陳俊凱，于月通，楊 彬，王澤坤，李 靜，陀海欣，徐俊飛，齊 萌

（塔里木大學動物科學與技術學院/新疆生產(chǎn)建設兵團塔里木動物疫病診斷與防控工程實驗室，新疆 阿拉爾 843300）

金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）是一種常見的人獸共患革蘭陽性菌， 可引起人和動物的胃腸道疾病、創(chuàng)傷和血液感染，造成化膿灶、腹膜炎和菌血癥等病癥［1-2］。 治療由金黃色葡萄球菌引起的感染性疾病通常采用抗菌藥物療法，不科學、不合理甚至濫用抗菌藥物導致金黃色葡萄球菌的耐藥性不斷增強，呈現(xiàn)多重耐藥性。 此外，生物被膜的形成使得細菌對抗菌藥物和宿主免疫系統(tǒng)的防御更具有耐受性，有助于菌株在環(huán)境或者宿主中持續(xù)存在［3］。 金黃色葡萄球菌對不同宿主表現(xiàn)出不同致病性。 金黃色葡萄球菌是奶牛乳腺炎的主要致病菌之一。 由金黃色葡萄球菌引起的奶牛乳腺感染持續(xù)時間長，不僅導致奶牛淘汰率上升，還可能對牛奶品質(zhì)產(chǎn)生負面影響，引發(fā)食物中毒， 從而對食品衛(wèi)生安全和人類健康構(gòu)成潛在威脅［4］。 豬感染金黃色葡萄球菌后，常表現(xiàn)出流涕、氣喘、皮膚發(fā)炎等癥狀，其在豬和人類之間傳播所造成的公共衛(wèi)生安全問題已引起人們的關注［5］。 目前，我國豬乳源金黃色葡萄球菌的相關報道較少。 本研究對從新疆維吾爾自治區(qū)阿拉爾市某規(guī)模化養(yǎng)殖場分離到的豬乳源金黃色葡萄球菌進行生物被膜形成能力檢測，并對其致病性及耐藥性進行分析， 以期為豬乳源金黃色葡萄球菌的病原生物學研究提供基礎數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 樣本來源

2022 年10 月， 在新疆維吾爾自治區(qū)阿拉爾市某規(guī)模化養(yǎng)豬場選取外觀健康的哺乳母豬，使用碘酊和75%酒精對其乳房進行消毒后， 用一次性塑料手套擠出乳液，收集至50 mL 的無菌離心管內(nèi)。 共收集6 份新鮮豬乳樣本，標記信息后置4 ℃冷藏箱，送至實驗室，4 ℃冰箱保存。

金黃色葡萄球菌標準菌株ATCC 25923 和具有強生物被膜形成能力的表皮葡萄球菌ATCC 35984，由新疆生產(chǎn)建設兵團塔里木動物疫病診斷與防控工程實驗室保存。

1.1.2 主要試劑及儀器

胰蛋白胨大豆液體 （TSB） 培養(yǎng)基、Mueller-Hinton（MH）肉湯培養(yǎng)基、甘露醇高鹽瓊脂（MSA）培養(yǎng)基，奧博星生物技術（北京）有限責任公司產(chǎn)品；PCR 擴增引物、DL 2 000 DNA Marker、2×Easy Taq PCR Super Mix（+dye）、細菌基因組DNA 提取試劑盒，全式金生物技術（北京）有限公司產(chǎn)品；藥敏片均購自溫州市泰康生物科技有限公司； 革蘭染色試劑，實驗室自行配制；PCR 儀、凝膠成像系統(tǒng)、電泳儀購自Bio-Rad 公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 乳樣處理

取2 mL 乳樣在12 000 r/min 轉(zhuǎn)速下離心2 min后，吸取10 μL 下層乳液，加入5 mL TSB 培養(yǎng)基中，于37 ℃恒溫振蕩搖床中過夜培養(yǎng)增菌。

1.2.2 細菌分離及形態(tài)學鑒定

將富集好的菌液劃線接種到MSA 培養(yǎng)基上，于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h 后， 觀察菌落形態(tài)，挑取單一菌落劃線接種于MSA 培養(yǎng)基上進行純化培養(yǎng)， 純化完成后挑選形態(tài)良好的單菌落進行革蘭染色，用普通光學顯微鏡觀察染色特征，初步鑒定細菌種類。

1.2.3 細菌生化鑒定

經(jīng)形態(tài)學觀察后，參考吳自豪等［6］報道的方法對疑似金黃色葡萄球菌的菌株進行觸酶試驗、凝固酶試驗和甘露醇發(fā)酵試驗。以金黃色葡萄球菌ATCC 25923 為陽性對照，滅菌雙蒸水為空白對照。

1.2.4 細菌基因組DNA 提取和16S rDNA 序列PCR 擴增

對經(jīng)表型鑒定初步判定為金黃色葡萄球菌的分離菌株，按照細菌基因組DNA 提取試劑盒說明書進行基因組DNA 提取。 參照劉肖利等［7］報道的引物序列， 設計合成細菌16S rDNA 通用引物，以分離菌株的基因組DNA 為模板進行PCR 擴增，引物由蘇州金唯智生物科技有限公司合成。 PCR擴增反應體系為25 μL：2×EasyTaq PCR Super Mix（+dye）12.5 μL， 上、 下游引物各0.5 μL，ddH2O 10.5 μL，DNA 模板1 μL，陰性對照為ddH2O。 PCR擴增程序為：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸2 min，34 個循環(huán)；72 ℃最后延伸10 min。 將陽性產(chǎn)物送至蘇州金維智生物科技有限公司進行測序， 對測序結(jié)果進行BLAST （https：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）比對分析后鑒定分離細菌的種類。

1.2.5 金黃色葡萄球菌生物被膜形成能力檢測

分別以表皮葡萄球菌ATCC 35984 和雙蒸水為陽性對照和空白對照，參考Ren 等［8］報道的方法對金黃色葡萄球菌進行生物被膜形成能力檢測與判定。 生物被膜形成能力分為4 個等級：強（+++；OD570nm值>0.39）、中等（++；0.39>OD570nm值>0.26）、弱（+；0.26>OD570nm值>0.13）和陰性（-；OD570nm值<0.13）。

1.2.6 金黃色葡萄球菌藥物敏感性試驗

采用K-B 紙片擴散法檢測10 類12 種抗菌藥物對分離菌株的敏感性， 包括β-內(nèi)酰胺類：青霉素、頭孢西?。宦让顾仡悾郝让顾?；大環(huán)內(nèi)酯類：紅霉素、替米考星；利福霉素類：利福平；四環(huán)素類：四環(huán)素；氟喹諾酮類：環(huán)丙沙星；林可酰胺類：克林霉素；酰胺醇類：氟苯尼考；氨基糖苷類：慶大霉素；磺胺類：磺胺甲噁唑。 以金黃色葡萄球菌標準菌株ATCC 25923 為質(zhì)控菌株。根據(jù)美國臨床和實驗室標準協(xié)會指南（CLSI，2021）發(fā)布的相關標準進行藥物敏感性試驗操作和結(jié)果判定。

1.2.7 金黃色葡萄球菌耐藥基因檢測

參照文獻［9-10］報道的引物序列，設計5 種耐藥基因引物，采用PCR 法檢測金黃色葡萄球菌分離株的耐藥基因攜帶情況，引物由蘇州金唯智生物科技有限公司合成。 檢測的耐藥基因包括慶大霉素耐藥基因ant（4）、紅霉素耐藥基因ermA、頭孢西丁耐藥基因mecA、 利奈唑胺耐藥基因optrA和克林霉素耐藥基因ermS。耐藥基因PCR 擴增反應體系同“1.2.4”項下；PCR 擴增程序均為：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性30 s，50 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，30 個循環(huán)；72 ℃最后延伸10 min。 PCR 擴增結(jié)束后， 采用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增產(chǎn)物，使用凝膠成像儀拍照。

1.2.8 金黃色葡萄球菌毒力基因檢測

參照文獻［11-14］報道的引物序列，設計20種毒力基因引物，采用PCR 法檢測金黃色葡萄球菌分離株的毒力基因攜帶情況， 引物由蘇州金唯智生物科技有限公司合成。 毒力基因包括編碼葡萄 球 菌 腸 毒 素 的 基 因sea、seb、sec、sed、see、seg、seh、sei 和sej，毒性休克綜合征毒素基因tsst-1，剝脫毒素基因eta 和etb，Panton-Valentine 殺白細胞素基因lukF，溶血素基因hla 和hlb，纖連蛋白結(jié)合蛋白基因fnbA 和fnbB， 凝聚因子基因clfA 和clfB， 以及膠原蛋白黏附素基因cna。 毒力基因PCR 擴增反應體系及程序同“1.2.8”項下。 PCR 擴增結(jié)束后， 采用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增產(chǎn)物，使用凝膠成像儀拍照。

2 結(jié)果與分析

2.1 分離菌株的形態(tài)學觀察和生化鑒定結(jié)果

在6 份豬乳樣本中， 有2 份樣本經(jīng)細菌分離培養(yǎng)后在MSA 培養(yǎng)基中出現(xiàn)圓形、 大小一致、淺黃色或者米黃色的菌落（見圖1）；分別挑取2 份樣本獲得的單個菌落進行革蘭染色鏡檢， 鏡下觀察到了革蘭陽性球菌，呈單個、短鏈或葡萄串狀排列（見圖2）。 生化試驗結(jié)果顯示，2 株分離菌的觸酶試驗、凝固酶試驗和甘露醇發(fā)酵試驗均為陽性。結(jié)合形態(tài)學和生化鑒定結(jié)果，2 株分離菌初步鑒定為金黃色葡萄球菌。

圖1 分離菌株在MSA 培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)

圖2 分離菌株的革蘭染色鏡檢結(jié)果（1 000×）

2.2 分離菌株的16S rDNA 序列PCR 擴增、測序及比對

基于細菌16S rDNA 序列，對2 株疑似金黃色葡萄球菌基因組DNA 樣本進行PCR 擴增。 經(jīng)序列比對分析發(fā)現(xiàn)，2 株分離菌的16S rDNA 序列均與埃及人源金黃色葡萄球菌 （GenBank 登錄號：OP809639） 分離株的16S rDNA 序列同源性為100%。 結(jié)合形態(tài)學觀察結(jié)果、 生化鑒定結(jié)果和16S rDNA 序列分析結(jié)果，將分離到的2 株細菌判定為金黃色葡萄球菌， 分離率為33.33%（2/6），分別命名為No.1 菌株和No.2 菌株（見圖3）。

圖3 分離菌株的16S rDNA 序列PCR 擴增結(jié)果

2.3 豬乳源金黃色葡萄球菌分離株的藥物敏感性試驗

藥物敏感性試驗結(jié)果顯示，在12 種抗菌藥物中， 分離到的2 株金黃色葡萄球菌均對利福平敏感，均對青霉素、頭孢西丁、四環(huán)素、紅霉素、替米考星、克林霉素和磺胺甲噁唑耐藥，對慶大霉素、氟苯尼考、氯霉素和環(huán)丙沙星的耐藥率為50%（見表1）。 2 株分離菌均對3 類以上抗菌藥物表現(xiàn)出耐藥性，因此，為多重耐藥菌。

表1 2 株豬乳源金黃色葡萄球菌分離株的藥物敏感性試驗結(jié)果

2.4 豬乳源金黃色葡萄球菌分離株的生物被膜形成能力測定

根據(jù)結(jié)晶紫半定量測定結(jié)果，2 株分離菌的OD570nm值>0.800，由“1.2.5”項下生物被膜形成能力的判定標準可知，2 株金黃色葡萄球菌均有形成生物被膜的能力。

2.5 豬乳源金黃色葡萄球菌分離株的耐藥基因檢測

在檢測的5 種耐藥基因中，2 株金黃色葡萄球菌分離株均攜帶ant（4）基因和mecA 基因（見圖4），未檢測出ermA、ermS、optrA 基因。

圖4 豬乳源金黃色葡萄球菌部分耐藥基因的PCR 擴增結(jié)果

2.6 豬乳源金黃色葡萄球菌分離株的毒力基因檢測

在檢測的20 種毒力基因中，2 株金黃色葡萄球菌分離株均攜帶seg、sei、hlb、fnbA、clfA 基因；No.1菌株還攜帶hla 基因， 而No.2 菌株不攜帶hla 基因（見圖5）；2 株菌均未檢測出sea、seb、sec、sed、see、seh、sej、tsst-1、eta、etb、lukF、fnbB、clfB、cna 基因。

圖5 豬乳源金黃色葡萄球菌部分毒力基因的PCR 擴增結(jié)果

3 討論

金黃色葡萄球菌主要引起豬的乳腺炎、 關節(jié)炎和創(chuàng)口感染， 近年來有關豬源金黃色葡萄球菌分離鑒定和耐藥情況的報道不斷增多。 在印度，Zehra 等［15］分離得到27 株豬肉源金黃色葡萄球菌，分離率為20.61%（27/131），對8 種藥物呈現(xiàn)耐藥，表現(xiàn)出多重耐藥性。 在我國，蔣松宏等［16］自重慶市某養(yǎng)殖場的106 份豬鼻拭子樣本中分離得到7 株耐大觀霉素金黃色葡萄球菌，分離率為6.60%（7/106），對4 種藥物呈現(xiàn)耐藥，攜帶7 種耐藥基因，表現(xiàn)出多重耐藥性。 Zhang 等［17］自廈門市分離得到130 株豬肉源金黃色葡萄球菌， 發(fā)現(xiàn)123 株攜帶1 個或多個葡萄球菌腸毒素基因，78 株攜帶毒力基因seb， 未發(fā)現(xiàn)毒力基因sed、sej、seo、sep、ser 和seu。 在波蘭，Banaszkiewicz 等［18］分離得到121 株野豬源金黃色葡萄球菌，發(fā)現(xiàn)16 個分離株攜帶1 個或多個葡萄球菌腸毒素基因， 分別有2株、2 株、4 株和11 株攜帶毒力基因seb、sec、see和seh。 在希臘，Pexara 等［19］在屠宰豬扁桃體中分離得到26 株金黃色葡萄球菌， 發(fā)現(xiàn)21 株攜帶葡萄球菌腸毒素基因sea、seb、seg、seh、sei、sej 和中毒性休克綜合征毒素-1 基因（tst）。 該試驗所獲2株豬乳源金黃色葡萄球菌均攜帶seg、sei、hlb、fnbA 與clfA 基因，其中1 株還攜帶hla 基因。 上述研究結(jié)果表明， 不同國家和地區(qū)以及豬源不同部位/組織中都能分離到的金黃色葡萄球菌，但菌株攜帶的毒力基因存在較大差異， 這與宿主生存環(huán)境、用藥情況和地理分布等因素密切相關。

研究發(fā)現(xiàn)， 金黃色葡萄球菌多重耐藥情況越來越嚴重。 Xu 等［20］自湖北省分離得到230 株豬源金黃色葡萄球菌， 對其中127 株分離菌進行藥敏試驗，發(fā)現(xiàn)對復方新諾明、四環(huán)素、紅霉素、克林霉素、氯霉素、環(huán)丙沙星、慶大霉素和苯唑西林的耐藥率分別為100.00%（127/127）、98.43%（125/127）、91.34%（116/127）、91.34%（116/127）、74.80%（95/127）、62.99%（80/127）、34.65%（44/127）和16.54%（21/127）。Zhang 等［21］自湖南省分離得到163 株豬源金黃色葡萄球菌，發(fā)現(xiàn)對鏈霉素、慶大霉素、紅霉素、青霉素、克林霉素、克林霉素、四環(huán)素、氨芐西林、頭孢噻肟、環(huán)丙沙星和復方新諾明耐藥率均大于63.19%（103/163）；163 株金黃色葡萄球菌均攜帶耐藥基因gyrA、aac（6）/aph（2）、tetk；還攜帶耐藥基因blaZ（96.93%，158/16）、tetM（93.87%，153/163）、LinE（88.96%，145/163）、ermA（82.82%，135/168）、sull （72.39%，118/163）、MsrA （17.18%，28/163）和mecA（4.29%，7/163）；Zheng 等［22］自我國東部地區(qū)分離得到63 株豬源耐甲氧西林金黃色葡萄球菌，對克林霉素、氯霉素、紅霉素、慶大霉素以及利奈唑胺的耐藥率分別為95.24%（60/63）、76.19% （48/63）、49.21% （31/63）、3.17% （2/63） 和1.59%（1/63）。

本研究中2 株豬乳源金黃色葡萄球菌對青霉素、頭孢西丁、四環(huán)素、紅霉素、替米考星、克林霉素以及磺胺甲噁唑耐藥率均為100%，均攜帶耐藥基因blaZ、ant（4）和mecA，具有多重耐藥性，與上述報道結(jié)果相一致，提示在臨床生產(chǎn)中，在對患病動物進行藥物治療時，應合理用藥，避免致病菌產(chǎn)生更多的耐藥性。

4 結(jié)論

阿拉爾市某規(guī)?；B(yǎng)殖場豬乳源金黃色葡萄球菌生物被膜形成能力強， 攜帶多種毒力基因和耐藥基因，表現(xiàn)為多重耐藥性。