湯華 陳少軍 韓晶 夏開來 姜萊 鄭剛

(宜昌市第一人民醫(yī)院神經(jīng)外科,湖北 宜昌 443099)

腦血管痙攣常是蛛網(wǎng)膜下腔出血(SAH)的嚴重并發(fā)癥之一,可造成患者大腦動脈平滑肌持續(xù)收縮,引發(fā)腦組織嚴重缺血缺氧,進而導(dǎo)致嚴重的神經(jīng)功能障礙,是SAH患者殘疾、死亡的主要原因〔1,2〕。SAH發(fā)生后,血液中紅細胞溶解,釋放出血紅蛋白和血紅素,誘導(dǎo)腦組織中氧自由基過量生成,引發(fā)嚴重的氧化應(yīng)激,進而導(dǎo)致腦血管痙攣,且清除氧自由基,增強抗氧化能力是防治SAH后血管痙攣的有效方法〔3,4〕。銀杏總黃酮具有擴張腦血管、促進血液循環(huán)、增加血流量的藥理作用,還可增強腦細胞耐缺氧能力,減輕腦水腫,改善神經(jīng)功能損傷〔5〕;有研究發(fā)現(xiàn),使用銀杏葉提取物聯(lián)合奧拉西坦可改善急性腦出血患者認知功能,提高其生活質(zhì)量〔6〕,因而推測銀杏總黃酮可能對SAH后血管痙攣具有較好的療效。細胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(ERK)/核因子(NF)-κB信號參與調(diào)控組織細胞凋亡、炎癥、氧化應(yīng)激等病理過程,增強ERK磷酸化,可促使NF-κB p65核轉(zhuǎn)位,促進活性氧產(chǎn)生,引發(fā)嚴重的氧化應(yīng)激反應(yīng);阻滯ERK/NF-κB信號傳導(dǎo),可減少炎性介質(zhì)合成釋放,減弱炎性細胞浸潤,顯著降低氧化應(yīng)激水平〔7,8〕。并且有研究證明,抑制NF-κB信號激活,可緩解SAH后血管痙攣癥狀〔9〕,所以ERK/NF-κB信號可能是SAH后血管痙攣的一個潛在治療靶點。本文探討銀杏總黃酮是否可通過ERK/NF-κB信號通路影響兔SAH后血管痙攣。

1 材料與方法

1.1實驗動物 雄性家兔購買于湖南太平生物科技有限公司,生產(chǎn)許可證號:SCXK(湘)2015-0004,體質(zhì)量2.4～3.0 kg。在宜昌市第一人民醫(yī)院動物中心飼養(yǎng),溫度23～25 ℃,濕度55%～60%,參照《關(guān)于善待實驗動物的指導(dǎo)性意見》規(guī)范飼養(yǎng),飼養(yǎng)房中保證安靜、清潔、通風良好。

1.2試劑與儀器 銀杏總黃酮(純度50%)由河南中醫(yī)藥大學中藥實驗室惠贈;3,4,5,4′-四甲氧基二苯乙烯(DMU-212,HY-137977)購于美國MedChemexpress公司;尼氏染色液(E607316-0100)、蘇木素-伊紅(HE)染色試劑盒(E607218-0200)、細胞核/質(zhì)蛋白抽提試劑盒(C510001-0050)、二喹啉甲酸(BCA)蛋白質(zhì)定量檢測試劑盒(C503021-0501)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)、丙二醛(MDA)含量檢測試劑盒(D799762-0100)購于上海生工生物工程股份有限公司;蛋白裂解液(P0013K)購于上海碧云天公司;山羊抗兔ERK一抗(26-5012)、山羊抗兔磷酸化(p)-ERK一抗(26-5013)、山羊抗兔NF-κB p65一抗(29-70006A)、山羊抗兔增殖細胞核抗原(PCNA)一抗(10-M1083)購于上海信裕生物科技有限公司;小鼠抗兔GAPDH一抗(ab125247)、驢抗小鼠二抗(ab6820)、驢抗山羊二抗(ab6885)購于美國Abcam公司等。經(jīng)顱多普勒血流分析儀(型號MultiDopX)購于德國DWL公司;冷凍切片機(型號6250)購于達科為(深圳)醫(yī)療設(shè)備有限公司;生物顯微鏡(型號XSP-8CA)購于上海光學儀器一廠;酶標儀(型號DNM-9602G)購于北京普朗新技術(shù)有限公司;DYY-3C型雙穩(wěn)定時電泳儀電源、DYCZ-20H型高通量垂直電泳儀、DYCZ-40S型四板轉(zhuǎn)印電泳儀、WD-9413B型凝膠成像分析系統(tǒng)購于北京六一生物科技有限公司等。

1.3SAH兔模型制備及分組給藥 制備SAH兔模型的方法參照文獻〔10〕:自耳緣靜脈注射3%的戊巴比妥鈉溶液麻醉家兔(劑量為1 ml/kg),俯臥位固定在立體定位儀,頭部備皮消毒,切開頭皮,暴露顱骨枕大孔,以注射器針頭刺入直至枕大池,吸出1～2 ml腦脊液,自耳緣靜脈取血,注入枕大池,保持兔頭部處于低位20～30 min,然后止血、消毒,縫合切口,放入籠中繼續(xù)飼養(yǎng)48 h,以同樣方法第二次注入自身血液,SAH模型構(gòu)建完成,隨機分為模型組、銀杏總黃酮(156 mg/kg)組、DMU-212(ERK激活劑,18 mg/kg)組、銀杏總黃酮(156 mg/kg)+DMU-212(18 mg/kg)組,每組6只。另取6只家兔以同樣方法手術(shù)處理,只是將血液替換為等量無菌生理鹽水,設(shè)定為假手術(shù)組。

將銀杏總黃酮、DMU-212溶于生理鹽水,分別制成31.2 mg/ml的銀杏總黃酮〔11〕藥液、3.6 mg/ml的DMU-212〔12〕藥液、銀杏總黃酮(31.2 mg/ml)+DMU-212(3.6 mg/ml)的混合藥液,給藥組兔以5 ml/kg的劑量灌胃給藥,假手術(shù)組和模型組兔以等劑量生理鹽水灌胃,每天上午給藥1次,共持續(xù)7 d。

1.4兔神經(jīng)功能檢測 第7天給藥后24 h,觀察家兔行為活動,參照文獻〔13〕方法進行神經(jīng)功能評分:活動正常,無神經(jīng)功能障礙,1分;不愿活動或嗜睡,有疑似或輕度神經(jīng)功能障礙,2分;跛行或四肢無力,呈中度神經(jīng)障礙,3分;四肢癱軟或行走障礙,呈重度神經(jīng)障礙,4分。

1.5兔基底動脈血流速度測定 神經(jīng)功能檢測后,使用經(jīng)顱多普勒血流分析儀測定兔基底動脈血流速度,將兔麻醉,以俯臥位置于操作臺,暴露頸部,將連續(xù)波探頭放入枕大孔處,深達28～30 mm,頻率設(shè)為2.5 MHz,得到清晰的血流信號,統(tǒng)計平均血流速度。

1.6標本收集 兔基底動脈血流速度測定后,處死家兔,斷頭取出大腦,分離出海馬組織,并剪下含基底動脈的腦組織,使用蒸餾水漂洗、OCT包埋后,分別放入凍存盒,以液氮進行冰凍,取出凍好的組織塊,放入冰凍切片機中切為約4 μm厚的切片備用;剩余腦組織剪取約1 g,采用細胞核/質(zhì)蛋白抽提試劑盒分別提取細胞核蛋白和細胞質(zhì)蛋白,經(jīng)BCA蛋白質(zhì)定量檢測試劑盒對其蛋白濃度定量后,保存在-80 ℃冰箱;剩余腦組織再剪取約0.5 g,儲存在液氮中。

1.7兔腦組織海馬神經(jīng)元形態(tài)檢測及兔大腦基底動脈痙攣情況檢測1.6中海馬組織及含基底動脈的腦組織切片,放入冰丙酮中固定,海馬組織切片置于尼氏染色液中染色,含基底動脈的腦組織切片采用HE染色試劑盒染色,均參照各自說明書指導(dǎo)步驟進行操作,在生物顯微鏡下觀察染色情況,采用軟件Image Pro Plus6.0分析測量含基底動脈的腦組織切片中動脈血管的管壁厚度及管腔橫截面積。

1.8兔腦組織氧化應(yīng)激因子SOD、GSH-Px、MDA水平檢測1.6中儲存在液氮中的腦組織,加入蛋白裂解液,勻漿制成勻漿液,4 ℃離心后,取上清以試劑盒測定SOD、GSH-Px、MDA水平,參照各自說明書指導(dǎo)步驟進行操作。

1.9兔腦組織ERK/NF-κB通路蛋白表達情況檢測1.6中保存在-80 ℃冰箱的蛋白樣品液,經(jīng)煮沸5 min變性后,各取20 μg蛋白,于110 V恒壓下電泳后濕轉(zhuǎn),將轉(zhuǎn)印膜放入3%牛血清白蛋白溶液中,37 ℃孵育2 h,然后將膜取出,分別以山羊抗兔ERK、p-ERK、NF-κB p65、PCNA一抗和小鼠抗兔GAPDH一抗溶液4 ℃孵育12 h,取出膜,置于Tris-HCl+吐溫-20緩沖鹽溶液(TBST)中漂洗3遍,以相對應(yīng)的驢抗山羊二抗、驢抗小鼠二抗溶液37 ℃孵育2 h,取出膜,再次漂洗3遍,經(jīng)化學發(fā)光試劑顯色,放入凝膠成像分析系統(tǒng)中采集圖像,并以ImageJ軟件分析圖像中蛋白條帶灰度值,得出各組p-ERK/ERK、核內(nèi)NF-κB p65蛋白相對表達量。

1.10統(tǒng)計學分析 采用SPSS24.0軟件進行方差分析、LSD-t檢驗。

2 結(jié) 果

2.1各組神經(jīng)功能評分 與假手術(shù)組相比,模型組神經(jīng)功能評分明顯升高(P<0.05);與模型組、銀杏總黃酮+DMU-212組相比,銀杏總黃酮組神經(jīng)功能評分明顯降低,DMU-212組兔神經(jīng)功能評分明顯升高(均P<0.05)。見表1。

2.2各組基底動脈血流速度 與假手術(shù)組相比,模型組基底動脈血流速度明顯升高(均P<0.05);與模型組、銀杏總黃酮+DMU-212組相比,銀杏總黃酮組基底動脈血流速度降低,DMU-212組基底動脈血流速度升高(均P<0.05)。見表1。

2.3各組腦組織氧化應(yīng)激因子 與假手術(shù)組相比,模型組腦組織MDA水平明顯升高,SOD、GSH-Px水平明顯降低(均P<0.05)。與模型組、銀杏總黃酮+DMU-212組相比,銀杏總黃酮組腦組織MDA水平明顯降低,SOD、GSH-Px水平明顯升高;DMU-212組腦組織MDA水平明顯升高,SOD、GSH-Px水平明顯降低(均P<0.05)。見表1。

2.4各組大腦基底動脈痙攣情況 與假手術(shù)組相比,模型組基底動脈表現(xiàn)出嚴重的痙攣現(xiàn)象,管壁明顯增厚,管腔橫截面積明顯減小(均P<0.05)。與模型組、銀杏總黃酮+DMU-212組相比,銀杏總黃酮組基底動脈痙攣減輕,管壁明顯變薄,管腔橫截面積明顯增大;DMU-212組基底動脈痙攣加重,管壁明顯增厚,管腔橫截面積明顯減小(均P<0.05)。見表1、圖1。

表1 各組神經(jīng)功能評分、大腦基底動脈管壁厚度、管腔橫截面積、基底動脈血流速度、SOD、GSH-Px、MDA水平

圖1 5組各組大腦基底動脈(HE染色,×200)

2.5各組大腦海馬神經(jīng)元形態(tài) 假手術(shù)組大腦海馬神經(jīng)元輪廓清晰可見,排列整齊致密;模型組大腦海馬神經(jīng)元萎縮變小,數(shù)量明顯減少,排列紊亂;與模型組、銀杏總黃酮+DMU-212組相比,銀杏總黃酮組上述病理情況改善,DMU-212組上述病理情況加重。見圖2。

圖2 各組大腦海馬神經(jīng)元(尼氏染色,×200)

2.6各組腦組織ERK/NF-κB通路蛋白表達 與假手術(shù)組比較,模型組腦組織ERK/NF-κB通路相關(guān)蛋白p-ERK/ERK、核內(nèi)NF-κB p65蛋白表達明顯升高(P<0.05)。與模型組、銀杏總黃酮+DMU-212組,銀杏總黃酮組上述指標表達降低(P<0.05);DMU-212組腦組織上述指標表達升高(P<0.05)。見圖3、表2。

1～5:假手術(shù)組、模型組、銀杏總黃酮組、DMU-212組、銀杏總黃酮+DMU-212組

表2 各組腦組織ERK/NF-κB通路蛋白相對表達水平

3 討 論

SAH是神經(jīng)外科高發(fā)急癥,大多因動脈瘤破裂引起,腦血管痙攣是其常見并發(fā)癥,可引發(fā)患者腦梗死,導(dǎo)致腦組織嚴重損傷,損害神經(jīng)功能,是SAH后致死、致殘,造成不良預(yù)后的主要因素,對其發(fā)生機制進行深入研究,找到安全有效的防治方法,具有重大臨床意義〔14,15〕。本研究結(jié)果表明,SAH可降低抗氧化因子水平,增強氧化能力,引發(fā)兔大腦嚴重的氧化應(yīng)激反應(yīng),導(dǎo)致動脈血管痙攣、血流速度增快,進而造成神經(jīng)功能障礙,揭示兔SAH模型建立成功。

氧自由基引發(fā)的氧化應(yīng)激是導(dǎo)致SAH后腦血管痙攣的主要致病機制,抑制自由基產(chǎn)生,對抗氧化應(yīng)激反應(yīng)是緩解SAH后腦損傷的有效治療手段〔15,16〕。銀杏葉是用于止痛通絡(luò)、活血化瘀的常用中草藥,具有抗炎、抗腫瘤、擴張血管、抗氧化的藥理活性,可保護腦組織免于缺血缺氧性損傷,黃酮類化合物是其主要活性成分,研究發(fā)現(xiàn),銀杏葉總黃酮可顯著抑制腦缺血后氧化應(yīng)激反應(yīng),改善腦組織病理改變,減輕腦損傷,以銀杏葉提取物聯(lián)合胞磷膽堿鈉片還可治療急性腦出血,改善患者神經(jīng)功能缺損癥狀〔17,18〕,由此可認為,銀杏總黃酮可能通過減輕氧化應(yīng)激而緩解SAH后血管痙攣。本研究結(jié)果表明,銀杏總黃酮可提高抗氧化因子水平,抑制氧化應(yīng)激反應(yīng),緩解動脈血管痙攣,減輕腦組織神經(jīng)元損傷,改善神經(jīng)功能。

ERK/NF-κB通路是機體調(diào)控氧化能力、免疫炎癥、血流動力學、細胞存活等的重要信號通路,下調(diào)其通路蛋白表達,可提升抗氧化活性,在SAH病理過程中,ERK信號激活,降低其磷酸化水平,可減少海馬神經(jīng)元凋亡,減輕腦損傷,改善神經(jīng)功能,另外通過抑制NF-κB信號活性,減低其核轉(zhuǎn)位,可減輕SAH引發(fā)的腦血管痙攣〔19,20,9〕,因而抑制ERK/NF-κB信號可作為防治SAH后腦血管痙攣的潛在治療策略。本研究表明,ERK/NF-κB信號參與調(diào)控SAH后血管痙攣病理過程;而銀杏總黃酮可抑制ERK/NF-κB信號激活,改善血管痙攣癥狀,且以銀杏總黃酮和DMU-212聯(lián)合處理SAH模型兔可逆轉(zhuǎn)DMU-212對腦損傷和血管痙攣的加重作用,并減弱銀杏總黃酮改善上述癥狀的作用,以上結(jié)果表明,銀杏總黃酮可通過阻止ERK/NF-κB信號傳導(dǎo)來減輕SAH后血管痙攣,修復(fù)神經(jīng)功能。