劉天宇 張欣宇 郭佳寶 王培 賀永貴 習(xí)瑾昆, 鄭桓

(華北理工大學(xué) 1基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 河北省慢性疾病基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,河北 唐山 063210;2公共衛(wèi)生學(xué)院;3臨床醫(yī)學(xué)院)

氧化應(yīng)激是導(dǎo)致心肌細(xì)胞死亡的重要原因,是缺血性心臟病發(fā)生的重要環(huán)節(jié),可以引發(fā)動(dòng)脈粥樣硬化、心肌缺血/再灌注損傷等。因此,減輕心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷是心肌保護(hù)的重要策略之一〔1〕。 白藜蘆醇(resveratrol)屬于非黃酮多酚類化合物,從最初“法國(guó)悖論”開始,白藜蘆醇的生物學(xué)效應(yīng)得到廣泛關(guān)注,其中最重要的就是心腦血管保護(hù)作用〔2〕。白藜蘆醇通過誘導(dǎo)藥物性預(yù)處理和后處理機(jī)制保護(hù)缺血/再灌注心臟,氧化應(yīng)激、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激、凋亡、自噬、一氧化氮等參與其心肌保護(hù)作用〔3,4〕。本實(shí)驗(yàn)室早期研究也證實(shí),白藜蘆醇通過環(huán)磷酸鳥苷(cGMP)/環(huán)尿苷酸依賴性蛋白激酶(PKG)信號(hào)使糖原合成酶激酶(GSK)-3β失活,通過與線粒體靶向素環(huán)蛋白(Cyp)D結(jié)合阻止線粒體通透性轉(zhuǎn)移孔(mPTP)的開放,從而保護(hù)再灌注心臟〔5〕。

線粒體膜上存在的mPTP在心肌缺血/再灌注損傷中起關(guān)鍵作用。mPTP在再灌注早期開放并導(dǎo)致心肌細(xì)胞損傷,阻止再灌注時(shí)mPTP開放,可以減輕缺血/再灌注損傷,因此也被稱為最終效應(yīng)器〔6〕。研究顯示,心肌梗死與重塑的病理基礎(chǔ)是心肌細(xì)胞死亡,包括自噬、線粒體死亡途徑、凋亡、壞死、焦亡和鐵死亡,其中mPTP開放引起線粒體死亡途徑與心肌損傷關(guān)系密切〔7〕。因此,阻止mPTP開放是有效保護(hù)心肌細(xì)胞的關(guān)鍵。白藜蘆醇預(yù)處理可以減輕Ca2+超載,進(jìn)而阻止mPTP開放。本實(shí)驗(yàn)室研究顯示,Res通過增加細(xì)胞內(nèi)鋅離子(Zn2+)阻止mPTP開放,減輕缺氧/復(fù)氧損傷,保護(hù)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(ERS)的心肌細(xì)胞〔3,5〕。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是細(xì)胞內(nèi)Zn2+的貯藏所,外界因素刺激能夠促進(jìn)Zn2+從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中釋放,與此同時(shí),Zn2+同樣能夠維持內(nèi)質(zhì)網(wǎng)正常功能〔7〕。

本實(shí)驗(yàn)室最新研究證實(shí),Zn2+通過線粒體鈣離子單向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(MCU)影響細(xì)胞內(nèi)鈣離子(Ca2+)和活性氧(ROS)進(jìn)而阻止mPTP的開放,保護(hù)H9c2心肌細(xì)胞〔8～10〕。然而,白藜蘆醇是否通過MCU抑制mPTP開放及其機(jī)制尚不得而知。本研究利用大鼠H9c2心肌細(xì)胞,用過氧化氫(H2O2)建立氧化應(yīng)激模型,探究Res是否通過MCU阻止mPTP開放從而發(fā)揮心肌細(xì)胞保護(hù)作用,并探討可能的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制。

1 資料與方法

1.1主要儀器與試劑 白藜蘆醇(美國(guó)Sigma公司,批號(hào):038K5202);四甲基羅丹明乙酯(TMRE)紅色熒光染料(美國(guó)Molecular Probes公司,批號(hào):T669);Fluo-4AM 熒光染料(Thermo Fisher Scientific公司,批號(hào):F14201);葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白(GRP)78、GRP94、MCU mAb,β-tubulin mAb,Anti-rabbit IgG辣根過氧化物酶(HRP)-linked Antibody等抗體均購(gòu)自美國(guó)Cell Signaling Technology公司;Opti-MEM培養(yǎng)基(美國(guó)Gibco公司),MCU siRNA(中實(shí)基因科技有限公司),LipofectamineTM3000(美國(guó)Invitrogen公司),二喹啉甲酸(BCA)蛋白試劑盒、電化學(xué)發(fā)光(ECL)試劑盒、ROS試劑盒〔2,7-二氯熒光素二乙酸酯(DCFH-DA)熒光染料〕、十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)快速配制試劑盒均購(gòu)自碧云天生物技術(shù)研究所;釕紅(Sigma-Aldrich公司,批號(hào):00541-1G)。CO2孵育箱(Forma公司產(chǎn)品);CKX31倒置相差顯微鏡;FV 1000激光掃描共聚焦顯微鏡(日本OLYMPUS公司);高速冷凍離心機(jī)(德國(guó)IKA公司)。

1.2細(xì)胞培養(yǎng) 大鼠胚胎心臟組織來源H9c2細(xì)胞株(美國(guó)標(biāo)準(zhǔn)菌種收藏中心,ATCC),用含10%胎牛血清、100 U/ml青霉素、100 U/ml鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基,置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。2～3 d換液,細(xì)胞融合達(dá)85%時(shí),以0.25%胰蛋白酶乙二胺四乙酸(EDTA)消化傳代。

1.3實(shí)驗(yàn)分組 實(shí)驗(yàn)隨機(jī)分為4組:①對(duì)照組:心肌細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)。②H2O2組:200 μmol/L H2O2孵育20 min。③白藜蘆醇+H2O2組:100 μmol/L白藜蘆醇、200 μmol/L H2O2各孵育20 min。④釕紅+白藜蘆醇+H2O2組:20 μmol/L釕紅孵育30 min、100 μmol/L白藜蘆醇、200 μmol/L H2O2各孵育20 min。

1.4乳酸脫氫酶(LDH)法檢測(cè)細(xì)胞損傷程度 細(xì)胞根據(jù)實(shí)驗(yàn)分組進(jìn)行給藥預(yù)處理,吸取上清液,1 000 r/min離心5 min。根據(jù)LDH試劑盒說明書向空白孔、標(biāo)準(zhǔn)孔、對(duì)照孔、測(cè)定孔中加入各類試劑及離心后的上清液。混勻,37 ℃孵育15 min,將每孔加入2,4-二硝基苯肼0.025 ml,混勻,37 ℃孵育15 min,各孔加入0.4 mol/L氫氧化鈉溶液0.25 ml,混勻,室溫放置5 min。在酶標(biāo)儀450 nm處測(cè)定各孔的吸光度值,繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,根據(jù)公式進(jìn)行計(jì)算。

1.5Western印跡檢測(cè)GRP78、GRP94、MCU蛋白的表達(dá) 細(xì)胞生長(zhǎng)至90%融合狀態(tài),根據(jù)實(shí)驗(yàn)分組處理細(xì)胞。生理鹽水沖洗3次后每組加入50 μl新鮮配制的細(xì)胞裂解液,冰上裂解30 min。收集裂解液,超聲波處理器進(jìn)一步破碎,于12 000 r/min(-4 ℃),離心15 min。取上清,BCA測(cè)定蛋白濃度,按照酶標(biāo)儀測(cè)定結(jié)果進(jìn)行蛋白分裝,將蛋白煮沸后上樣、電泳、轉(zhuǎn)膜。10%脫脂牛奶室溫封閉60 min,GRP78、GRP94、MCU、β-tubulin等抗體(1∶1 000稀釋),4 ℃孵育過夜。二抗(1∶2 000稀釋)室溫孵育2 h,ECL熒光顯色。ImageJ軟件對(duì)圖像進(jìn)行灰度分析并統(tǒng)計(jì)。

1.6MCU siRNA轉(zhuǎn)染 首先進(jìn)行MCU沉默RNA的篩選。3種MCU siRNA序列號(hào)分別為374、761、984。按序列號(hào)分組,將陰性siRNA(NC組)作為參考,Western印跡檢測(cè)3種MCU siRNA(分別為MCU374、MCU761及MCU984組)沉默效率。細(xì)胞接種于6孔板中(8×104個(gè)/孔),密度約50%時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染,將6孔板中的培養(yǎng)基棄去,加入1 800 μl Opti-MEM培養(yǎng)基。分別用92.5 μl Opti-MEM培養(yǎng)基稀釋7.5 μl NC siRNA、7.5 μl MCU siRNA、7.5 μl LipofectamineTM3000并混勻,將上述稀釋的 LipofectamineTM3000分別加入稀釋的NC siRNA和MCU siRNA混合輕輕振蕩并室溫孵育20 min,于6孔板中置于37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)48～72 h進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。采用Western印跡檢測(cè)白藜蘆醇對(duì)MCU蛋白表達(dá)的影響,分組為陰性siRNA為NC siRNA Con組、加H2O2陰性為NC siRNA H2O2組、加白藜蘆醇和H2O2陰性為NC siRNA Res+H2O2組、加MCU siRNA的白藜蘆醇和H2O2為MCU siRNA Res+H2O2組。

1.7激光掃描共聚焦顯微鏡檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)Ca2+、ROS、mPTP 細(xì)胞培養(yǎng)于共聚焦專用小皿內(nèi),密度適合生長(zhǎng)狀態(tài)良好時(shí),將皿中培養(yǎng)基棄去,生理鹽水洗滌3次,將稀釋好的染料均勻加入共聚焦小皿,于37 ℃下培養(yǎng)20～30 min,生理鹽水洗滌3次,加入2 ml空白培養(yǎng)基,選取合適的視野,通過激光掃描共聚焦顯微鏡檢測(cè)熒光強(qiáng)度。細(xì)胞內(nèi)Ca2+用Fluo-4 AM熒光探針測(cè)定;細(xì)胞內(nèi)ROS用DCFH-DA熒光探針測(cè)定;線粒體膜電位用TMRE熒光探針測(cè)定進(jìn)而了解mPTP的開放程度。

1.8統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS26.0及GraphPad Prism8軟件分析,完全隨機(jī)設(shè)計(jì)的單因素方差分析(one-way ANOVA)進(jìn)行多組均值的組間差異比較。

2 結(jié) 果

2.1白藜蘆醇抑制氧化應(yīng)激引起的ERS 與對(duì)照組相比,H2O2使GRP78和GRP94蛋白表達(dá)明顯增加,白藜蘆醇明顯抑制此作用,釕紅明顯加強(qiáng)了白藜蘆醇的作用(P<0.05),說明白藜蘆醇可能通過MCU抑制氧化應(yīng)激引起ERS。見圖1、表1。

1～4:對(duì)照組、H2O2組、白藜蘆醇+H2O2組、釕紅+白藜蘆醇+過氧化氫組

2.2白藜蘆醇通過MCU抑制氧化應(yīng)激 與對(duì)照組相比,H2O2處理后的心肌細(xì)胞LDH漏出明顯增加,白藜蘆醇明顯減少H2O2誘導(dǎo)的LDH增多,而釕紅明顯加強(qiáng)了白藜蘆醇的作用(P<0.05),說明氧化應(yīng)激誘導(dǎo)心肌細(xì)胞損傷,白藜蘆醇可能通過MCU抑制氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷。見表1。

2.3白藜蘆醇對(duì)MCU蛋白表達(dá)的影響 與NC組(1.00±0.06)比較,MCU374、MCU761及MCU984組MCU siRNA活性(0.81±0.05、0.48±0.08、0.61±0.04)顯著降低(F=42.39,P<0.05),說明3種MCU siRNA均可沉默MCU,其中MCU761沉默效率>50%,故后續(xù)實(shí)驗(yàn)采用MCU siRNA 761。與對(duì)照組相比,H2O2使MCU蛋白表達(dá)明顯增加,白藜蘆醇明顯抑制了H2O2的作用,而釕紅明顯加強(qiáng)了白藜蘆醇的作用(P<0.05)。說明白藜蘆醇通過MCU抑制H2O2誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激。與NC siRNA Con組(1.00±0.02)比較,NC siRNA H2O2組MCU 蛋白表達(dá)(2.05±0.17)顯著增高(P<0.05)。與NC siRNA H2O2組比較,NC siRNA Res+H2O2組MCU 蛋白表達(dá)(1.44±0.21)顯著降低(P<0.05)。與NC siRNA Res+H2O2組比較,MCU siRNA Res+H2O2組MCU 蛋白表達(dá)(0.80±0.11)顯著降低(P<0.05)。以上結(jié)果證實(shí)白藜蘆醇通過MCU抑制H2O2誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激。見圖1、表1、圖2、圖3。

2.4白藜蘆醇對(duì)細(xì)胞內(nèi)Ca2+的影響 與對(duì)照組相比,過氧化氫使Fluo-4AM綠色熒光強(qiáng)度顯著增強(qiáng)(P<0.05),說明氧化應(yīng)激使細(xì)胞內(nèi)Ca2+增多,白藜蘆醇明顯抑制了過氧化氫引起的熒光強(qiáng)度增強(qiáng),而釕紅明顯加強(qiáng)了白藜蘆醇的作用(P<0.05),說明白藜蘆醇通過MCU抑制過氧化氫誘導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)Ca2+超載。見表1、圖4。

2.5白藜蘆醇對(duì)細(xì)胞內(nèi)ROS的影響 與對(duì)照組相比,H2O2使H9c2心肌細(xì)胞中DCFH-DA綠色熒光強(qiáng)度顯著增強(qiáng),白藜蘆醇明顯抑制H2O2引起的熒光強(qiáng)度增強(qiáng),而釕紅則明顯增強(qiáng)了白藜蘆醇的作用(P<0.05),說明白藜蘆醇通過MCU抑制H2O2誘導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)ROS增多。見表1、圖4。

2.6白藜蘆醇對(duì)線粒體膜電位(mPTP開放)的影響 與對(duì)照組相比,H2O2使線粒體TMRE紅色熒光強(qiáng)度顯著降低,白藜蘆醇明顯抑制了TMRE熒光強(qiáng)度的降低,而釕紅明顯增強(qiáng)了白藜蘆醇的作用(P<0.05),說明白藜蘆醇通過MCU抑制H2O2誘導(dǎo)的mPTP開放。見表1、圖5。

表1 各組GRP78、GRP94、LDH、MCU蛋白表達(dá)及Fluo4-AM、DCF、線粒體膜電位(mPTP開放)的影響

圖2 Western印跡檢測(cè)MCU siRNA表達(dá)

1～4:NC siRNA Con組、NC siRNA H2O2組、NC siRNA Res+H2O2組、MCU siRNA Res+H2O2組

圖4 激光掃描共聚焦顯微鏡檢測(cè)白藜蘆醇對(duì)細(xì)胞內(nèi)Ca2+及ROS的影響(×500)

圖5 激光掃描共聚焦顯微鏡檢測(cè)白藜蘆醇對(duì)線粒體膜電位(mPTP開放)的影響(×500)

3 討 論

心血管病是國(guó)內(nèi)致死或致殘的主要原因之一,且近年來,隨著社會(huì)生活水平的不斷發(fā)展,冠心病的發(fā)病率也隨之升高,防治心血管疾病刻不容緩〔11〕。心血管病的發(fā)病機(jī)制包括氧化應(yīng)激、線粒體損傷、凋亡、自噬、Ca2+超載等,其中氧化應(yīng)激損傷是致病的主要因素。

白藜蘆醇是從植物中提取的多酚類化合物,也是植物體在惡劣環(huán)境或遇到病毒侵害時(shí)分泌的一種抗毒素,可從不同植物品種中獲得,其中葡萄、虎杖、花生等藥用植物中的含量較高。研究表明,白藜蘆醇可以保護(hù)H9c2心肌細(xì)胞免受缺氧/復(fù)氧損傷,可能與激活PTEN誘導(dǎo)激酶(PINK)1/Parkin信號(hào)通路促進(jìn)線粒體自噬有關(guān)〔12〕。也有研究證明,白藜蘆醇通過血紅素加氧酶1的上調(diào)作用降低MiR-136-5p的表達(dá),并對(duì)百草枯誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用〔13〕。課題組前期研究證實(shí),白藜蘆醇通過增加細(xì)胞內(nèi)的鋅離子進(jìn)而抑制mPTP開放保護(hù)心肌細(xì)胞,進(jìn)一步研究證實(shí),鋅離子通過線粒體MCU阻止mPTP開放,發(fā)揮H9c2心肌細(xì)胞保護(hù)作用。氧化應(yīng)激是心肌細(xì)胞死亡的重要原因,白藜蘆醇是否通過mPTP和MCU減輕心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷尚不得而知。

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是心肌細(xì)胞重要細(xì)胞器,主要參與細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)合成、鈣穩(wěn)態(tài)和凋亡的調(diào)節(jié)。當(dāng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)出現(xiàn)功能紊亂和應(yīng)激的時(shí)候,會(huì)誘發(fā)蛋白錯(cuò)誤折疊,缺血缺氧、氧化應(yīng)激等內(nèi)在應(yīng)激刺激,可誘發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)折疊蛋白質(zhì)過程紊亂,即ERS。MCU位于線粒體內(nèi)膜并負(fù)責(zé)線粒體內(nèi)Ca2+的轉(zhuǎn)運(yùn),通過MCU攝取的Ca2+失調(diào)會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞功能紊亂,最終細(xì)胞凋亡。線粒體Ca2+的攝取需要MCU復(fù)合物共同完成,MCU復(fù)合物包括MCU及調(diào)節(jié)亞基(MICU、MCUb、EMRE)〔14〕。線粒體是細(xì)胞產(chǎn)生三磷酸腺苷(ATP)的場(chǎng)所,其參與體內(nèi)多種代謝和信號(hào)調(diào)節(jié),線粒體受損可引發(fā)細(xì)胞或器官損傷,線粒體完整性在減輕心肌細(xì)胞損傷中起著關(guān)鍵作用,是心肌細(xì)胞正常存活的關(guān)鍵調(diào)節(jié)點(diǎn)。有文獻(xiàn)表明,中等濃度的H2O2后處理顯著激活線粒體信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活蛋白(STAT)3,并抑制MCU減輕缺血再灌注誘導(dǎo)的心室肌細(xì)胞鈣超載和收縮抑制〔15〕。此外,MCU在缺血再灌注期間過度開放,并通過MCU-Ca2+超載-mPTP開放的機(jī)制參與心肌再灌注損傷〔16〕。由此,本文推測(cè),白藜蘆醇可能通過MCU抑制mPTP開放,發(fā)揮心肌細(xì)胞保護(hù)作用。LDH是臨床診療中常見的心肌損傷評(píng)估指標(biāo)之一,也是診斷心肌梗死的常用指標(biāo)。LDH有5個(gè)同工酶,其中心臟或心肌細(xì)胞中的含量較多,當(dāng)細(xì)胞因外界因素受損時(shí),心肌細(xì)胞中的LDH由于膜通透性改變釋放到細(xì)胞外液中,LDH含量與心肌細(xì)胞受損程度呈正相關(guān)。本文提示,白藜蘆醇可能通過MCU抑制H2O2誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷,發(fā)揮心肌細(xì)胞保護(hù)作用。

Ca2+是細(xì)胞內(nèi)重要的第二信使,在細(xì)胞正常代謝中發(fā)揮重要作用。Ca2+超載導(dǎo)致ROS類物質(zhì)過度生成,mPTP開放,線粒體裂變過度,最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡〔17〕。MCU是線粒體膜上的Ca2+通道蛋白,白藜蘆醇抑制過氧化氫引起的MCU增加,白藜蘆醇可能影響細(xì)胞Ca2+代謝。本研究說明,氧化應(yīng)激使細(xì)胞內(nèi)Ca2+超載,白藜蘆醇通過MCU抑制氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)Ca2+超載。細(xì)胞中ROS的增多破壞抗氧化防御的相對(duì)平衡狀態(tài),從而引發(fā)細(xì)胞氧化應(yīng)激反應(yīng),最終加速心肌細(xì)胞凋亡。同時(shí),ROS導(dǎo)致Ca2+穩(wěn)態(tài)破壞,線粒體內(nèi)Ca2+超載,并介導(dǎo)mPTP開放〔18〕。由此可見,ROS大量生成和細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度相關(guān)。本研究結(jié)果說明,氧化應(yīng)激使細(xì)胞內(nèi)ROS增多,白藜蘆醇通過MCU抑制H2O2誘導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)ROS增多。

線粒體通過氧化磷酸化產(chǎn)生ATP,是能量代謝、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的重要細(xì)胞器,在心臟疾病的發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮重要作用,是心肌損傷后心肌細(xì)胞命運(yùn)的決定因素。ROS的過度產(chǎn)生、細(xì)胞Ca2+超載等引發(fā)mPTP開放,使線粒體膜電位下降,線粒體ATP產(chǎn)生障礙并啟動(dòng)細(xì)胞死亡途徑,因此,mPTP是心肌保護(hù)重要靶點(diǎn)。本課題組先前研究證明,白藜蘆醇通過細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(ERK)/糖原合成酶激酶(GSK)-3β通路增加細(xì)胞內(nèi)Zn2+阻止mPTP開放,保護(hù)H9c2心肌細(xì)胞,進(jìn)一步研究顯示,Zn2+通過MCU阻止mPTP的開放。本文結(jié)果提示,白藜蘆醇通過MCU抑制H2O2誘導(dǎo)的mPTP開放,保護(hù)H9c2心肌細(xì)胞。