楚 瀚，王新全，齊沛沛，王 揚，吳 振，汪志威*

（1.寧波大學 食品科學與工程學院，浙江 寧波 315000；2.浙江省農(nóng)業(yè)科學院農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全與營養(yǎng)研究所，浙江 杭州 310000；3.浙江省水產(chǎn)技術(shù)推廣總站，浙江 杭州 310000）

近10年來，我國水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)產(chǎn)值呈逐年增長趨勢。截至2021年，淡水漁業(yè)生產(chǎn)總量達3 289.76萬噸，約占所有水產(chǎn)品產(chǎn)值的59.1%［1］，是我國重要的食品來源。水產(chǎn)養(yǎng)殖與運輸中使用的餌料和藥物以及來自周圍工農(nóng)業(yè)區(qū)的污染物，最終可能進入養(yǎng)殖環(huán)境并影響水產(chǎn)品［2］，進而對人類健康產(chǎn)生威脅。地西泮（Diazepam）亦稱為安定，屬于長效苯二氮卓類藥物，可起到鎮(zhèn)靜、抗驚厥等作用［3］。地西泮可轉(zhuǎn)化為去甲西泮、替馬西泮、奧沙西泮等，這些代謝物具有生物活性，臨床被用于人和動物的鎮(zhèn)靜催眠［4］。目前，地西泮污染可能存在3 種途徑：餌料中添加地西泮以降低養(yǎng)殖魚活力，便于垂釣人員釣?。贿\輸過程中添加，以降低養(yǎng)殖魚活動，提高運輸成活率；人使用的地西泮隨排泄進入水體，導致其廣泛存在于污水廠的流出物、地表水、沉積物甚至動植物中［5］。目前準確來源尚不清晰，上述途徑均可能造成水產(chǎn)品中地西泮及其代謝物超標［6］。浙江省2022 年養(yǎng)殖魚蝦風險藥物監(jiān)督抽查結(jié)果顯示，地西泮的超標數(shù)最多，而地西泮檢出樣品中鯽魚占比最多（達38.4%）。而植物可有效降低水體中的地西泮污染，為評估水生植物去除水中地西泮及代謝物時的殘留污染風險及其賦存狀態(tài)，有必要建立一種檢測植物中地西泮及其代謝物的方法［7］，目前未見相關(guān)研究。因此，建立養(yǎng)殖水、植物、沉積物和鯽魚中地西泮及其代謝物的多殘留分析方法具有重要意義。

現(xiàn)行標準GB 29697-2013《動物性食品中地西泮和安眠酮多殘留的測定 氣相色譜-質(zhì)譜法》［8］、常青等［9］及馬麗莎等［10］均采用氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（GC-MS/MS）檢測地西泮及其代謝物，但進樣前需要置換溶劑和衍生化，操作繁瑣。其他檢測方法還有高效液相色譜法（HPLC）［11-12］和液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（LC-MS/MS）［4，13-15］。但HPLC 法存在基質(zhì)干擾，易出現(xiàn)假陽性結(jié)果，且靈敏度較低。LC-MS/MS 法的靈敏度更高，能滿足多種基質(zhì)中地西泮及其代謝物的測定要求，因此本研究擬基于該方法建立養(yǎng)殖水、植物、沉積物和鯽魚中地西泮及其代謝物的測定方法，以期為水產(chǎn)養(yǎng)殖和環(huán)境修復領(lǐng)域提供可靠的技術(shù)支持。

植物、沉積物和鯽魚中地西泮及其代謝物的常見提取方式有鹽析提取、直接提?。?3-14］等，凈化方式有固相萃?。⊿PE）［16-17］和QuEChERS［18-19］法。本研究對比了地西泮及其代謝物在植物、沉積物和鯽魚中的提取方式，探討了不同固相萃取柱和QuEChERS 法對樣品凈化效果的影響，建立了乙腈鹽析提取結(jié)合不同凈化方式凈化植物、沉積物和鯽魚樣品，固相萃取法凈化養(yǎng)殖水樣品，LC-MS/MS 檢測上述樣品中地西泮及其代謝物的方法。該方法的準確度高，能滿足批量檢測養(yǎng)殖水、植物、沉積物和鯽魚中地西泮及其代謝物的需求。

1 實驗部分

1.1 儀器與裝置

EXPEC 5210 高效液相色譜儀與三重四極桿質(zhì)譜儀（杭州譜育科技發(fā)展有限公司）；X4R Pro 型臺式離心機（美國Thermo Scientific 公司）；ETP48-Mix50旋渦混合器（上海英芮誠生化科技有限公司）；12孔固相萃取裝置（美國Supelco 公司）；針式濾器（有機相，0.22 μm，上海安譜實驗科技股份有限公司）；固相萃取柱Prime HLB（150 mg/3 mL）、MCX 凈化柱（150 mg/6 mL）、HLB 凈化柱（150 mg/6mL）和WCX凈化柱（150 mg/6 mL）（美國Waters 公司）；QuEChERS 凈化管（含150 mg C18、150 mg PSA、900 mg MgSO4）（美國Waters公司）；TTL-DCⅡ型氮氣吹干儀（北京同泰聯(lián)科技發(fā)展有限公司）；0.45 μm玻璃纖維膜（英國Whatman公司）。

1.2 材料與試劑

地西泮（純度＞99.3%）、去甲西泮（純度＞99.9%）、奧沙西泮（純度＞99.9%）、替馬西泮（純度＞99.7%），質(zhì)量濃度均為100 mg/L（天津阿爾塔科技有限公司）；甲醇、乙腈、乙酸乙酯（色譜純，美國Merck公司）；乙酸、氨水（色譜純，美國Fisher Scientific公司）。

準確吸取地西泮及其代謝物標準物質(zhì)1.00 mL（100 mg/L）于10 mL 容量瓶中，用甲醇定容至刻度，配制質(zhì)量濃度為10 mg/L的混合標準溶液，于4 ℃避光儲存。取適量標準儲備溶液，用甲醇逐級稀釋成質(zhì)量濃度為100、50 μg/L的目標物混合標準溶液，現(xiàn)配現(xiàn)用。

1.3 樣品采集

水樣：采集300 mL養(yǎng)殖水于深色儲液瓶；沉積物：采集沉積物樣品，除去大顆粒雜質(zhì)后，風干研磨過篩備用。上述樣品避光密封，置于4 ℃冷藏保存。鯽魚：取可食肌肉部分制為勻漿狀；植物：樣品勻漿。上述樣品避光密封，置于-20 ℃冷凍保存。

1.4 樣品前處理

1.4.1 養(yǎng)殖水準確量取經(jīng)0.45 μm 玻璃纖維膜過濾的100 mL 水樣，用氨水調(diào)至pH 8.0，通過HLB柱（150 mg/6 mL）進行凈化。HLB 柱使用前用6 mL甲醇和6 mL超純水進行活化，控制流速為6 mL/min。用5 mL 5%甲醇水溶液淋洗后，接真空泵10 min 抽干剩余淋洗液。將8 mL 甲醇分為2 次（每次4 mL）洗脫，收集洗脫液在溫和氮氣流（35 ℃）下吹干并用甲醇定容至1 mL，經(jīng)30 s渦旋后，過0.22 μm 濾膜待分析。

1.4.2 植物/沉積物準確稱取5.0 g（精確至0.01 g）植物/沉積物樣品至50 mL 具塞離心管中，向管中加入5 mL 水和10 mL 乙腈，室溫下水浴超聲15 min。超聲結(jié)束后加入1.5 g NaCl 和4.0 g 無水硫酸鎂，旋渦振蕩1 min，以8 000 r/min 離心5 min，取6 mL 上清液。將上清液移入含150 mg C18、150 mg PSA、900 mg 無水硫酸鎂的10 mL 塑料離心管中，渦旋混勻30 s，以5 000 r/min 離心5 min。取出1 mL 上清液及1 mL水，渦旋混勻30 s后，過0.22 μm濾膜待分析。

1.4.3 鯽魚樣品準確稱取5.0 g（精確至0.01 g）鯽魚樣品至50 mL 具塞離心管中，向管中加入5 mL水和10 mL 乙腈，室溫下水浴超聲15 min。超聲結(jié)束后加入1.5 g NaCl 和4.0 g 無水硫酸鎂，旋渦振蕩1 min，以8 000 r/min 離心5 min，取6 mL 上清液，以6 mL/min 通過Prime HLB（150 mg/3 mL）柱，將樣品凈化液收集至10 mL 離心管中，在溫和氮氣下吹至近干。加入甲醇定容至1 mL，渦旋混勻30 s 后，過0.22 μm濾膜待分析。

1.5 儀器分析條件

1.5.1 液相色譜條件色譜柱：Luna C18柱（100 mm×2.1 mm，1.6 μm）；柱溫：40 ℃；流速：0.30 mL/min；進樣量：5 μL；流動相：A 為0.1%（體積分數(shù)）甲酸水溶液，B 為甲醇。梯度洗脫程序：0～1 min，5%～40% B；1～3 min，40%～80% B；3～7 min，80%～95% B；7～9 min，95%～5% B。

1.5.2 質(zhì)譜條件離子源模式為電噴霧電離源正模式（ESI+）；檢測模式為多反應監(jiān)測（MRM）；碰撞氣流速：0.45 mL/min，干燥氣流速：480 L/h；錐孔反吹氣流速：100 L/h；去溶劑氣溫度：350 ℃；離子源溫度：110 ℃；毛細管電壓：4.8 kV。地西泮及其代謝物的MRM質(zhì)譜參數(shù)見表1。

表1 地西泮及其代謝物的MRM質(zhì)譜參數(shù)Table 1 MRM mass spectrometry parameters for diazepam and its metabolites

2 結(jié)果與討論

2.1 儀器測定條件的優(yōu)化

2.1.1 質(zhì)譜參數(shù)確定在ESI+模式下對地西泮及其代謝物進行全掃描分析確定其母離子，碰撞裂解后通過二級質(zhì)譜掃描，選擇每種化合物的兩個響應豐度強、干擾少且靈敏度好的子離子用于定性和定量分析。最佳質(zhì)譜參數(shù)如“1.5.2”所示。

2.1.2 色譜條件確定流動相中有機相和水相的組成及配比會影響目標物的出峰情況?；|(zhì)中非極性組分在色譜洗脫過程可能未有效分離，適宜的流動相能減弱其干擾。本研究選用Luna C18柱（100 mm×2.1 mm，1.6 μm）作為色譜分析柱，有機相分別選擇甲醇和乙腈，水相分別選擇0.1%甲酸水溶液和5 mmol/L甲酸銨水溶液（含0.1%甲酸），考察了不同流動相條件下目標物的出峰情況。結(jié)果顯示，以甲醇與0.1%甲酸水溶液作為流動相，可使目標物獲得理想的峰形。圖1 為地西泮及其代謝物（1 μg/L）標準溶液的MRM色譜圖。

圖1 地西泮及其代謝物標準溶液的多反應監(jiān)測色譜圖（1 μg/L）Fig.1 MRM chromatograms of diazepam and its metabolites in the standard solution

2.2 植物、沉積物與鯽魚樣品提取方式的選擇

直接提取法：準確稱量5.0 g（精確至0.01 g）樣品至50 mL 具塞離心管中，加入5 mL 水和10 mL 乙腈混勻，于室溫下水浴超聲15 min。以8 000 r/min離心5 min，取6 mL上清液待凈化。

鹽析提取法：準確稱量5.0 g（精確至0.01 g）樣品至50 mL 具塞離心管中，加入5 mL 水和10 mL 乙腈混勻，于室溫下水浴超聲15 min。加入1.5 g NaCl 和4.0 g 無水硫酸鎂，渦旋振蕩1 min，以8 000 r/min離心5 min，取6 mL上清液待凈化。

由于植物、沉積物和鯽魚樣品的含水量較低，有機試劑難滲透入樣品中，導致有機試劑的提取效率低［10］。前處理過程中加入純水，有助于地西泮及其代謝物從樣品中溶解于有機試劑，增大提取效率。為使基質(zhì)中的目標化合物被充分提取，以空白加標樣品（10 μg/kg）為研究對象，比較了鹽析提取法（M1）與直接提取法（M2）對目標回收率的影響。結(jié)果顯示，采用鹽析提取法時目標物的回收率高于直接提取法?？赡苁怯捎邴}析提取可使有機相與水相分層，減少了基質(zhì)抑制作用，促使目標物溶解于提取溶劑乙腈中，從而提高了目標物的回收率。本研究最終采用鹽析提取法提取植物、沉積物和鯽魚樣品。

2.3 水樣凈化條件的優(yōu)化

2.3.1 固相萃取柱的選擇陽離子交換固相萃取柱對堿性化合物的選擇吸附效果較好，地西泮及其代謝物均屬堿性化合物，因此選用以陽離子吸附劑為填料的萃取柱［4］。采用100 mL空白加標（10 μg/L）水樣進行研究，考察了3 種固相萃取柱（HLB、WCX、MCX）對4 種目標物的凈化效果。如圖2 所示，3種SPE 柱對目標物的回收率分別為94.7%～106%、60.9%～79.8%和81.1%～92.4%。WCX 柱對目標物的萃取效率均低于80%，故不采用WCX柱。 HLB和MCX 柱對地西泮及其代謝物的萃取效率較高，萃取效率可達到80%以上。但MCX 柱的加標回收率低于HLB 柱且受pH 影響較大。HLB 柱填料利用反相吸附與目標物結(jié)合，可通過一定比例的甲醇水溶液淋洗去除非極性雜質(zhì)，再用甲醇洗脫目標物達到選擇性凈化的目的。最終選擇HLB 柱濃縮富集100 mL水樣。

圖2 不同固相萃取柱對地西泮及其代謝物的回收率（n=3）Fig.2 Recoveries of diazepam and its metabolites using different SPE cartridges（n=3）

2.3.2 樣品pH 值的優(yōu)化實驗過程中發(fā)現(xiàn)，樣品pH值對目標物的萃取效率有較大影響。本實驗通過加入甲酸或氨水控制pH 值分別為6.0、7.0、8.0，考察了樣品pH 值的影響。如圖3 所示，弱酸性（pH 6.0）條件下目標物的回收率均不超過85%；弱堿性（pH 8.0）條件下，HLB 柱對目標物的吸附保留最強，回收率最高。因此采用氨水控制樣品pH值為8.0，從而有效提高萃取效率。

圖3 pH值對地西泮及其代謝物回收率的影響（n=3）Fig.3 Effects of pH value on recoveries of diazepam and its metabolites（n=3）

2.3.3 淋洗液與洗脫液的選擇考察了分別用0、5%、10%的甲醇水溶液淋洗小柱時目標物的保留情況。結(jié)果顯示，選用10%的甲醇水溶液為淋洗液時奧沙西泮被洗脫，而選擇純水和5%甲醇水溶液淋洗時4 種目標物在小柱上保留均較穩(wěn)定?？疾炝思状?、5%甲酸甲醇、5%氨水甲醇分別作為洗脫液時的洗脫情況，結(jié)果顯示甲醇對4 種目標物的洗脫能力最強。因此采用5%甲醇水溶液淋洗，8 mL甲醇分兩次洗脫。

2.4 鯽魚樣品前處理條件的優(yōu)化

2.4.1 提取溶劑的選擇地西泮及其代謝物可溶于乙腈、乙酸乙酯等有機溶劑中。比較了乙腈、1%（體積分數(shù)）乙酸乙腈、1%（體積分數(shù)）氨水乙腈和乙酸乙酯4 種溶劑對鯽魚空白加標樣品（10 μg/kg）中目標物的提取效果（見圖4）。實驗發(fā)現(xiàn)，由于鯽魚樣品的脂溶性雜質(zhì)較多，經(jīng)乙酸乙酯提取后，提取液易發(fā)生乳化，導致目標物的提取回收率低于50%。與純乙腈相比，采用乙酸和氨水處理后的乙腈提取時，目標物的提取效果無明顯差異，且回收率均可達到80%以上。綜合考慮，選擇乙腈為鯽魚樣品的提取溶劑。

圖4 不同溶劑對地西泮及其代謝物提取回收率的影響（n =3）Fig.4 Effects of various extraction solvents on recoveries of diazepam and its metabolites（n=3）

2.4.2 凈化方式的選擇以空白加標鯽魚樣品（10 μg/kg）為研究對象，對比了MCX、Prime HLB柱與QuEChERS 法的凈化效果。結(jié)果顯示，經(jīng)上述3 種方法凈化后，鯽魚中4 種目標物的回收率分別為70.3%～80.9%、75.6%～83.1%、90.6%～103%。由于鯽魚樣品中富含脂肪、內(nèi)源性磷脂、蛋白質(zhì)等干擾物質(zhì)，而Prime HLB 柱填充物特有的親脂基團能夠有效吸附樣品提取液中的上述干擾物從而達到凈化目的，且Prime HLB 柱更方便快捷，樣液只需過柱，無需活化淋洗等操作。因此，本實驗選擇Prime HLB柱對鯽魚樣品進行凈化。

2.4.3 基質(zhì)效應評估基質(zhì)效應（ME）用于評價不同樣品凈化前后的基質(zhì)干擾，通過基質(zhì)匹配標準曲線與純甲醇標準曲線的斜率之比得到。當ME 在80%～120%之間時，表明基質(zhì)效應影響較??；當ME＞120%時，表明存在基質(zhì)增強效應；當ME＜80%時，則存在基質(zhì)抑制效應［4］。結(jié)果顯示，經(jīng)Prime HLB柱凈化后鯽魚樣品的ME為96.3%～116%，表明基質(zhì)干擾程度較低，可采用外標法定量。

2.5 植物、沉積物樣品前處理條件的優(yōu)化

2.5.1 提取溶劑的選擇以空白加標植物/沉積物樣品（10 μg/kg）為例，比較了乙腈、1%乙酸乙腈和1%氨水乙腈3 種溶劑對樣品中目標物的提取效果。結(jié)果顯示，與純乙腈相比，采用后2 種溶劑提取時，目標物的提取效果無明顯差異，且回收率均可達到80%以上。綜合分析，選擇乙腈為植物/沉積物樣品的提取溶劑。

2.5.2 凈化方式的選擇以空白加標植物（芹菜、水浮蓮）、沉積物樣品（10 μg/kg）為研究對象，比較了經(jīng)QuEChERS、Prime HLB 柱和MCX 柱凈化后目標物的回收率及基質(zhì)效應。由圖5 可知，上述3種方法凈化后，4種目標物的回收率分別為86.8%～102%、80.1%～90.6%和76.3%～96.5%，均能滿足檢測要求。但MCX 柱需調(diào)節(jié)pH 值，Prime HLB 柱的回收率略低于QuEChERS 法且耗時較長，綜合考慮，選擇植物、沉積物樣品的凈化方法為QuEChERS法。

圖5 不同凈化方式對地西泮及其代謝物提取回收率的影響（n=3）Fig.5 Effects of various purification methods on recoveries of diazepam and its metabolites（n=3）

2.5.3 基質(zhì)效應評估根據(jù)“2.4.3”方法評價基質(zhì)效應，以空白芹菜、水浮蓮以及沉積物樣品為研究對象，提取后上機分析。結(jié)果表明，未經(jīng)凈化的樣品表現(xiàn)出明顯的基質(zhì)增強效應，ME 為123%～150%。經(jīng)QuEChERS 法凈化后，植物和沉積物的ME 為103%～111%，經(jīng)QuEChERS 法處理后樣品的基質(zhì)效應在合理范圍內(nèi)，可采用外標法進行定量分析。

2.6 方法學考察

2.6.1 線性范圍與靈敏度配制一系列質(zhì)量濃度由低至高的混合標準工作溶液上機檢測，以目標物的峰面積為縱坐標（Y），目標物的質(zhì)量濃度為橫坐標（X）繪制標準曲線。結(jié)果表明，4 種目標物在0.1～10 μg/L 范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)（r2）大于0.999。通過3 倍信噪比（S/N）確定方法檢出限（LOD），10 倍信噪比（S/N）確定方法定量下限（LOQ）。由表2 可知，4 種目標物在水體中的檢出限為1.0～1.2 ng/L，定量下限為5.0～6.0 ng/L；在植物、沉積物、鯽魚中的檢出限為0.03～0.10 μg/kg，定量下限為0.10～0.25 μg/kg。

表2 地西泮及其代謝物的靈敏度Table 2 Sensitivities of diazepam and its metabolites

2.6.2 準確度與精密度采用空白樣品進行加標回收實驗，其中水樣的加標水平分別為0.1、0.5、1 μg/L，植物、沉積物、鯽魚樣品的加標水平分別為1、5、10 μg/kg，做6次平行實驗。結(jié)果顯示，地西泮及其代謝物的回收率為83.4%～106%，相對標準偏差（RSD）為1.2%～9.4%（表3、表4）。該方法具有良好的準確度和重復性，可以滿足地西泮及其代謝物殘留的定量檢測需求。

表3 地西泮及其代謝物在水中的回收率與相對標準偏差（n=6）Table 3 Recoveries and relative standard deviations of diazepam and its metabolites in water（n=6）

表4 地西泮及其代謝物在沉積物、植物和鯽魚中的回收率與相對標準偏差（n=6）Table 4 Recoveries and relative standard deviations of diazepam and its metabolites in sediment，plants and crucian carp（n=6）

2.7 實際樣品測定

采用本方法對被污染的養(yǎng)殖基地的水產(chǎn)養(yǎng)殖水、沉積物、植物和鯽魚樣品共20份進行測定，結(jié)果在1份養(yǎng)殖水樣品中檢出地西泮、去甲西泮，質(zhì)量濃度分別為42、0.81 ng/L；1份鯽魚樣品中檢出地西泮、去甲西泮和奧沙西泮，檢出量分別為0.68、0.29、0.95 μg/kg；1份沉積物樣品中檢出地西泮、去甲西泮，檢出量分別為3.2、0.59 μg/kg，1份植物樣品中檢出地西泮，檢出量為0.19 μg/kg。

3 結(jié) 論

本研究建立了液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測淡水養(yǎng)殖環(huán)境中地西泮及其代謝物的分析方法。該方法前處理方便快捷，靈敏度高，準確度和重現(xiàn)性好，可用于養(yǎng)殖水、植物、沉積物和鯽魚中地西泮及其代謝物的污染篩查和確證。