符基定 曾麗斯 林頡 韋伊爾 徐維 徐睿 冼樂武

(廣州醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院1.重癥醫(yī)學(xué)科;2.腫瘤研究所;3.放療科;4.胸外科;5.腫瘤內(nèi)科,廣東 廣州 510095)

程序性死亡受體1/程序性死亡配體1(Programmed cell death 1/Programmed cell death-ligand 1,PD-1/PD-L1)免疫檢查點(diǎn)抑制劑通過阻斷PD-1/PD-L1靶向免疫細(xì)胞通路,從而抑制腫瘤細(xì)胞免疫逃逸,其已被應(yīng)用于各種類型的癌癥治療[1-2]。但PD-1/PD-L1免疫檢查點(diǎn)抑制劑對(duì)心血管系統(tǒng)有著明顯影響,可產(chǎn)生心臟驟停、心源性休克和完全性房室傳導(dǎo)阻滯等嚴(yán)重后果,且炎性反應(yīng)介導(dǎo)的心臟毒性可涉及心臟的任何部分[3]。已有研究發(fā)現(xiàn)PD-1/PD-L1抑制劑可將心臟巨噬細(xì)胞極化為M1樣表型而誘導(dǎo)心臟損傷[4]。細(xì)胞因子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制因子3(Suppressor of cytokine signaling 3, SOCS3)是細(xì)胞因子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)負(fù)調(diào)控因子,其在巨噬細(xì)胞極化中發(fā)揮的重要作用,已有研究發(fā)現(xiàn)脂多糖(Lipolyaccharide, LPS)促進(jìn)大鼠巨噬細(xì)胞M1型極化,并顯著升高SOCS3的表達(dá)進(jìn)而促進(jìn)巨噬細(xì)胞炎癥反應(yīng)[5-6]。另外,研究發(fā)現(xiàn)SOCS3是蛋白酪氨酸激酶/信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)子與轉(zhuǎn)錄激活子3(Janus kinase/signal transducer and activator of transcription 3,JAK/STAT3)通路的負(fù)調(diào)控因子,其直接抑制JAK激酶的活性,進(jìn)而抑制STAT3的激活,這一現(xiàn)象對(duì)克服過度的組織炎癥和防止炎癥免疫反應(yīng)期間的組織損傷有重要意義[7-8]。因此,本研究旨在探討SOCS3調(diào)控JAK/STAT3信號(hào)通路對(duì)巨噬細(xì)胞極化的作用機(jī)制,以及其在PD-1/PD-L1抑制劑誘導(dǎo)的小鼠心臟毒性的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 50只SPF級(jí)6周齡BALB/c小鼠購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司[許可證號(hào):SCXK(X)2016-0011],體重(21.0±4.5)g。所有小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)一周,喂養(yǎng)在18～22 ℃,12 h/12 h明暗交替動(dòng)物房中,自由飲水喂食。本研究已獲得本院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(批準(zhǔn)號(hào):WDKQSPF/SQ-03)。

1.2 主要實(shí)驗(yàn)材料與試劑 小鼠巨噬細(xì)胞RAW 264.7購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫。BMS-1(PD-1/PD-L1 抑制劑,純度99.56%,HY-19991)、AG490(JAK/STAT3通路抑制劑,純度99.97%,HY-12000)、LPS(HY-D1056)購自美國(MedChemExpress)MCE公司;pc-SOCS3和對(duì)照物、si- SOCS3和對(duì)照物購自廣州銳博生物科技有限公司;Lipofectamine?3000 Transfection Reagentt轉(zhuǎn)染試劑(L3000-015)購自美國Invitrogen公司;流式細(xì)胞術(shù)抗體CD86(70-AM08605-50)、CD80(70-AM08005-50)購自杭州聯(lián)科生物技術(shù)股份有限公司;小鼠IL-10(E-EL-M0046c)、TNF-α(E-EL-M3063)和IL-1β(E-EL-M0037c)購自武漢伊萊瑞特公司;抗體SOCS3(ab16030)、CD86(ab220188)、CD80(ab238481)、p-JAK1(ab138005)、JAK1(ab133666)、p-JAK2(ab32101)、JAK2(ab108596)、p-STAT3(ab76315)、STAT3(ab68153)、GAPDH(ab8245)、辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗(ab288151)購自英國abcam公司。

1.3 方法

1.3.1 細(xì)胞轉(zhuǎn)染和分組 RAW 264.7細(xì)胞培養(yǎng)在含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中,在37 ℃含5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細(xì)胞傳3代后,將所有細(xì)胞分為對(duì)照組(正常培養(yǎng))、LPS組[9](LPS 100 ng/mL)、pc-NC組[轉(zhuǎn)染pc-NC(pc-SOCS3對(duì)照物)+LPS 100 ng/mL]、pc-SOCS3組(轉(zhuǎn)染pc-SOCS3+LPS 100 ng/mL,使細(xì)胞過表達(dá)SOCS3)、si-NC組[轉(zhuǎn)染si-NC(si-SOCS3對(duì)照物)+LPS 100 ng/mL]、si-SOCS3組(轉(zhuǎn)染si-SOCS3+LPS 100 ng/mL,使細(xì)胞低表達(dá)SOCS3)、抑制劑組[10](轉(zhuǎn)染si-SOCS3+LPS 100 ng/mL+ JAK/STAT3通路抑制劑AG490 10 μmol/L)。LPS組使用100 ng/mL LPS直接處理細(xì)胞24 h,除對(duì)照組和LPS組外,各轉(zhuǎn)染組通過Lipofectamine3000試劑分別轉(zhuǎn)染pc-SOCS3和對(duì)照物、si-SOCS3和對(duì)照物至RAW264.7細(xì)胞中,然后使用100 ng/mL LPS處理24 h,抑制劑組細(xì)胞轉(zhuǎn)染si-SOCS3后,100 ng/mL LPS和10 μmol/L JAK/STAT3通路抑制劑AG490共處理24 h。

1.3.2 動(dòng)物造模與分組 所有BALB/c小鼠分為正常組、模型組[6](PD-1/PD-L1抑制劑BMS-1 10 mg/kg)、si-NC組(10 mg/kg BMS-1+si-NC)、si-SOCS3組(10 mg/kg BMS-1+ si-SOCS3)、抑制劑組[11](10 mg/kg BMS-1+ si-SOCS3+5mg/kg AG490),每組10只。除正常組外,其余各組小鼠每2天腹腔注射10 mg/kg BMS-1,共注射6次,建立PD-1/PD-L1抑制劑誘導(dǎo)的小鼠心臟毒性模型,40只小鼠均造模成功。造模結(jié)束后,si-NC組尾靜脈注射200 μL si-NC,SOCS3組和抑制劑組尾靜脈注射200 μL si-NC和si-SOCS3,濃度均為50 μmol/L,每只小鼠每次注射劑量均為10 nmol,其余小鼠尾靜脈注射等量生理鹽水。另外,抑制劑組在尾靜脈注射si-SOCS3的同時(shí)腹腔注射5 mg/kg AG490,其余各組腹腔注射相應(yīng)劑量生理鹽水,所有小鼠連續(xù)干預(yù)2周,每周3次。最后一次治療結(jié)束24 h后,小鼠稱重后麻醉,1 mL一次性無菌注射器自心尖處取血,離心后將血清凍存在-80 ℃?zhèn)溆?然后取出小鼠心臟組織,準(zhǔn)確稱重后計(jì)算心臟指數(shù),各組隨機(jī)取5只小鼠心臟組織固定在4%多聚甲醛中,另5只凍存在-80 ℃冰箱中。

1.3.3 HE染色觀察小鼠心臟組織病理 取出固定在多聚甲醛中的各組小鼠心臟組織,經(jīng)乙醇脫水后使用石蠟包埋并切成5 μm切片,經(jīng)脫蠟脫水后使用HE染色。光學(xué)顯微鏡評(píng)估心臟組織病理。

1.3.4 ELISA法檢測(cè)細(xì)胞上清和小鼠血清IL-10、TNF-α和IL-1β水平 各組細(xì)胞上清和小鼠血清IL-10、TNF-α和IL-1β水平通過ELISA試劑盒檢測(cè),具體操作步驟嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行。

1.3.5 Western blot檢測(cè)細(xì)胞和小鼠心臟組織SOCS3、CD86、CD80、JAK/STAT3通路相關(guān)蛋白 提取各組細(xì)胞和凍存的小鼠心臟組織總蛋白,BCA法檢測(cè)蛋白濃度。使用SDS-PAGE分離蛋白質(zhì)樣品,然后轉(zhuǎn)移到PVDF膜上,將其與一抗SOCS3、CD86、CD80、p-JAK1、JAK1、p-JAK2、JAK2、p-STAT3、STAT3、GAPDH在4 ℃下孵育過夜,然后用辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗孵育2 h,使用ECL試劑顯影,Image J軟件對(duì)蛋白條帶灰度值進(jìn)行量化。

2 結(jié)果

2.1 SOCS3對(duì)RAW264.7細(xì)胞SOCS3、CD86、CD80以及JAK/STAT3通路蛋白表達(dá) 與對(duì)照組相比,LPS組細(xì)胞SOCS3、CD86、CD80 蛋白表達(dá)明顯升高,p-JAK1、p-JAK2、p-STAT3蛋白表達(dá)明顯降低(P<0.05);與LPS組和pc-NC組相比,pc-SOCS3組細(xì)胞SOCS3、CD86、CD80蛋白表達(dá)明顯升高,p-JAK1、p-JAK2、p-STAT3 蛋白表達(dá)明顯降低(P<0.05);與LPS組和si-NC組相比,si-SOCS3組細(xì)胞SOCS3、CD86、CD80蛋白表達(dá)明顯降低,p-JAK1、p-JAK2、p-STAT3 蛋白表達(dá)明顯升高(P<0.05);與si-SOCS3組相比,抑制劑組細(xì)胞CD86、CD80蛋白表達(dá)明顯升高,p-JAK1、p-JAK2、p-STAT3 蛋白表達(dá)明顯降低(P<0.05),見圖1、表1。

表1 SOCS3對(duì)RAW264.7細(xì)胞SOCS3、CD86、CD80以及JAK/STAT3通路蛋白表達(dá)

圖1 SOCS3對(duì)RAW264.7細(xì)胞SOCS3、CD86、CD80以及JAK/STAT3通路蛋白表達(dá)

2.2 SOCS3對(duì)RAW264.7細(xì)胞上清TNF-α、IL-1β、IL-10的影響 與對(duì)照組相比,LPS組細(xì)胞上清TNF-α、IL-1β水平明顯升高,IL-10水平明顯降低(P<0.05);與LPS組和pc-NC組相比,pc-SOCS3組細(xì)胞上清TNF-α、IL-1β水平明顯升高,IL-10水平明顯降低(P<0.05);與LPS組和si-NC組相比,si-SOCS3組細(xì)胞上清TNF-α、IL-1β水平明顯降低,IL-10水平明顯升高(P<0.05);與si-SOCS3組相比,抑制劑組細(xì)胞上清TNF-α、IL-1β水平明顯升高,IL-10水平明顯降低(P<0.05),見表2。

表2 SOCS3對(duì)RAW264.7細(xì)胞上清TNF-α、IL-1β、IL-10的影響

2.3 SOCS3對(duì)PD-1/PD-L1抑制劑所致小鼠心臟指數(shù)和病理的影響 與正常組相比,模型組小鼠心臟指數(shù)明顯升高(P<0.05);與模型組和si-NC組相比,si-SOCS3組小鼠心臟指數(shù)明顯降低(P<0.05);與si-SOCS3組相比,抑制劑組小鼠心臟指數(shù)明顯升高(P<0.05)(表3)。HE染色結(jié)果顯示,正常組小鼠心臟組織結(jié)構(gòu)正常,心肌細(xì)胞排列整齊;模型組和si-NC組小鼠心臟組織紋理不清晰,結(jié)構(gòu)紊亂,伴有炎性浸潤;si-SOCS3組小鼠心臟組織損傷較模型組和si-NC組有所減輕,抑制劑組加重了小鼠心臟損傷,見圖2。

表3 SOCS3對(duì)PD-1/PD-L1抑制劑所致小鼠心臟指數(shù)的影響

圖2 小鼠心臟HE染色(200×)

2.4 SOCS3對(duì)PD-1/PD-L1抑制劑所致小鼠血清IL-10、TNF-α和IL-1β的影響 與正常組相比,模型組小鼠血清TNF-α、IL-1β水平明顯升高,IL-10水平明顯降低(P<0.05);與模型組和si-NC組相比,si-SOCS3組小鼠血清TNF-α、IL-1β水平明顯降低,IL-10水平明顯升高(P<0.05);與si-SOCS3組相比,抑制劑組小鼠血清TNF-α、IL-1β水平明顯升高,IL-10水平明顯降低(P<0.05),見表4。

表4 SOCS3對(duì)PD-1/PD-L1抑制劑所致小鼠血清IL-10、TNF-α和IL-1β的影響

2.5 SOCS3對(duì)PD-1/PD-L1抑制劑所致小鼠心臟組織SOCS3、CD86、CD80以及JAK/STAT3通路蛋白表達(dá) 與正常組相比,模型組小鼠心臟組織SOCS3、CD86、CD80蛋白表達(dá)明顯升高,p-JAK1、p-JAK2、p-

STAT3蛋白表達(dá)明顯降低(P<0.05);與模型組和si-NC組相比,si-SOCS3組小鼠心臟組織SOCS3、CD86、CD80蛋白表達(dá)明顯降低,p-JAK1、p-JAK2、p-STAT3蛋白表達(dá)明顯升高(P<0.05);與si-SOCS3組相比,抑制劑組小鼠心臟組織CD86、CD80表達(dá)明顯升高,p-JAK1、p-JAK2、p-STAT3蛋白表達(dá)明顯降低(P<0.05),見圖3、表5。

表5 SOCS3對(duì)PD-1/PD-L1抑制劑所致小鼠心臟組織SOCS3、CD86、CD80以及JAK/STAT3通路蛋白表達(dá)

圖3 SOCS3對(duì)PD-1/PD-L1抑制劑所致小鼠心臟組織SOCS3、CD86、CD80以及JAK/STAT3通路蛋白表達(dá)

3 討論

巨噬細(xì)胞參與了自身免疫和炎癥性疾病,在宿主防御和維持內(nèi)部環(huán)境穩(wěn)定方面發(fā)揮極其重要的作用[12]。一般認(rèn)為LPS會(huì)誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞M1型極化,M1型巨噬細(xì)胞通過分泌大量的炎癥因子,如IL-1β、TNF-α參與身體的炎癥反應(yīng)[13]。作為SOCS家族的重要分子,大量研究表明SOCS3可被多種炎癥因子和抗炎因子誘導(dǎo)表達(dá),并抑制多種免疫分子的信號(hào)傳導(dǎo),其也是巨噬細(xì)胞功能的重要調(diào)節(jié)因子[14]。已有研究發(fā)現(xiàn)SOCS3可促進(jìn)巨噬細(xì)胞極化為M1型[15]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)LPS誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞后,SOCS3表達(dá)明顯升高,并且刺激細(xì)胞分泌IL-1β、TNF-α促炎因子,抗炎因子IL-10分泌減少,M1型巨噬細(xì)胞標(biāo)志物CD86和CD80表達(dá)明顯升高,過表達(dá)SOCS3后,巨噬細(xì)胞M1型極化和炎癥反應(yīng)進(jìn)一步增加,低表達(dá)SOCS3抑制了巨噬細(xì)胞M1型極化和炎癥反應(yīng),表明LPS成功誘導(dǎo)了巨噬細(xì)胞M1型極化,SOCS3參與巨噬細(xì)胞M1型極化。

SOCS3通過抑制STAT3的磷酸化及其二聚體的形成或者直接抑制JAK的磷酸化負(fù)向調(diào)節(jié)JAK-STAT3 信號(hào)通路,在免疫炎癥反應(yīng)中起關(guān)鍵作用[5]。Chi等[16]研究發(fā)現(xiàn)敲低SOCS3的表達(dá),明顯激活JAK2/STAT3信號(hào)通路并抑制巨噬細(xì)胞M1極化。另外,Geng等[17]研究發(fā)現(xiàn),LPS刺激后,SOCS3需達(dá)到一定水平后,才可抑制JAK/STAT信號(hào)通路。本研究結(jié)果顯示,LPS明顯促進(jìn)SOCS3的表達(dá),而抑制JAK1、JAK2以及STAT3磷酸化表達(dá),低表達(dá)SOCS3后,JAK1、JAK2以及STAT3磷酸化表達(dá)明顯升高,并明顯抑制巨噬細(xì)胞M1型極化,使用JAK/STAT3通路抑制劑后,逆轉(zhuǎn)了SOCS3低表達(dá)對(duì)巨噬細(xì)胞M1型極化和炎癥反應(yīng)的的抑制作用,與Chi等[16]結(jié)果基本一致,表明低表達(dá)SOCS3可通過激活JAK/STAT3通路抑制巨噬細(xì)胞M1型極化。

PD-1/PD-L1免疫檢查點(diǎn)抑制劑已在抗腫瘤治療中取得了巨大的成功,但其會(huì)誘發(fā)廣泛的免疫相關(guān)不良事件,其中心臟毒性是最致命的不良反應(yīng)[18-19]。PD-1/PD-L1免疫檢查點(diǎn)抑制劑誘發(fā)的心臟毒性中炎癥因子風(fēng)暴會(huì)引發(fā)強(qiáng)自由基反應(yīng),進(jìn)而破壞心臟屏障,加重心臟損傷[20-21]。已有研究發(fā)現(xiàn)PD-1/PD-L1治療后引起的炎癥因子風(fēng)暴會(huì)使巨噬細(xì)胞向M1型極化進(jìn)而分泌TNF-α、IL-1β、IL-6等細(xì)胞因子促進(jìn)炎癥反應(yīng)[22]。Chen等[23]研究發(fā)現(xiàn)PD-1/PD-L1抑制劑可促進(jìn)巨噬細(xì)胞M1型極化,并通過增加小鼠炎癥反應(yīng)誘導(dǎo)黑色素瘤小鼠心肌細(xì)胞凋亡和心臟毒性。本研究結(jié)果顯示,PD-1/PD-L1抑制劑明顯誘導(dǎo)小鼠心臟毒性,小鼠血清TNF-α、IL-1β水平、心臟組織SOCS3、CD86、CD80蛋白表達(dá)明顯升高,小鼠血清IL-10水平顯著降低;抑制SOCS3表達(dá)后,明顯減輕小鼠心臟毒性,小鼠血清TNF-α、IL-1β水平、心臟組織SOCS3、CD86、CD80蛋白表達(dá)明顯降低,小鼠血清IL-10水平明顯升高,表明SOCS3參與調(diào)控PD-1/PD-L1抑制劑誘導(dǎo)的小鼠心臟毒性,低表達(dá)SOCS3可抑制小鼠巨噬細(xì)胞M1型極化并抑制小鼠炎癥反應(yīng)。另外,經(jīng)PD-1/PD-L1抑制劑誘導(dǎo)后,小鼠心臟組織JAK1、JAK2以及STAT3磷酸化表達(dá)明顯降低,低表達(dá)SOCS3小鼠心臟組織JAK1、JAK2以及STAT3磷酸化表達(dá)明顯升高,JAK/STAT3抑制劑逆轉(zhuǎn)了低表達(dá)SOCS3對(duì)小鼠心臟組織毒性的減輕作用以及炎癥抑制作用,表明抑制SOCS3表達(dá)可通過激活JAK/STAT3信號(hào)通路減輕PD-1/PD-L1抑制劑對(duì)小鼠的心臟毒性,為臨床PD-1/PD-L1抑制劑誘導(dǎo)的心臟毒性損傷修復(fù)提供新的治療靶點(diǎn)。

4 結(jié)論

在PD-1/PD-L1抑制劑誘導(dǎo)小鼠心臟毒性和巨噬細(xì)胞M1型極化中,SOCS3的表達(dá)明顯升高,抑制SOCS3的表達(dá)可通過激活JAK/STAT3信號(hào)通路,減輕PD-1/PD-L1抑制劑誘導(dǎo)小鼠心臟毒性,并抑制巨噬細(xì)胞M1性極化,表明SOCS3可作為PD-1/PD-L1抑制劑誘導(dǎo)的心臟毒性損傷的新的治療靶點(diǎn),為臨床治療PD-1/PD-L1抑制劑誘導(dǎo)的心臟損傷提供理論依據(jù)。