李志芳 賀曉云 許孟霞 袁國娜 金李 董蕓 劉科成

(1達(dá)州中醫(yī)藥職業(yè)學(xué)院中醫(yī)學(xué)院,四川 達(dá)州 635000;2達(dá)州市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院中藥房)

肝纖維化是世界范圍內(nèi)高死亡率和高發(fā)病率的疾病之一,其特征是細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)成分如膠原蛋白和層黏連蛋白(LN)等的過度合成和沉積〔1〕。肝纖維化多由病毒性肝炎感染、飲酒、膽汁淤積和非酒精性脂肪性肝炎等引起〔2〕,如果不及時治療,持續(xù)性肝纖維化可導(dǎo)致肝硬化和肝癌。此外,肝纖維化發(fā)病機(jī)制復(fù)雜多樣,目前還沒有有效的治療方法〔3〕。因此,迫切需要開發(fā)新的藥物來預(yù)防或治療肝纖維化。龍膽苦苷(GP)是從中藥龍膽草中分離得到的一種含環(huán)烯醚萜苷類化合物〔4〕。已有研究表明GP對甲萘異硫氰酸酯所致大鼠膽汁淤積性肝損傷具有保護(hù)作用〔5〕,GP可改善P2X7受體依賴性酒精性脂肪肝〔6〕,表明了GP的肝保護(hù)作用,但GP對肝纖維化的具體作用機(jī)制仍尚不清楚。本文主要探討GP對四氯化碳(CCl4)誘導(dǎo)肝纖維化的作用及機(jī)制,以期為肝纖維化的預(yù)防提供基礎(chǔ)參考數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動物 6周齡SPF級雄性SD 大鼠120只,體質(zhì)量(170±10) g,購自四川省實(shí)驗(yàn)動物專委會養(yǎng)殖場SCXK(川)2021-037。實(shí)驗(yàn)動物飼養(yǎng)于溫度25～26 ℃、濕度為 50%～55% 的SPF級飼養(yǎng)室〔SYXK(閩)2016-0008〕,并按實(shí)驗(yàn)動物使用的3R原則給予人道的關(guān)懷。自由飲水,普通飼料喂養(yǎng)。所有實(shí)驗(yàn)過程經(jīng)醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動物管理倫理委員會批準(zhǔn)進(jìn)行(IACUC-2018-0305)。

1.2實(shí)驗(yàn)藥物和主要試劑 GP(HPLC≥95%,上海甄準(zhǔn)生物科技有限公司,貨號:ES-0216),用生理鹽水配制成濃度為25、50、100 mg/ml GP溶液待用。秋水仙堿(Col,上海斯百全化學(xué)有限公司,貨號:YY1435),用生理鹽水配制成濃度為1 mg/ml溶液待用。蘇木素-伊紅(HE)染色試劑盒(索萊寶科技有限公司,貨號:G1120),CCl4(浙江聯(lián)碩生物科技有限公司,貨號:289116),馬松(Masson)染色試劑盒(北京索萊寶科技有限公司,貨號:G1340-7),單胺氧化酶(MAO)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(GOT)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(GPT)、透明質(zhì)酸(HA)、LN、丙二醛(MDA)試劑盒(上海酶聯(lián)生物科技有限公司,貨號:ml076975、ml077324、ml076532、ml064280、ml062962、ml022446),過氧化氫酶(CAT)活性檢測試劑盒、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)試劑盒、超氧化物歧化酶(SOD)活性檢測試劑盒(索萊寶科技有限公司,貨號:BC0200、BC1190、BC0170),放射免疫沉淀法(RIPA)裂解緩沖液(南京海克爾生物科技有限公司,貨號:SBJ-0999),二喹啉甲酸(BCA)試劑盒(上海易色醫(yī)療科技有限公司,貨號:BC201),兔抗鼠活化的胱天蛋白酶(Cleaved caspase)-3、人B細(xì)胞淋巴瘤因子(Bcl)-2、Bcl-2相關(guān)X蛋白(Bax)、甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)單克隆抗體(購自碧云天生物科技有限公司,貨號:AC030-1、AB026、AB112、AF0003);辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔單克隆二抗、兔抗鼠Ⅰ、Ⅱ型膠原蛋白(collagen Ⅰ、Ⅱ)、α-平滑肌肌動蛋白(α-SMA)、核因子相關(guān)因子(Nrf)2、醌NADH脫氫酶(NQO)1和血紅素氧合酶(HO)-1單克隆抗體(上海艾博抗生物科技有限公司,貨號:ab6728、ab34710、ab34712、ab32575、ab76026、ab28947、ab14243)。

1.3造模及給藥 將120只大鼠隨機(jī)分為:對照(Control)組、模型(Model)組、GP 50、100、200 mg/kg組,Col 2 mg/kg組,每組20只。除Control組外,其余各組參照相關(guān)文獻(xiàn)〔7〕復(fù)制肝纖維化大鼠模型,均分別給予皮下注射40%CCl4花生油混合溶液,首劑量為5 ml/kg,后調(diào)整為3 ml/kg,2次/w,連續(xù)注射12 w。同時,GP 50、100、200 mg/kg組和Col 2 mg/kg組每天灌胃GP 50、100、200 mg/kg〔8〕或 Col 2 mg/kg〔9〕,Control組和Model組灌胃等量生理鹽水。在第8周結(jié)束后,用戊巴比妥鈉麻醉,從腹主動脈采集血樣,離心后從血液中分離血清。每組的肝左葉均用10%甲醛固定,肝臟的其他部分則保存在-80 ℃下直至進(jìn)一步使用。

1.4試劑盒檢測血清中MAO、GOT、GPT活性及HA、LN的含量 按照試劑盒說明書檢測血清中MAO、GOT、GPT活性及HA、LN的含量來評估肝損傷和纖維化情況。

1.5HE染色觀察肝病理學(xué)變化 肝臟固定在10%甲醛中,石蠟包埋,切成5 μm厚,二甲苯脫蠟,乙醇濃度降低時連續(xù)復(fù)水。切片用蘇木素-伊紅染色,每組選取20個染色切片顯微鏡下觀察肝病理學(xué)變化,并使用ColorView Ⅱ相機(jī)獲取20個隨機(jī)場的圖像,由兩名資深獨(dú)立病理學(xué)家進(jìn)行Ishak炎癥評分〔10〕。碎片狀壞死:0分,無;1分,輕微(局灶性,少數(shù)門管區(qū));2分,輕微/中等(局灶性,大多數(shù)門管區(qū));3分,中等(連續(xù)性,<50%的門管區(qū)及間隔區(qū));4分,嚴(yán)重(連續(xù)性,>50%的門管區(qū)及間隔區(qū))。融合性壞死:0分,無;1分,局灶性融合性壞死;2分,部分區(qū)域3區(qū)壞死;3分,大多數(shù)區(qū)域3區(qū)壞死;4分,3區(qū)壞死+偶見門管區(qū)-中心靜脈橋接;5分,3區(qū)壞死+多發(fā)性門管區(qū)-中心靜脈橋接;6分,全小葉或多發(fā)性小葉壞死。局灶性壞死:0分,無;1分,10倍視野下有1個壞死區(qū)或更少;2分,10倍視野下有2～4個壞死區(qū);3分,10倍視野下有5～10個壞死區(qū);4分:10倍視野下有10個以上壞死區(qū);門管區(qū)炎癥:0分,無;1分:輕度,部分或所有門管區(qū);2分,中度,部分或所有門管區(qū);3分,中度/嚴(yán)重,所有門管區(qū);4分,嚴(yán)重,所有門管區(qū)。

1.6Masson染色觀察肝纖維化程度 肝臟切片先用鐵蘇木素染色液染色,再用Masson藍(lán)化液反藍(lán),接著用麗春紅染色液染色,乙醇脫水、二甲苯透明,中性樹膠封片,顯微鏡下觀察肝纖維化程度,并使用ColorView Ⅱ相機(jī)獲取20個隨機(jī)場的圖像,由兩名資深獨(dú)立病理學(xué)家進(jìn)行Ishak纖維化評分。0分,無纖維;1分,部分門管區(qū)有纖維增生,有或無短的纖維隔膜;2分,大多數(shù)門管區(qū)有纖維增生,有或無短的纖維隔膜;3分,大多數(shù)門管區(qū)有纖維增生,偶見門管區(qū)與匯管區(qū)纖維橋連;4分,門管區(qū)纖維增生,同時伴有明顯的纖維橋連(門管與門管之間及門管與中心靜脈之間);5分,明顯的門管與門管和(或)門管與中心靜脈纖維橋接,偶見結(jié)節(jié)(不完全硬化);6分,可能或明確的肝硬化。

1.7流式細(xì)胞術(shù)檢測肝細(xì)胞凋亡 將小塊肝組織在預(yù)冷的磷酸鹽緩沖液(PBS)中粉碎,并用胰酶消化肝細(xì)胞,1 500 r/min離心,按1×106細(xì)胞/ml的濃度重懸。細(xì)胞懸液中加入5 μl膜聯(lián)蛋白(Annexin)-Ⅴ-異硫氰酸熒光素(FITC)和5 μl碘化丙啶(PI),在黑暗的房間里孵化15 min,然后用流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞凋亡情況。左下象限為活細(xì)胞,右上象限為壞死細(xì)胞,右下象限為凋亡細(xì)胞。

1.8試劑盒檢測肝組織中SOD和CAT的活性及GSH-Px和MDA含量 根據(jù)SOD和CAT活性檢測試劑盒及GSH-Px和MDA試劑盒檢測。

1.9蛋白印跡檢測肝組織中纖維化、凋亡、Nrf2通路相關(guān)蛋白表達(dá)水平 在裂解緩沖液中提取總蛋白質(zhì),并用BCA測定試劑盒測量蛋白質(zhì)濃度。將10 μg蛋白樣品用10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離后轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜上。用5%脫脂奶粉封閉膜,然后用兔抗鼠單克隆一抗(collagen Ⅰ、Ⅱ 1∶1 000、α-SMA 1∶2 000、Cleaved caspase-3 1∶1 000、Bax 1∶1 000、Bcl-2 1∶1 000、NQO1 1∶500、HO-1 1∶500、Nrf2 1∶1 000)在4 ℃ 封閉過夜,接著加入對應(yīng)辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔單克隆二抗(1∶2 000)室溫孵育1 h,最后電化學(xué)發(fā)光(ECL)曝光。以GAPDH為內(nèi)參,使用Quantity One軟件進(jìn)行分析目標(biāo)蛋白質(zhì)的相對表達(dá)水平,目標(biāo)蛋白質(zhì)的相對表達(dá)水平用目標(biāo)蛋白與內(nèi)參蛋白積分吸光值比值表示。

1.10統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS21.0軟件進(jìn)行shapiro-wilk檢驗(yàn)、單因素方差分析、SNK-q檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1GP對CCl4誘導(dǎo)肝纖維化大鼠肝功能的影響 如表1所示,與Control組相比,Model組血清中MAO、GOT、GPT、HA活性及LN的含量明顯增加(P<0.01),說明造模成功;與Model組比較,GP 50、100、200 mg/kg和Col 2 mg/kg組血清中MAO、GOT、GPT、HA活性及LN的含量明顯減少(P<0.05,P<0.01);與Col 2 mg/kg組比較,GP 200 mg/kg組血清中MAO、GOT、GPT、HA活性及LN的含量明顯減少(P<0.05)。

2.2各組肝組織病理學(xué) Control組肝細(xì)胞形態(tài)正常,未見肝細(xì)胞水腫及炎癥細(xì)胞浸潤;Model組肝細(xì)胞彌漫性氣球樣變,匯管區(qū)及周圍重度界板性肝炎,并可見及廣泛性橋接壞死及膽管再生,匯管區(qū)中度炎性改變;給藥各組隨著給藥濃度的增加肝臟組織的水腫和炎性細(xì)胞浸潤程度逐漸減輕。與Control組相比,Model組肝炎癥評分明顯增加(P<0.01),說明造模成功;與Model組相比,GP 50 mg/kg組肝炎癥評分無明顯變化(P>0.05),GP 100、200 mg/kg和Col 2 mg/kg組肝炎癥評分明顯減少(P<0.05,P<0.01);與Col 2 mg/kg組相比,GP 200 mg/kg組肝炎癥評分無明顯變化(P>0.05)。見表1、圖1。

表1 GP對CCl4誘導(dǎo)肝纖維化大鼠肝功能及炎癥評分的影響

2.3GP對CCl4誘導(dǎo)肝纖維化大鼠的肝纖維化的影響 Control組膠原蛋白的沉積,未見匯管區(qū)纖維增生;Model組存在明顯的膠原蛋白的沉積,匯管區(qū)纖維明顯擴(kuò)大,伴廣泛的門管區(qū)與匯管區(qū)和門管區(qū)-中心靜脈橋接纖維化,小葉結(jié)構(gòu)紊亂,且具有部分隔室的增厚和“假葉”的形成;給藥各組隨著給藥濃度的增加肝臟組織纖維化程度逐漸減輕。見圖2。與Control組相比,Model組肝纖維化評分明顯增加(P<0.01),說明造模成功;與Model組相比,GP 50 mg/kg組肝纖維化評分無明顯變化,GP 100、200 mg/kg和Col 2 mg/kg組肝纖維化評分明顯減少(P<0.05,P<0.01);與Col 2 mg/kg組相比,GP 200 mg/kg組肝纖維化評分無明顯變化(P>0.05)。見表2。

2.4GP對CCl4誘導(dǎo)肝纖維化大鼠肝組織氧化應(yīng)激反應(yīng)的影響 如表2所示,與Control組相比,Model組肝組織中SOD、CAT的活性及GSH-Px含量明顯降低,MDA含量明顯升高(P<0.05,P<0.01),說明造模成功;與Model組相比,GP 50 mg/kg組肝組織氧化應(yīng)激相關(guān)指標(biāo)水平無明顯變化,GP100、200 mg/kg和Col2 mg/kg組肝組織中SOD活性及GSH-Px含量明顯升高,MDA含量明顯降低(P<0.05,P<0.01);GP200 mg/kg組和Col2 mg/kg組CAT活性顯著高于Model組(P<0.05);與Col 2 mg/kg組相比,GP200 mg/kg組肝組織氧化應(yīng)激相關(guān)指標(biāo)水平無明顯變化(P>0.05)。

2.5GP對CCl4誘導(dǎo)肝纖維化大鼠肝細(xì)胞凋亡的影響 如表2、圖3所示,與Control組相比,Model組肝細(xì)胞凋亡率明顯增加(P<0.01),說明造模成功;與Model組相比,GP 100、200 mg/kg和Col 2 mg/kg組肝細(xì)胞凋亡率明顯減少(P<0.05,P<0.01);與Col 2 mg/kg組相比,GP 200 mg/kg組肝細(xì)胞凋亡率無明顯變化(P>0.05)。

圖1 各組肝組織病理(HE染色,×200)

圖2 龍膽苦苷對CCl4誘導(dǎo)大鼠肝纖維化的影響(Masson染色,×200)

表2 各組Ishak纖維化評分、肝細(xì)胞凋亡及肝組織氧化應(yīng)激指標(biāo)比較

圖3 龍膽苦苷對CCl4誘導(dǎo)肝纖維化大鼠肝細(xì)胞凋亡的影響

2.6GP對CCl4誘導(dǎo)肝纖維化大鼠肝組織中纖維化、凋亡、Nrf2通路相關(guān)蛋白表達(dá)水平的影響 如圖4、表3所示,與Control組相比,Model組肝組織中Bax、Cleaved caspase-3、collagen Ⅰ、Ⅱ和α-SMA表達(dá)水平明顯上調(diào)(P<0.05,P<0.01),Bcl-2、Nrf2、NQO1和 HO-1蛋白表達(dá)明顯下調(diào)(P<0.05,P<0.01);與Model組相比,GP 50 mg/kg組肝組織中纖維化、凋亡、Nrf2通路相關(guān)蛋白表達(dá)水平無明顯變化(P>0.05);GP 100、200 mg/kg和Col 2 mg/kg組肝組織中Bax、Cleaved caspase-3、collagen Ⅰ、Ⅱ和α-SMA表達(dá)水平明顯下調(diào)(P<0.05,P<0.01),Bcl-2、Nrf2、NQO1和 HO-1蛋白表達(dá)明顯上調(diào)(P<0.05,P<0.01);與Col 2 mg/kg組相比,GP 200 mg/kg組肝組織纖維化、凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)水平無明顯變化(P>0.05),Nrf2、NQO1和 HO-1蛋白表達(dá)明顯上調(diào)(P<0.05)。

1～6:Control組、Model組、GP 50 mg/kg組、GP 100 mg/kg組、GP 200 mg/kg組、Col 2 mg/kg組

表3 各組肝纖維化、凋亡、Nrf2通路相關(guān)蛋白表達(dá)水平比較

3 討 論

GP是中藥龍膽草的主要活性成分,具有抗炎、抗病毒、保肝、利膽、鎮(zhèn)痛、抗癌等作用〔11〕。在肝纖維化模型中,GOT和GPT 的含量均顯著升高〔12〕。MAO能促進(jìn)結(jié)締組織的成熟,在膠原形成過程中,參與膠原成熟的最后階段架橋形成,使膠原和彈性硬蛋白結(jié)合,所以血清中MAO含量的升高都是肝纖維化的標(biāo)志〔13〕。HA主要由肝內(nèi)皮細(xì)胞攝取分解,當(dāng)肝,腎功能受損時,血清HA升高,且隨病變加劇而呈升高趨勢。血清HA檢測能在一定程度上反映肝纖維化的發(fā)展與轉(zhuǎn)歸〔14〕。LN屬結(jié)構(gòu)性糖蛋白,存在于基底膜的透明層中血清LN水平常與HA等相平行,在肝纖維化診斷方面有重要價值〔15〕。CCl4誘導(dǎo)肝纖維化大鼠的肝組織中肝細(xì)胞壞死、纖維組織增生、間隔增寬并形成偽小葉。而肝纖維化常見的組織學(xué)改變主要表現(xiàn)為ECM的過度沉積,如Ⅰ和Ⅱ型膠原及α-SMA的表達(dá)增加。本研究發(fā)現(xiàn),模型組大鼠表現(xiàn)出這些肝纖維化特征,而GP呈劑量依賴性減輕這些纖維化特征。本研究還發(fā)現(xiàn)GP通過多種途徑的組合減輕了肝纖維化,該機(jī)制與抑制肝細(xì)胞凋亡、氧化應(yīng)激、Nrf信號通路有關(guān)。

細(xì)胞凋亡是細(xì)胞死亡的一種主要形式,受到包括線粒體在內(nèi)的多種分子信號通路的調(diào)控。在這些途徑中,線粒體外膜通透性受到Bcl-2家族蛋白的嚴(yán)格控制〔16〕。CCl4誘導(dǎo)的肝纖維大鼠肝細(xì)胞凋亡增加,且Cleaved caspase-3、Bax表達(dá)增加〔17〕。本研究結(jié)果說明,在CCl4誘導(dǎo)的肝纖維化過程中,GP保護(hù)肝臟免受肝細(xì)胞凋亡的影響。

氧化應(yīng)激是各種肝臟疾病的主要病理狀態(tài),例如病毒性肝炎,非酒精性脂肪肝,酒精性肝病和藥物性肝損傷〔18〕。肝纖維化的發(fā)展和進(jìn)展與氧化應(yīng)激顯著相關(guān),氧化應(yīng)激中大量的自由基會對脂質(zhì),蛋白質(zhì)和碳水化合物產(chǎn)生化學(xué)損害,導(dǎo)致細(xì)胞代謝紊亂并隨后破壞正常肝細(xì)胞〔19〕。自由基可以被內(nèi)源性自由基清除劑如SOD、CAT和GSH-Px抑制。CCl4誘導(dǎo)的肝纖維化的主要原因之一是CCl4的自由基衍生物對肝細(xì)胞膜的脂質(zhì)過氧化作用。MDA是膜脂質(zhì)過氧化的最終產(chǎn)物,是判斷自由基介導(dǎo)的損傷最廣泛使用的指標(biāo)之一〔20〕。本研究結(jié)果說明,GP對CCl4誘導(dǎo)的肝纖維化具有抗氧化作用。

Nrf2可以激活細(xì)胞保護(hù)性基因,并通過保護(hù)肝細(xì)胞免受氧化損傷而在氧化應(yīng)激中起關(guān)鍵作用。正常情況下,Nrf2和Keapl在細(xì)胞質(zhì)中處于結(jié)合狀態(tài)。在氧化應(yīng)激下,Nrf2和Keapl會出現(xiàn)解離,并與作為二聚體的抗氧化劑成分結(jié)合,參與抗氧化酶和Ⅱ相解毒酶的合成,并通過提高肝臟的抗氧化能力來防止肝纖維化的發(fā)生〔21〕。Nrf2在正常肝細(xì)胞中起著重要的轉(zhuǎn)錄因子的作用,并且其激活可以增加下游特定基因如NQO1、HO-1和谷胱甘肽的表達(dá),具有抗氧化應(yīng)激的作用〔22〕。研究表明,Nrf2及其下游抗氧化因子HO-1和NQO1可能有助于改善肝纖維化〔23〕。CCl4通過引起由于三氯甲基自由基產(chǎn)生的慢性氧化應(yīng)激而誘導(dǎo)肝纖維化。本研究表明,GP上調(diào)CCl4誘導(dǎo)的肝纖維化大鼠肝組織中Nrf2、NQO1和 HO-1蛋白表達(dá)。

綜上所述,GP改善CCl4誘導(dǎo)的肝纖維化大鼠的肝損傷和纖維化,并抑制肝細(xì)胞凋亡和氧化應(yīng)激反應(yīng),其與Nrf2抗氧化劑途徑的激活有關(guān)。GP的抗纖維化機(jī)制可能與Nrf2抗氧化劑途徑的激活及其下游抗氧化酶的表達(dá)有關(guān),但需進(jìn)行進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)以確認(rèn)GP干預(yù)的具體機(jī)制。