結(jié)果顯示,miR-34a、miR-127-3p等6種miRNA均可分辨人乳頭狀瘤病毒陽性及陰性患者。但關(guān)于miR-34a在口腔癌發(fā)生過程中的作用機制研究較少,本研究結(jié)果說明,miR-34a可能是作為口腔癌候選腫瘤抑制基因發(fā)揮作用。由于miR-34a在Tca8113細胞中表達最低,且相較于其他口腔癌細胞,Tca8113細胞是一種低分化的腫瘤細胞系〔16〕,楊霞等〔17〕報道顯示,腫瘤細胞增殖及凋亡失調(diào)在腫瘤形成及演變過程中具有重要作用。Iwamoto等〔18〕表明,口腔癌細胞增殖率較凋亡率明顯增加,故抑制腫瘤細胞增殖并誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡在口腔癌治療過程中作用顯著。本研究結(jié)果證實,miR-34a可顯著阻斷口腔癌細胞增殖并誘導(dǎo)細胞凋亡,在阻斷腫瘤細胞增殖及進程中發(fā)揮重要作用,這與王康浴等〔19〕報道基本一致。Hong等〔20〕研究顯示,腫瘤細胞侵襲及遷移是導(dǎo)致患者預(yù)后不理想的主要原因。尹克等〔21〕證實,80%左右的腫瘤患者癌細胞發(fā)生侵襲及遷移,故在臨床治療需降低腫瘤細胞侵襲及遷移。本研究結(jié)果說明,miR-34a可顯著抑制口腔癌細胞遷移及侵襲能力。這與單連啟等〔13〕報道基本一致。PI3K/AKT通路是細胞生存的途徑之一,研究證實其在肺癌、肝癌等諸多實體瘤中異常激活〔22,23〕。在生長因子、激素等因素刺激下PI3K通路可被激活,其中AKT是該通路中極為重要的下游分子,當(dāng)其被激活后可通過磷酸化諸多轉(zhuǎn)錄因子、酶等進而參與控制細胞增殖、凋亡等生物學(xué)行為〔24〕。本研究結(jié)果說明,miR-34a可抑制PI3K/AKT信號通路激活進而作用于口腔癌細胞生物學(xué)進展。miR-34a在口腔癌細胞中呈低表達,上調(diào)其表達可抑制口腔癌細胞增殖、侵襲及遷移能力并促進口腔癌細胞凋亡,其作用機制可能是通過抑制PI3K/AKT通路實現(xiàn)的。