湯華 陳少軍 韓晶 夏開來 姜萊 鄭剛

(宜昌市第一人民醫(yī)院神經(jīng)外科,湖北 宜昌 443099)

腦血管痙攣常是蛛網(wǎng)膜下腔出血(SAH)的嚴(yán)重并發(fā)癥之一,可造成患者大腦動(dòng)脈平滑肌持續(xù)收縮,引發(fā)腦組織嚴(yán)重缺血缺氧,進(jìn)而導(dǎo)致嚴(yán)重的神經(jīng)功能障礙,是SAH患者殘疾、死亡的主要原因〔1,2〕。SAH發(fā)生后,血液中紅細(xì)胞溶解,釋放出血紅蛋白和血紅素,誘導(dǎo)腦組織中氧自由基過量生成,引發(fā)嚴(yán)重的氧化應(yīng)激,進(jìn)而導(dǎo)致腦血管痙攣,且清除氧自由基,增強(qiáng)抗氧化能力是防治SAH后血管痙攣的有效方法〔3,4〕。銀杏總黃酮具有擴(kuò)張腦血管、促進(jìn)血液循環(huán)、增加血流量的藥理作用,還可增強(qiáng)腦細(xì)胞耐缺氧能力,減輕腦水腫,改善神經(jīng)功能損傷〔5〕;有研究發(fā)現(xiàn),使用銀杏葉提取物聯(lián)合奧拉西坦可改善急性腦出血患者認(rèn)知功能,提高其生活質(zhì)量〔6〕,因而推測銀杏總黃酮可能對SAH后血管痙攣具有較好的療效。細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(ERK)/核因子(NF)-κB信號(hào)參與調(diào)控組織細(xì)胞凋亡、炎癥、氧化應(yīng)激等病理過程,增強(qiáng)ERK磷酸化,可促使NF-κB p65核轉(zhuǎn)位,促進(jìn)活性氧產(chǎn)生,引發(fā)嚴(yán)重的氧化應(yīng)激反應(yīng);阻滯ERK/NF-κB信號(hào)傳導(dǎo),可減少炎性介質(zhì)合成釋放,減弱炎性細(xì)胞浸潤,顯著降低氧化應(yīng)激水平〔7,8〕。并且有研究證明,抑制NF-κB信號(hào)激活,可緩解SAH后血管痙攣癥狀〔9〕,所以ERK/NF-κB信號(hào)可能是SAH后血管痙攣的一個(gè)潛在治療靶點(diǎn)。本文探討銀杏總黃酮是否可通過ERK/NF-κB信號(hào)通路影響兔SAH后血管痙攣。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 雄性家兔購買于湖南太平生物科技有限公司,生產(chǎn)許可證號(hào):SCXK(湘)2015-0004,體質(zhì)量2.4～3.0 kg。在宜昌市第一人民醫(yī)院動(dòng)物中心飼養(yǎng),溫度23～25 ℃,濕度55%～60%,參照《關(guān)于善待實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的指導(dǎo)性意見》規(guī)范飼養(yǎng),飼養(yǎng)房中保證安靜、清潔、通風(fēng)良好。

1.2試劑與儀器 銀杏總黃酮(純度50%)由河南中醫(yī)藥大學(xué)中藥實(shí)驗(yàn)室惠贈(zèng);3,4,5,4′-四甲氧基二苯乙烯(DMU-212,HY-137977)購于美國MedChemexpress公司;尼氏染色液(E607316-0100)、蘇木素-伊紅(HE)染色試劑盒(E607218-0200)、細(xì)胞核/質(zhì)蛋白抽提試劑盒(C510001-0050)、二喹啉甲酸(BCA)蛋白質(zhì)定量檢測試劑盒(C503021-0501)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)、丙二醛(MDA)含量檢測試劑盒(D799762-0100)購于上海生工生物工程股份有限公司;蛋白裂解液(P0013K)購于上海碧云天公司;山羊抗兔ERK一抗(26-5012)、山羊抗兔磷酸化(p)-ERK一抗(26-5013)、山羊抗兔NF-κB p65一抗(29-70006A)、山羊抗兔增殖細(xì)胞核抗原(PCNA)一抗(10-M1083)購于上海信裕生物科技有限公司;小鼠抗兔GAPDH一抗(ab125247)、驢抗小鼠二抗(ab6820)、驢抗山羊二抗(ab6885)購于美國Abcam公司等。經(jīng)顱多普勒血流分析儀(型號(hào)MultiDopX)購于德國DWL公司;冷凍切片機(jī)(型號(hào)6250)購于達(dá)科為(深圳)醫(yī)療設(shè)備有限公司;生物顯微鏡(型號(hào)XSP-8CA)購于上海光學(xué)儀器一廠;酶標(biāo)儀(型號(hào)DNM-9602G)購于北京普朗新技術(shù)有限公司;DYY-3C型雙穩(wěn)定時(shí)電泳儀電源、DYCZ-20H型高通量垂直電泳儀、DYCZ-40S型四板轉(zhuǎn)印電泳儀、WD-9413B型凝膠成像分析系統(tǒng)購于北京六一生物科技有限公司等。

1.3SAH兔模型制備及分組給藥 制備SAH兔模型的方法參照文獻(xiàn)〔10〕:自耳緣靜脈注射3%的戊巴比妥鈉溶液麻醉家兔(劑量為1 ml/kg),俯臥位固定在立體定位儀,頭部備皮消毒,切開頭皮,暴露顱骨枕大孔,以注射器針頭刺入直至枕大池,吸出1～2 ml腦脊液,自耳緣靜脈取血,注入枕大池,保持兔頭部處于低位20～30 min,然后止血、消毒,縫合切口,放入籠中繼續(xù)飼養(yǎng)48 h,以同樣方法第二次注入自身血液,SAH模型構(gòu)建完成,隨機(jī)分為模型組、銀杏總黃酮(156 mg/kg)組、DMU-212(ERK激活劑,18 mg/kg)組、銀杏總黃酮(156 mg/kg)+DMU-212(18 mg/kg)組,每組6只。另取6只家兔以同樣方法手術(shù)處理,只是將血液替換為等量無菌生理鹽水,設(shè)定為假手術(shù)組。

將銀杏總黃酮、DMU-212溶于生理鹽水,分別制成31.2 mg/ml的銀杏總黃酮〔11〕藥液、3.6 mg/ml的DMU-212〔12〕藥液、銀杏總黃酮(31.2 mg/ml)+DMU-212(3.6 mg/ml)的混合藥液,給藥組兔以5 ml/kg的劑量灌胃給藥,假手術(shù)組和模型組兔以等劑量生理鹽水灌胃,每天上午給藥1次,共持續(xù)7 d。

1.4兔神經(jīng)功能檢測 第7天給藥后24 h,觀察家兔行為活動(dòng),參照文獻(xiàn)〔13〕方法進(jìn)行神經(jīng)功能評分:活動(dòng)正常,無神經(jīng)功能障礙,1分;不愿活動(dòng)或嗜睡,有疑似或輕度神經(jīng)功能障礙,2分;跛行或四肢無力,呈中度神經(jīng)障礙,3分;四肢癱軟或行走障礙,呈重度神經(jīng)障礙,4分。

1.5兔基底動(dòng)脈血流速度測定 神經(jīng)功能檢測后,使用經(jīng)顱多普勒血流分析儀測定兔基底動(dòng)脈血流速度,將兔麻醉,以俯臥位置于操作臺(tái),暴露頸部,將連續(xù)波探頭放入枕大孔處,深達(dá)28～30 mm,頻率設(shè)為2.5 MHz,得到清晰的血流信號(hào),統(tǒng)計(jì)平均血流速度。

1.6標(biāo)本收集 兔基底動(dòng)脈血流速度測定后,處死家兔,斷頭取出大腦,分離出海馬組織,并剪下含基底動(dòng)脈的腦組織,使用蒸餾水漂洗、OCT包埋后,分別放入凍存盒,以液氮進(jìn)行冰凍,取出凍好的組織塊,放入冰凍切片機(jī)中切為約4 μm厚的切片備用;剩余腦組織剪取約1 g,采用細(xì)胞核/質(zhì)蛋白抽提試劑盒分別提取細(xì)胞核蛋白和細(xì)胞質(zhì)蛋白,經(jīng)BCA蛋白質(zhì)定量檢測試劑盒對其蛋白濃度定量后,保存在-80 ℃冰箱;剩余腦組織再剪取約0.5 g,儲(chǔ)存在液氮中。

1.7兔腦組織海馬神經(jīng)元形態(tài)檢測及兔大腦基底動(dòng)脈痙攣情況檢測1.6中海馬組織及含基底動(dòng)脈的腦組織切片,放入冰丙酮中固定,海馬組織切片置于尼氏染色液中染色,含基底動(dòng)脈的腦組織切片采用HE染色試劑盒染色,均參照各自說明書指導(dǎo)步驟進(jìn)行操作,在生物顯微鏡下觀察染色情況,采用軟件Image Pro Plus6.0分析測量含基底動(dòng)脈的腦組織切片中動(dòng)脈血管的管壁厚度及管腔橫截面積。

1.8兔腦組織氧化應(yīng)激因子SOD、GSH-Px、MDA水平檢測1.6中儲(chǔ)存在液氮中的腦組織,加入蛋白裂解液,勻漿制成勻漿液,4 ℃離心后,取上清以試劑盒測定SOD、GSH-Px、MDA水平,參照各自說明書指導(dǎo)步驟進(jìn)行操作。

1.9兔腦組織ERK/NF-κB通路蛋白表達(dá)情況檢測1.6中保存在-80 ℃冰箱的蛋白樣品液,經(jīng)煮沸5 min變性后,各取20 μg蛋白,于110 V恒壓下電泳后濕轉(zhuǎn),將轉(zhuǎn)印膜放入3%牛血清白蛋白溶液中,37 ℃孵育2 h,然后將膜取出,分別以山羊抗兔ERK、p-ERK、NF-κB p65、PCNA一抗和小鼠抗兔GAPDH一抗溶液4 ℃孵育12 h,取出膜,置于Tris-HCl+吐溫-20緩沖鹽溶液(TBST)中漂洗3遍,以相對應(yīng)的驢抗山羊二抗、驢抗小鼠二抗溶液37 ℃孵育2 h,取出膜,再次漂洗3遍,經(jīng)化學(xué)發(fā)光試劑顯色,放入凝膠成像分析系統(tǒng)中采集圖像,并以ImageJ軟件分析圖像中蛋白條帶灰度值,得出各組p-ERK/ERK、核內(nèi)NF-κB p65蛋白相對表達(dá)量。

1.10統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS24.0軟件進(jìn)行方差分析、LSD-t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1各組神經(jīng)功能評分 與假手術(shù)組相比,模型組神經(jīng)功能評分明顯升高(P<0.05);與模型組、銀杏總黃酮+DMU-212組相比,銀杏總黃酮組神經(jīng)功能評分明顯降低,DMU-212組兔神經(jīng)功能評分明顯升高(均P<0.05)。見表1。

2.2各組基底動(dòng)脈血流速度 與假手術(shù)組相比,模型組基底動(dòng)脈血流速度明顯升高(均P<0.05);與模型組、銀杏總黃酮+DMU-212組相比,銀杏總黃酮組基底動(dòng)脈血流速度降低,DMU-212組基底動(dòng)脈血流速度升高(均P<0.05)。見表1。

2.3各組腦組織氧化應(yīng)激因子 與假手術(shù)組相比,模型組腦組織MDA水平明顯升高,SOD、GSH-Px水平明顯降低(均P<0.05)。與模型組、銀杏總黃酮+DMU-212組相比,銀杏總黃酮組腦組織MDA水平明顯降低,SOD、GSH-Px水平明顯升高;DMU-212組腦組織MDA水平明顯升高,SOD、GSH-Px水平明顯降低(均P<0.05)。見表1。

2.4各組大腦基底動(dòng)脈痙攣情況 與假手術(shù)組相比,模型組基底動(dòng)脈表現(xiàn)出嚴(yán)重的痙攣現(xiàn)象,管壁明顯增厚,管腔橫截面積明顯減小(均P<0.05)。與模型組、銀杏總黃酮+DMU-212組相比,銀杏總黃酮組基底動(dòng)脈痙攣減輕,管壁明顯變薄,管腔橫截面積明顯增大;DMU-212組基底動(dòng)脈痙攣加重,管壁明顯增厚,管腔橫截面積明顯減小(均P<0.05)。見表1、圖1。

表1 各組神經(jīng)功能評分、大腦基底動(dòng)脈管壁厚度、管腔橫截面積、基底動(dòng)脈血流速度、SOD、GSH-Px、MDA水平

圖1 5組各組大腦基底動(dòng)脈(HE染色,×200)

2.5各組大腦海馬神經(jīng)元形態(tài) 假手術(shù)組大腦海馬神經(jīng)元輪廓清晰可見,排列整齊致密;模型組大腦海馬神經(jīng)元萎縮變小,數(shù)量明顯減少,排列紊亂;與模型組、銀杏總黃酮+DMU-212組相比,銀杏總黃酮組上述病理情況改善,DMU-212組上述病理情況加重。見圖2。

圖2 各組大腦海馬神經(jīng)元(尼氏染色,×200)

2.6各組腦組織ERK/NF-κB通路蛋白表達(dá) 與假手術(shù)組比較,模型組腦組織ERK/NF-κB通路相關(guān)蛋白p-ERK/ERK、核內(nèi)NF-κB p65蛋白表達(dá)明顯升高(P<0.05)。與模型組、銀杏總黃酮+DMU-212組,銀杏總黃酮組上述指標(biāo)表達(dá)降低(P<0.05);DMU-212組腦組織上述指標(biāo)表達(dá)升高(P<0.05)。見圖3、表2。

1～5:假手術(shù)組、模型組、銀杏總黃酮組、DMU-212組、銀杏總黃酮+DMU-212組

表2 各組腦組織ERK/NF-κB通路蛋白相對表達(dá)水平

3 討 論

SAH是神經(jīng)外科高發(fā)急癥,大多因動(dòng)脈瘤破裂引起,腦血管痙攣是其常見并發(fā)癥,可引發(fā)患者腦梗死,導(dǎo)致腦組織嚴(yán)重?fù)p傷,損害神經(jīng)功能,是SAH后致死、致殘,造成不良預(yù)后的主要因素,對其發(fā)生機(jī)制進(jìn)行深入研究,找到安全有效的防治方法,具有重大臨床意義〔14,15〕。本研究結(jié)果表明,SAH可降低抗氧化因子水平,增強(qiáng)氧化能力,引發(fā)兔大腦嚴(yán)重的氧化應(yīng)激反應(yīng),導(dǎo)致動(dòng)脈血管痙攣、血流速度增快,進(jìn)而造成神經(jīng)功能障礙,揭示兔SAH模型建立成功。

氧自由基引發(fā)的氧化應(yīng)激是導(dǎo)致SAH后腦血管痙攣的主要致病機(jī)制,抑制自由基產(chǎn)生,對抗氧化應(yīng)激反應(yīng)是緩解SAH后腦損傷的有效治療手段〔15,16〕。銀杏葉是用于止痛通絡(luò)、活血化瘀的常用中草藥,具有抗炎、抗腫瘤、擴(kuò)張血管、抗氧化的藥理活性,可保護(hù)腦組織免于缺血缺氧性損傷,黃酮類化合物是其主要活性成分,研究發(fā)現(xiàn),銀杏葉總黃酮可顯著抑制腦缺血后氧化應(yīng)激反應(yīng),改善腦組織病理改變,減輕腦損傷,以銀杏葉提取物聯(lián)合胞磷膽堿鈉片還可治療急性腦出血,改善患者神經(jīng)功能缺損癥狀〔17,18〕,由此可認(rèn)為,銀杏總黃酮可能通過減輕氧化應(yīng)激而緩解SAH后血管痙攣。本研究結(jié)果表明,銀杏總黃酮可提高抗氧化因子水平,抑制氧化應(yīng)激反應(yīng),緩解動(dòng)脈血管痙攣,減輕腦組織神經(jīng)元損傷,改善神經(jīng)功能。

ERK/NF-κB通路是機(jī)體調(diào)控氧化能力、免疫炎癥、血流動(dòng)力學(xué)、細(xì)胞存活等的重要信號(hào)通路,下調(diào)其通路蛋白表達(dá),可提升抗氧化活性,在SAH病理過程中,ERK信號(hào)激活,降低其磷酸化水平,可減少海馬神經(jīng)元凋亡,減輕腦損傷,改善神經(jīng)功能,另外通過抑制NF-κB信號(hào)活性,減低其核轉(zhuǎn)位,可減輕SAH引發(fā)的腦血管痙攣〔19,20,9〕,因而抑制ERK/NF-κB信號(hào)可作為防治SAH后腦血管痙攣的潛在治療策略。本研究表明,ERK/NF-κB信號(hào)參與調(diào)控SAH后血管痙攣病理過程;而銀杏總黃酮可抑制ERK/NF-κB信號(hào)激活,改善血管痙攣癥狀,且以銀杏總黃酮和DMU-212聯(lián)合處理SAH模型兔可逆轉(zhuǎn)DMU-212對腦損傷和血管痙攣的加重作用,并減弱銀杏總黃酮改善上述癥狀的作用,以上結(jié)果表明,銀杏總黃酮可通過阻止ERK/NF-κB信號(hào)傳導(dǎo)來減輕SAH后血管痙攣,修復(fù)神經(jīng)功能。