馬曉菲 杜艷茹 張曉利 崔建從 吳佳欣

(1河北省中醫(yī)院,河北 石家莊 050000;2河北省中醫(yī)藥科學(xué)院)

功能性腹瀉(FD)是常見的消化系統(tǒng)疾病之一,主要臨床癥狀為排便次數(shù)增多和糞便性狀改變,其體現(xiàn)了腸道的動(dòng)力亢進(jìn)〔1〕。流行病學(xué)研究表明,FP在全世界范圍內(nèi)發(fā)病率相對(duì)較高,我國顯著低于歐美國家,但顯著高于亞洲其他國家,嚴(yán)重影響了人類健康和生存質(zhì)量〔2〕。目前臨床常用治療腹瀉的藥物為蒙脫石散,其雖能對(duì)消化道黏膜進(jìn)行修復(fù),改善臨床癥狀,但單一用藥見效較慢〔3〕。與西醫(yī)對(duì)癥治療相比,中醫(yī)通過對(duì)患者進(jìn)行整體調(diào)節(jié),在FD治療中優(yōu)勢(shì)顯著。芳香化濁調(diào)氣法是從既往臨床研究經(jīng)驗(yàn)中總結(jié)而來,通過提脾運(yùn)脾、調(diào)暢氣機(jī)對(duì)患者進(jìn)行治療,是脾氣健運(yùn),達(dá)到泄瀉自止的效果〔4〕。研究發(fā)現(xiàn),FD的發(fā)病因素中空腸對(duì)水運(yùn)轉(zhuǎn)的異常是主要原因之一,其中水通道蛋白(AQPs)是影響水液運(yùn)轉(zhuǎn)的重要蛋白通道之一,在腸道內(nèi)廣泛表達(dá),可調(diào)控腸道水液代謝,AQP3是AQPs常見的一種亞型〔5〕。5-羥色胺(HT)大部分表達(dá)于胃腸消化系統(tǒng)中,介導(dǎo)人體胃腸活動(dòng)〔6〕。研究發(fā)現(xiàn),5-HT可促進(jìn)胃腸道運(yùn)動(dòng)、參與內(nèi)臟感覺神經(jīng)傳導(dǎo)、胃腸道對(duì)食物和水的吸收、分泌胃腸道消化液等作用〔7〕。但AQP3和5-HT在FP大鼠中的作用機(jī)制目前尚未見文獻(xiàn)報(bào)道,本研究通過制備FP大鼠模型,并給予芳香化濁調(diào)氣法干預(yù),觀察其對(duì)大鼠AQP3、5-HT和血管活性腸肽(VIP)的影響。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 60只雄性Wistar大鼠購自北京維通利華技術(shù)有限公司,動(dòng)物合格證號(hào):SCXK(京)2017-0003。3周齡,SPF級(jí),體質(zhì)量190～210 g,飼養(yǎng)于河北省中醫(yī)院SPF級(jí)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心,保持室溫18～25 ℃,相對(duì)濕度50%～60%,普通級(jí)動(dòng)物飼料飼養(yǎng),飼養(yǎng)期間大鼠自由飲水進(jìn)食,關(guān)照周期12 h∶12 h。大鼠均適應(yīng)性飼養(yǎng)1 w后進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2藥物 芳香化濁調(diào)氣法由茯苓15 g、紫豆蔻15 g、百合15 g、白芍15 g、雞內(nèi)金15 g、藿香12 g、白扁豆12 g、大腹皮12 g、當(dāng)歸12 g、川芎9 g、砂仁9 g、炒白術(shù)9 g、烏藥9 g、木香9 g組成(云南鴻翔一心堂藥液股份有限公司),由醫(yī)院制劑室加水煎煮10 min,經(jīng)紗布過濾,于50 ℃環(huán)境下通過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸發(fā)至終濃度1.5 g/ml,于4 ℃環(huán)境保存?zhèn)溆?鹽酸小檗堿片(云南明鏡亨利制藥有限公司);終濃度為0.3 g/ml的番瀉葉煎液(成都中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院門診中藥房)。

1.3試劑和儀器 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)試劑盒(美國Rapidbio公司);生理鹽水(成都科倫藥業(yè)有限公司);SYNERGY H1型多功能全波段酶標(biāo)儀(英國Bio Tek公司);RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠)。

1.4分組 將60只大鼠隨機(jī)分為正常組(正常大鼠不做任何干預(yù),給藥時(shí)給予等量生理鹽水干預(yù)),模型組(FD大鼠模型給予生理鹽水灌胃),藥物1組(模型組給予含生藥0.5 g/kg芳香化濁調(diào)氣方灌胃),藥物2組(模型組給予芳香化濁調(diào)氣法灌胃干預(yù),劑量為生藥1.0 g/kg),藥物3組(模型組給予芳香化濁調(diào)氣法灌胃干預(yù),劑量為生藥1.5 g/kg),對(duì)照組(模型組灌胃16.2 mg/kg鹽酸小檗堿干預(yù)),每組10只,各組均1 d/次,連續(xù)7 d,第21天后進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.5模型制備 模型組、藥物1組、藥物2組、藥物3組和對(duì)照組制備FD大鼠模型。大鼠均單籠飼養(yǎng),于籠下鋪濾紙,給予大鼠25 ℃番瀉葉煎劑灌胃,計(jì)量為每天3 ml/次,均連續(xù)灌胃14 d。于第15天停止灌胃,各組均正常飲食進(jìn)水,觀察第14～28天時(shí)大鼠的變化情況。評(píng)估造模前后大鼠糞便性狀,包括24 h總便粒數(shù)、稀便數(shù)、稀便率、稀便級(jí)、腹瀉指數(shù),以判斷腹瀉模型制備是否成功。

1.6各組糞便性狀指標(biāo)觀察 觀察并記錄籠下濾紙上大鼠糞便形狀、總顆粒數(shù)、稀便顆粒數(shù)及濾紙上污跡范圍,濾紙1 h更換一次,共觀察6 h。

1.6.1Bristol糞便性狀(BSS)評(píng)分 BSS評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)依據(jù)Bristol糞便性狀分型判斷圖,共分為7型,依次對(duì)應(yīng)分值為1～7分,1型為分散的干球樣便1分;2型為2分:團(tuán)塊樣便;3型為3分:干裂的香腸樣便;4型為4分:柔軟的香腸樣便;5型為5分:柔軟的團(tuán)塊樣便;6型為6分:糊狀樣便;7型為7分:水樣便。

1.6.2稀便率 根據(jù)濾紙上的污跡程度判斷稀便率,稀便率=稀便的粒數(shù)除以大便的總粒數(shù)。

1.6.3腹瀉指數(shù) 腹瀉指數(shù)=稀便率×稀便級(jí)。稀便級(jí)的判定方式:以濾紙上污跡直徑確定稀便級(jí)數(shù),共分為4級(jí):1級(jí)<1 cm;2級(jí)≥1 cm且<2 cm;3級(jí)≥2 cm且<3 cm;4級(jí)≥3 cm,稀便級(jí)=該鼠所有稀便級(jí)數(shù)之和/稀便次數(shù)。

1.7血清及組織中VIP含量檢測(cè) 糞便性狀指標(biāo)觀察后麻醉各組大鼠,取腹主動(dòng)脈血3 ml,于4 ℃環(huán)境下3 000 r/min離心20 min,收集上清液,用ELISA試劑盒檢測(cè)血清中VIP含量。取血后打開大鼠腹腔,分別取胃竇、十二指腸、結(jié)腸和下丘腦組織,生理鹽水沖洗,濾紙吸干表面水分,用生理鹽水制備成組織勻漿,離心組織勻漿收集上清液。用全自動(dòng)酶標(biāo)儀檢測(cè)450 nm處各孔的吸光度(D)值,計(jì)算處對(duì)應(yīng)的濃度值。

1.8腸道組織中5-HT含量檢測(cè) 取血結(jié)束后,處死各組部分大鼠,開腹后快速取出回腸、近端結(jié)腸和遠(yuǎn)端結(jié)腸(距肛門0.5 cm)各1 cm標(biāo)本,將組織切碎后用生理鹽水制備呈組織勻漿,離心取上清液。采用ELISA法檢測(cè)腸道組織中5-HT水平。

1.9免疫熒光檢測(cè)結(jié)腸組織中AQP3表達(dá) 處死各組部分大鼠,打開腹腔,取距離盲腸3 cm處完整的結(jié)腸,將結(jié)腸組織固定于10%多聚甲醛溶液中,石蠟包埋,切片機(jī)切成4 μm組織切片,脫蠟后置于乙二胺四乙酸(EDTA)抗原修復(fù)緩沖液中,置于微波爐內(nèi)進(jìn)行抗原修復(fù)。將自發(fā)熒光淬滅劑加入組織周圍反應(yīng)5 min,沖洗后用血清白蛋白(BSA)孵育30 min。在組織中加入AQP3一抗(1∶200),孵育于4 ℃濕盒內(nèi);洗滌后加入二抗孵育50 min。再次加入二異丙醇胺(DIPA)染液中避光室溫孵育10 min。用抗熒光淬滅劑封片劑封片,置于熒光顯微鏡下觀察。4,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)染色細(xì)胞核在紫外線照射下呈藍(lán)色,陽性表達(dá)為相應(yīng)熒光素標(biāo)記的紅色。

1.10統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用Graphpad priam8.0軟件進(jìn)行單因素方差分析、LSD-t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1一般情況觀察 造模后大鼠出現(xiàn)活動(dòng)減少,精神萎靡,呈縮肩拱背樣,體質(zhì)量下降,毛色無澤,糞便濕軟或不成形;藥物干預(yù)后各組一般狀態(tài)得到明顯改善。

2.2各組糞便性狀指標(biāo)比較 與正常組相比,模型組BSS評(píng)分、稀便率和腹瀉指數(shù)均顯著增加(P<0.05);與模型組相比,藥物1組、藥物2組和藥物3組均不同程度降低,且藥物3組降低最為顯著(P<0.05);藥物3組和對(duì)照組較無顯著差異(P>0.05),見表1。

2.3各組腸道組織中5-HT含量比較 模型組回腸和結(jié)腸組織中5-HT含量較正常組顯著增加(P<0.05);藥物1組、藥物2組和藥物3組較模型組顯著降低,且藥物3組含量最低(P<0.05);藥物3組和對(duì)照組相比較無顯著差異(P>0.05),見表1。

2.4各組結(jié)腸組織中AQP3表達(dá)比較 模型組結(jié)腸組織中AQP3表達(dá)明顯低于正常組(P<0.05);與模型組相比,藥物1組、藥物2組和藥物3組均明顯增加,且藥物3組增加最顯著(P<0.05);藥物3組較對(duì)照組無明顯差異(P>0.05),見表1、圖1。

表1 各組BSS評(píng)分、稀便率和腹瀉指數(shù)、5-HT、AQP3水平比較

圖1 各組結(jié)腸組織中AQP3表達(dá)比較(免疫熒光染色,×400)

2.5各組血清及組織中VIP含量比較 模型組血清及胃竇、十二指腸、結(jié)腸、下丘腦組織中VIP含量較正常組顯著降低(P<0.05);與模型組相比,藥物1組、藥物2組和藥物3組均顯著升高,且藥物3組變化最顯著(P<0.05);藥物3組和對(duì)照組比較無明顯差異(P>0.05),見表2。

表2 各組血清及胃竇、十二指腸、結(jié)腸、下丘腦組織中VIP含量比較

3 討 論

FD在全球范圍內(nèi)有較高發(fā)病率,是常見的消化道功能性疾病,且在中國的發(fā)病率較其他亞洲國家明顯升高。FD不僅病程長(zhǎng)且反復(fù)發(fā)作,不僅嚴(yán)重影響患者的生活,且對(duì)國家和社會(huì)的經(jīng)濟(jì)造成沉重負(fù)擔(dān)〔8〕。目前現(xiàn)代醫(yī)學(xué)對(duì)FD的治療有一定的短期療效,但停藥后極易復(fù)發(fā),使現(xiàn)代醫(yī)學(xué)在治療FD時(shí)有一定限制〔9〕。中醫(yī)將FD歸屬為“泄瀉”范疇,脾病濕盛是其主要病機(jī),外邪、內(nèi)傷以致臟腑虛衰是該病出現(xiàn)的主要原因〔10〕。濁毒辨證理論認(rèn)為,濕為濁之源,濁為濕之甚,二者相互轉(zhuǎn)化,積濕為濁,濕遇毒而濁化,濁毒互結(jié),久之則氣機(jī)不暢、日久痰濁,從而損傷肺腑,以致胃失和降、脾不升清、氣滯絡(luò)阻、氣滯絡(luò)阻,由此可知,濁毒為其致病關(guān)鍵,治則以化濁解毒、清熱通絡(luò)〔11〕。芳香化濁調(diào)氣法中的茯苓利水消腫、健脾滲濕,紫豆蔻開胃消食、化濕消痞,百合清心安神、養(yǎng)陰潤(rùn)肺,白芍養(yǎng)血斂陰、平抑肝陽,雞內(nèi)金澀精止遺、消食健胃,藿香芳香化濁、解暑止嘔,白扁豆健脾利濕、止瀉淡滲,大腹皮利水消腫、行氣寬中,當(dāng)歸潤(rùn)腸通便、補(bǔ)血活血,川芎活血行氣,祛風(fēng)燥濕,砂仁溫中止瀉、化濕行氣,炒白術(shù)燥濕利水、健脾益氣,烏藥溫腎散寒、行氣止痛,木香調(diào)中導(dǎo)滯、和胃健脾,諸藥合用共奏燥濕化濁、健脾止瀉效果?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究顯示,白扁豆中的有效成分能夠起到抗菌、抗病毒效果,能夠改善機(jī)體免疫功能,起到解毒、止瀉、止嘔效果。

中醫(yī)對(duì)FD的診斷標(biāo)準(zhǔn)為糞便清稀,大便次數(shù)增加,甚至水樣便;或表現(xiàn)為大便次數(shù)不多,糞質(zhì)清稀;或表現(xiàn)為瀉下完谷不化,有反復(fù)發(fā)作病史。本研究結(jié)果提示芳香化濁調(diào)氣法可改善FD大鼠糞便性狀。馬曉菲等〔12〕研究證實(shí),芳香化濁調(diào)氣法在FD患者治療中應(yīng)用可提高臨床療效,降低中醫(yī)證候積分和復(fù)發(fā)率,有效改善生活質(zhì)量。

研究發(fā)現(xiàn),VIP對(duì)胃酸的分泌和胃蠕動(dòng)均有一定抑制作用,不僅可抑制胃運(yùn)動(dòng),還能有效對(duì)胃排空進(jìn)行減緩〔13〕。本研究結(jié)果顯示,芳香化濁調(diào)氣法可增加血清中和組織VIP含量,減弱腹瀉大鼠胃蠕動(dòng)。胡瑩等〔14〕研究證實(shí),可通過降低腹瀉大鼠腸推進(jìn)率,促進(jìn)VIP的釋放緩解腸道平滑肌收縮,改善腹瀉。5-HT是一種重要的神經(jīng)遞質(zhì),胃腸道運(yùn)動(dòng)和胃腸道分泌功能有一定調(diào)節(jié)作用,當(dāng)腸道內(nèi)聚集大量的5-HT時(shí)會(huì)導(dǎo)致中毒反應(yīng),進(jìn)而導(dǎo)致胃腸道動(dòng)力、分泌功能性及內(nèi)臟高敏感性異常,介導(dǎo)慢性便秘、腹瀉等胃腸道功能性疾病的發(fā)生〔15〕。研究發(fā)現(xiàn),腹瀉型腸易激綜合征大鼠模型中5-HT和褪黑素水平均高于空白組,腸道內(nèi)大量5-HT可以使腸道收縮力增強(qiáng),收縮幅度降低,通過降低腸道內(nèi)5-HT水平可控制胃腸道的運(yùn)動(dòng)功能〔16〕。本研究結(jié)果顯示,芳香化濁調(diào)氣法可降低FD大鼠腸道內(nèi)5-HT水平,進(jìn)而對(duì)腸道的運(yùn)動(dòng)功能進(jìn)行調(diào)節(jié),與上述研究結(jié)果一致。

研究發(fā)現(xiàn),AQPs可調(diào)控胃腸道內(nèi)的水液代謝,可維持機(jī)體內(nèi)水液含量保持在相對(duì)穩(wěn)定的狀態(tài)〔17〕。AQPs家族在空腸黏膜上皮細(xì)胞中廣泛分布,其中AQP3是常見的亞型之一,可調(diào)節(jié)機(jī)體水的分泌、吸收及細(xì)胞內(nèi)外水的平衡等。文獻(xiàn)顯示,FD中AQP3表達(dá)明顯低于正常大鼠,且腹瀉越嚴(yán)重結(jié)腸AQP3的表達(dá)水平越低〔18〕。由此可見,腸道內(nèi)AQP3水平降低可導(dǎo)致腸道水液重復(fù)吸收功能障礙的發(fā)生〔19〕。本研究結(jié)果顯示,功能性腹瀉大鼠腸道中AQP3水平顯著降低,芳香化濁調(diào)氣法可明顯增加FD大鼠腸道中AQP3水平,進(jìn)而增加腸道水液的吸收功能,調(diào)節(jié)水分轉(zhuǎn)運(yùn),進(jìn)而起到改善腹瀉的作用。張琦等〔20〕研究證實(shí),FD模型大鼠腸道內(nèi)AQP3、AQP8水平顯著降低,通過增加AQP3、AQP8水平可明顯增加腸道對(duì)水的吸收功能,調(diào)節(jié)腸內(nèi)外環(huán)境失衡。

綜上,芳香化濁調(diào)氣法可增加FD大鼠AQP3水平和FD水平,減少5-HT水平,對(duì)腸道水液吸收功能和運(yùn)動(dòng)功能進(jìn)行改善,進(jìn)而改善腹瀉。