於睿 汪東亮

(宿遷市第一人民醫(yī)院 1高壓氧科,江蘇 宿遷 223800;2急診科)

創(chuàng)傷性腦損傷已成為歐美國家的第三大致死原因,雖然在我國發(fā)病率低于歐美國家,但近年來也呈上升趨勢〔1〕。老年人已進入衰老階段,顱骨硬化導(dǎo)致對外力的緩沖能力下降,更易發(fā)生骨折且腦損傷較嚴(yán)重〔2〕。創(chuàng)傷性腦損傷具有很高的致殘率和致死率,腦損傷后神經(jīng)功能變化情況直接影響患者的預(yù)后水平〔3〕。高壓氧治療雖已在臨床應(yīng)用了較長時間,取得了一定治療效果,能夠降低患者致殘率、減輕腦水腫程度、縮短意識障礙時間,提高患者生存率〔4〕;但關(guān)于高壓氧治療對老年創(chuàng)傷性腦損傷后神經(jīng)功能的改善作用及相關(guān)機制的研究仍十分少見。本研究通過建立老年大鼠創(chuàng)傷性腦損傷模型,探討高壓氧治療對創(chuàng)傷性腦損傷后神經(jīng)功能的改善作用及相關(guān)機制。

1 材料與方法

1.1動物與主要試劑 雄性SD大鼠90只,20～24月齡,平均體質(zhì)量(350±20)g,購于北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司,許可證號:SYXK(京)2022-0019,每日12 h光照,自由進食、進水。放射免疫沉淀(RIPA)裂解液購于北京賽文創(chuàng)新生物科技有限公司;鼠抗人腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)單克隆抗體、兔抗人缺氧誘導(dǎo)因子(HIF)-α單克隆抗體、兔抗人半胱氨酸蛋白酶(Caspase)-3單克隆抗體、鼠抗人B細胞淋巴瘤(Bcl)-2單克隆抗體、鼠抗人β-actin單克隆抗體及山羊抗鼠IgG、山羊抗兔IgG均購于上海銘修生物科技有限公司。

1.2創(chuàng)傷性腦損傷模型制作與分組 腹腔注射戊巴比妥鈉麻醉大鼠,劑量為50 mg/kg,在大鼠右側(cè)顱頂鉆開1個骨窗(直徑約5 mm),保持硬膜的完整性,使用自由落體打擊裝置(沖擊物30 g,自有落體高度15 cm)制作腦挫裂傷模型,骨蠟封閉骨窗,縫合頭皮,繼續(xù)常規(guī)喂養(yǎng)。將90只大鼠隨機分為假手術(shù)組(只開顱、不打擊,開顱后骨蠟封閉骨窗、縫合)、模型組、高壓氧治療組(造模后進行高壓氧治療),每組30只,各組內(nèi)再根據(jù)研究時間窗分為12、24、48、72、120 h 5個亞組,每組6只。

1.3高壓氧治療方案 使用高壓氧動物試驗艙進行治療,實驗前先使用純氧洗艙約5 min,檢測高壓氧艙中氧濃度高于96.6%,二氧化碳濃度低于0.05%后將高壓氧治療組放入艙內(nèi),設(shè)置壓力0.2 MPa,給氧方式選擇直排式,氧流量設(shè)置為5 L/min,溫度控制在23～25 ℃,連續(xù)純氧通風(fēng)30 min后勻速調(diào)節(jié)壓力至常壓后出艙,每次12 h,每日固定時間段進出艙。

1.4水迷宮實驗 待高壓氧治療組治療結(jié)束后,3組大鼠各取6只進行水迷宮定位巡航實驗和空間探索試驗。定位巡航實驗:實驗前1 d大鼠在水池中自由游泳90 s,實驗時間共5 d,每日訓(xùn)練4次,記錄大鼠逃離潛伏期。第5天末次定位巡航實驗結(jié)束后2 h進行空間探索試驗,將水池中的站臺取出,記錄120 s內(nèi)大鼠穿越原站臺位置的次數(shù)、首次到達原平臺時間。

1.5大鼠神經(jīng)運動功能評分 參照Yakovlev等〔5〕方法并略加調(diào)整,評分系統(tǒng)包括4種動作:①大鼠在切坡站立5 s,根據(jù)完成時斜坡角度依次為正常(45 °)、輕度不能(30 °)、中度不能(15 °)、重度不能(<15 °);②大鼠可通過寬度1 cm(正常)、2 cm(輕度不能)、3 cm的平衡木(中度不能)、無法通過寬度3 cm的平衡木(重度不能);③提起大鼠尾巴的同時,測量大鼠外傷對側(cè)前肢的反屈程度,依次計正常(90 °)、輕度不能(60 °)、中度不能(30 °)、重度不能(<30 °);④觀察大鼠自發(fā)運動時的轉(zhuǎn)圈行為,依次計正常(180 °)、輕度不能(120 °)、中度不能(60 °)、重度不能(<60 °)。正常計4分、輕度不能計3分、中度不能2分、重度不能1分。

1.6取材與處理 分別于腦外傷后12、24、48、72、120 h處死對應(yīng)亞組大鼠,取大腦組織,留取海馬組織后稱濕質(zhì)量,之后放入烤箱中105 ℃烘干24 h后稱干質(zhì)量,計算腦組織含水量(%)=(濕質(zhì)量-干質(zhì)量)/濕質(zhì)量×100%。海馬組織常規(guī)進行石蠟包埋,用于BDNF、HIF-α、Caspase-3、Bcl-2蛋白檢測。

1.7Western印跡檢測大鼠海馬區(qū)BDNF、HIF-α、Caspase-3、Bcl-2蛋白表達 放射免疫沉淀(RIPA)細胞裂解液提取3組海馬區(qū)BDNF、HIF-α、Caspase-3、Bcl-2蛋白濃度,行10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳,電轉(zhuǎn)法將目標(biāo)蛋白轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯膜,使用含5%脫脂牛奶的TBST緩沖液封閉1 h,滴加鼠抗人BDNF單克隆抗體(稀釋倍數(shù)1∶500)、兔抗人HIF-α單克隆抗體(稀釋倍數(shù)1∶1 000)、兔抗人Caspase-3單克隆抗體(稀釋倍數(shù)1∶300)、鼠抗人Bcl-2單克隆抗體(稀釋倍數(shù)1∶500)、鼠抗人β-actin單克隆抗體(稀釋倍數(shù)1∶2 000),4 ℃孵培育過夜,次日滴加山羊抗鼠IgG、山羊抗兔IgG,稀釋倍數(shù)1∶4 000,室溫下1 h,電化學(xué)發(fā)光法(ECL)顯影,使用ImageJ軟件讀取各條帶灰度值。

1.8統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS25.0軟件進行單因素方差分析、t檢驗。

2 結(jié) 果

2.1各組水迷宮實驗結(jié)果 各組第5天逃避潛伏期、穿越原站臺位置次數(shù)、首次到達原平臺時間差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01);其中模型組第5天的逃避潛伏期、首次到達原平臺時間明顯長于假手術(shù)組,穿越原站臺位置次數(shù)明顯少于假手術(shù)組;高壓氧治療組第5天逃避潛伏期、首次到達原平臺時間明顯短于假手術(shù)組,穿越原站臺位置次數(shù)明顯多于假手術(shù)組(均P<0.01)。見表1。

表1 各組水迷宮實驗結(jié)果

2.2造模后不同時間點各組神經(jīng)細胞凋亡情況比較 造模后24 h神經(jīng)細胞凋亡比例達到峰值,之后逐漸下降;其中模型組神經(jīng)細胞凋亡比例明顯高于假手術(shù)組,高壓氧治療組明顯低于模型組(P<0.05,P<0.01)。見表2。

表2 造模后不同時間點各組神經(jīng)細胞凋亡比較

2.3造模后不同時間點各組神經(jīng)運動功能評分比較 隨著造模后時間的延長模型組、高壓氧治療組神經(jīng)運動功能評分逐漸升高;其中模型組神經(jīng)運動功能評分明顯低于假手術(shù)組(P<0.05);造模后24 h起高壓氧治療組明顯高于模型組(P<0.05)。見表3。

2.4各組腦組織含水量比較 造模后第5天各組腦組織含水量差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.028);其中模型組明顯高于假手術(shù)組,高壓氧治療組明顯低于模型組(均P<0.05)。見表3。

表3 造模后不同時間點各組神經(jīng)運動功能評分及腦組織含水量比較

2.5各組海馬區(qū)BDNF、HIF-α、Caspase-3、Bcl-2蛋白表達水平比較 各組海馬區(qū)BDNF、HIF-α、Caspase-3、Bcl-2蛋白表達水平差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);模型組海馬區(qū)HIF-α、Caspase-3、Bcl-2蛋白表達水平明顯高于假手術(shù)組(P<0.01);高壓氧治療組大鼠海馬區(qū)BDNF、Bcl-2蛋白表達水平明顯高于模型組,HIF-α、Caspase-3蛋白表達水平明顯低于模型組(P<0.05)。見圖1、表4。

圖1 各組海馬區(qū)BDNF、HIF-α、Caspase-3、Bcl-2蛋白表達

表4 各組海馬區(qū)BDNF、HIF-α、Caspase-3、Bcl-2蛋白表達水平比較

3 討 論

高壓氧治療是臨床常用的治療手段,能夠促進腦外傷修復(fù),減輕腦水腫、神經(jīng)元變性,降低患者致殘率和死亡率〔6〕。但目前關(guān)于高壓氧治療對老年創(chuàng)傷性腦損傷后神經(jīng)功能的改善作用及相關(guān)機制鮮有研究報道。學(xué)習(xí)和記憶能力是人體最復(fù)雜的神經(jīng)活動之一,腦部神經(jīng)功能直接影響學(xué)習(xí)和記憶能力。動物行為學(xué)實驗中常用的工具包括Morris水迷宮、Y迷宮等,其中Morris水迷宮在空間記憶能力評估中優(yōu)勢明顯,屬于長期記憶,由海馬區(qū)決定〔7〕。本研究結(jié)果表明,經(jīng)高壓氧治療后大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力明顯改善。

神經(jīng)細胞凋亡參與了顱腦損傷后繼發(fā)損害的病理過程,是學(xué)習(xí)和記憶能力下降的主要原因之一〔8〕。當(dāng)創(chuàng)傷性腦損傷后腦組織水腫、血管床破壞等原因會引發(fā)局部腦缺血、缺氧,激活線粒體介導(dǎo)的細胞凋亡途徑,引發(fā)神經(jīng)細胞凋亡,神經(jīng)運動能力降低〔9〕。腦水腫程度隨著損傷時間的延長逐漸減輕,側(cè)支循環(huán)也逐漸建立,在一定程度上恢復(fù)了損傷區(qū)域腦組織供血、供養(yǎng),神經(jīng)細胞凋亡比例逐漸下降,神經(jīng)運動功能在一定程度上得到恢復(fù)〔10〕。高壓氧治療能夠有效抑制創(chuàng)傷性腦損傷后神經(jīng)細胞凋亡、促進神經(jīng)運動功能恢復(fù),可能與提高血氧濃度,促進血流速度,增加腦組織對氧的利用有關(guān)〔11〕。顱腦損傷會引發(fā)腦水腫,進而損傷腦組織,影響正常生理代謝和血氮水平〔12〕。本研究結(jié)果提示,老年大鼠創(chuàng)傷性腦損傷后腦水腫程度明顯提升,高壓氧治療有助于減輕腦水腫程度。

BDNF屬于神經(jīng)營養(yǎng)素家族,具有促神經(jīng)生長活性〔13〕。相關(guān)研究顯示,BDNF具有神經(jīng)保護作用,可促進受損神經(jīng)組織的修復(fù),減弱缺氧、自由基、細胞毒素等所致的腦損傷,作用機制包括維持鈣平衡和自由基代謝等〔14〕。BDNF低表達會減弱神經(jīng)元對損傷的抵抗作用,減弱神經(jīng)元修復(fù)、增生活性〔15〕。HIF-α表達水平與人體組織中的氧體積分數(shù)呈負相關(guān),正常氧體積分數(shù)下HIF-α低表達,很難被檢測,在缺氧狀態(tài)下其表達明顯升高,可用于反映腦損傷程度〔16〕。目前已發(fā)現(xiàn),線粒體途徑、死亡受體途徑等細胞內(nèi)凋亡信號通路,活化凋亡執(zhí)行因子Caspase-3是上述通路的重要步驟〔17〕。Bcl-2位于細胞器上游,調(diào)控下游Caspase-3活化,線粒體途徑中Bcl-2是抗凋亡的關(guān)鍵因子〔18〕。本研究結(jié)果提示,老年大鼠創(chuàng)傷性腦損傷后海馬區(qū)HIF-α、Caspase-3、Bcl-2高表達參與神經(jīng)功能損傷的發(fā)生與發(fā)展過程。高壓氧治療可通過上調(diào)海馬區(qū)BDNF、Bcl-2表達,下調(diào)HIF-α、Caspase-3表達,來發(fā)揮抑制創(chuàng)傷性腦損傷后海馬區(qū)神經(jīng)細胞凋亡,提高神經(jīng)元修復(fù)、增生活性,進而改善神經(jīng)功能。