黃嘉樂，陳 揚，黨 華，姚曉慶，黃嘉瑜

（廣州檢驗檢測認(rèn)證集團有限公司，廣東 廣州 511447）

運動營養(yǎng)食品是一類針對運動人體代謝和生理功能需求設(shè)計，具有高能量密度和高生物活性的功能食品。近年來，運動營養(yǎng)食品風(fēng)靡全球，行業(yè)發(fā)展迅速，并逐步進(jìn)入主流消費市場。運動營養(yǎng)食品消費復(fù)合年增長率約為8%，已成為消費者健康領(lǐng)域增長最快的行業(yè)，預(yù)計到2025年運動營養(yǎng)食品行業(yè)產(chǎn)值將達(dá)到240 億美元。運動營養(yǎng)食品消費的快速增長，反映了人們健康意識的提高和休閑運動人數(shù)的上漲［1］。為有效緩解人體在運動中產(chǎn)生的能源消耗、自由基損傷、乳酸等代謝產(chǎn)物堆積以及中樞神經(jīng)疲勞問題，運動型食品中常常添加一定量的功能性成分。這些功能性成分在調(diào)節(jié)人體相關(guān)機能方面具有非常顯著的作用，可以消除機體的疲勞狀態(tài)，促進(jìn)機體各項功能的恢復(fù)，并提高運動能力［2］。合理補充運動營養(yǎng)物質(zhì)可促進(jìn)運動人體的機能健康。隨著社會的發(fā)展，合理膳食、均衡營養(yǎng)、運動健身等健康意識已成為主流消費者關(guān)注的重點，此類型的休閑用戶將運動營養(yǎng)食品推向了大眾市場，從而提高了運動營養(yǎng)類別的總銷售額［3-4］。

常見的運動營養(yǎng)食品可分為7 類：運動飲料、運動凝膠、運動能量棒、運動糖果、蛋白粉、蛋白質(zhì)棒、液態(tài)食品［4-5］。運動營養(yǎng)食品的功能性成分有肌酸、谷氨酰胺、β-羥基-β-甲基丁酸鈣、1，6-二磷酸果糖、瓜氨酸、鳥氨酸、咖啡因等［6］。由于運動營養(yǎng)食品類型多樣、基質(zhì)復(fù)雜、干擾物質(zhì)多，其功能成分的檢測通常需要凈化處理。固相微萃?。⊿PME）避免了傳統(tǒng)固相萃取操作繁瑣以及溶劑和吸附劑消耗較高的缺點，具有操作簡單、快速、成本低、有機溶劑消耗低等優(yōu)點，更加符合綠色化學(xué)標(biāo)準(zhǔn)［7］。磁性分散固相微萃取則利用渦旋混合器將磁性吸附劑直接分散在樣品溶液中，吸附雜質(zhì)后，通過外部磁體將磁性吸附劑與樣品溶液快速分離，再使用合適的濾膜過濾凈化液以進(jìn)行進(jìn)一步分析。四氧化三鐵/磁性氧化石墨烯（Fe3O4/GO）吸附劑既有氧化石墨烯親水性高、溶解性好的優(yōu)點，又有Fe3O4的高分散性和超順磁性，可用于去除運動食品樣品提取液中的色素及其他有機雜質(zhì)［8］。高分辨質(zhì)譜（HRMS）技術(shù)，如靜電場軌道阱質(zhì)譜和飛行時間質(zhì)譜，因其高分辨率高（＞50 000 全寬，F(xiàn)WHM），質(zhì)量精度好，可用于排除其他基質(zhì)干擾，精確測定運動營養(yǎng)食品中的功效成分含量［9］。

目前，磁性氧化石墨烯較多用于污染物、農(nóng)藥殘留方面的檢測［10-12］，而在運動營養(yǎng)食品方面的檢測較少，未見采用磁性石墨烯進(jìn)行運動營養(yǎng)食品中氨基酸檢測的研究。由于運動營養(yǎng)食品的基質(zhì)較復(fù)雜，而相關(guān)檢測方法標(biāo)準(zhǔn)的缺失導(dǎo)致其功效成分缺乏科學(xué)的評價手段和檢驗檢測方法，造成配方研發(fā)和監(jiān)管困難。

本研究將Fe3O4及氧化石墨烯通過原位化學(xué)沉積，合成了磁性氧化石墨烯（Fe3O4/GO）納米復(fù)合材料。以該材料為凈化劑，基于磁性分散固相萃取凈化，建立了超高效液相色譜-四極桿-靜電場軌道阱高分辨質(zhì)譜（UHPLC-Q-Orbitrap HRMS）測定運動營養(yǎng)食品中27種氨基酸的方法，并將建立的方法應(yīng)用于市售7 類運動營養(yǎng)食品中氨基酸含量的分析。本方法可為市場監(jiān)管部門、相關(guān)生產(chǎn)企業(yè)提供技術(shù)支持。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

Thermo Q Exactive 超高效液相色譜-四極桿-靜電場軌道阱高分辨質(zhì)譜聯(lián)用儀（美國賽默飛世爾科技公司）；氧化石墨烯（德國Sigma 公司）；低速離心機KDC-1044（中科中佳科學(xué)儀器有限公司）；Milli-Q超純水系統(tǒng)（美國Merck 密理博公司）；旋渦混合器MS3 basic（德國艾卡公司）；KQ-250DV 數(shù)控超聲波清洗儀（昆山市舒美牌超聲儀器有限公司）；Brand Transferpette 移液槍（100 ～ 1 000 μL、0.5 ～ 5 mL，德國BRAND）；1 mL 一次性注射器（湖南平安醫(yī)械科技有限公司），有機相針筒式濾膜過濾器（天津市津騰實驗設(shè)備有限公司）。

硫酸亞鐵七水合物（FeSO4·7H2O，純度99%）、氯化鐵六水合物（FeCl3·6H2O，純度99%）購于西格瑪·奧爾德里奇公司；氨水（NH4OH，純度25%）、乙腈（色譜純）、甲醇（色譜純）購于德國Merck 公司；15 種氨基酸混標(biāo)（100 mg/L）、L-色氨酸（純度99.2%）、瓜氨酸（純度92.1%）、鳥氨酸（純度93.1%）、肌酸（純度98.2%）、谷氨酰胺（純度97.1%）、茶氨酸（純度97.5%）、γ-氨基丁酸（純度98.3%）、羥脯氨酸（純度96.4%）、肌氨酸（純度99.3%）、L-蒜氨酸（純度97.2%）、L-半胱氨酸（純度98.3%）、?；撬幔兌?9.9%）均購于德國Sigma公司。

稱取適量的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，使用前用超純水溶解，配制成27種氨基酸的標(biāo)準(zhǔn)儲備液。將該儲備液用超純水或混合空白基質(zhì)液稀釋至所需濃度，制備成工作液備用。

1.2 樣品處理

運動飲料、運動凝膠、運動能量棒、運動糖果、蛋白粉、蛋白質(zhì)棒、液態(tài)食品樣品均購于本地不同市場（中國廣州）。

1.2.1 樣品提取取約50 g 樣品放入粉碎機均質(zhì)后，稱取5.00 g（精確至0.01 g）試樣，置于50.0 mL聚丙烯尖底離心管（帶螺紋蓋）中，加入15.0 mL 超純水，渦旋振蕩混勻3 min，再加入15.0 mL 乙腈，渦旋振蕩3 min，超聲提取30 min，然后以10 000 r/min 低溫冷凍離心3 min。去除上層脂肪后，移取所有提取液至50.0 mL 容量瓶中，放至室溫后用超純水定容，將上層液體用超純水稀釋至標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍內(nèi)供凈化。

1.2.2 樣品凈化準(zhǔn)確稱取10.0 mg 磁性氧化石墨烯粉末，在5.00 mL 水溶液中超聲3 min 形成均勻懸浮液。移取0.500 mL磁性氧化石墨烯溶液至2.00 mL帶螺紋蓋樣品瓶中，再加入0.500 mL 樣品提取液，室溫下在渦旋混合器上輕輕振搖10 s，超聲3 min以加速凈化。利用外磁體從水溶液中分離出磁性吸附材料。最后，將樣品溶液通過0.22 μm聚四氟乙烯（PFTE）膜過濾，供測定。

1.3 儀器條件

1.3.1 液相色譜條件色譜柱為Thermo Accucore HILIC（4.6 mm×150 mm，2.6 μm），柱溫為30 ℃，流動相為0.1%甲酸水溶液（含5.0 mmol/L 甲酸銨，A）和0.1%甲酸乙腈（含5.0 mmol/L 甲酸銨，B）。梯度洗脫程序：0～0.5 min，85% B；0.5～15 min，85%～40% B；15～15.5 min，40%～85% B； 15.5～20 min，85% B，總運行時間為20 min。流速為0.5 mL/min，進(jìn)樣量為1 μL。

1.3.2 Q-Orbitrap HRMS 條件Q ExactiveTM質(zhì)譜系統(tǒng)配有HESI 源，Q-Orbitrap 每周使用正離子溶液進(jìn)行調(diào)整和校準(zhǔn)。質(zhì)譜采集采用正離子掃描模式；噴霧電壓為 3.0 kV（正離子模式），毛細(xì)管溫度和噴霧溫度均為 350 ℃（正模式）；掃描模式為一級母離子全掃描和二級子離子掃描（Full MS/dd-MS2）模式；鞘氣：40 L/min；輔助氣：5 L/min；霧化氣為氮氣；s 型透鏡射頻（S-lens RF）電壓為50 V。一級母離子全掃描分辨率：7×104半高峰寬（FWHM）；最大注入時間：50 ms；采集范圍：m/z50～500。二級子離子全掃描分辨率：1.75×104FWHM；間隔寬度為m/z4.0，觸發(fā)閾值：5×105；最大注入時間：50 ms，臨界強度設(shè)為1.6×104，歸一化碰撞能（NCE）設(shè)為：60、40、20 eV，離子峰類型均為［M+H］+。各化合物的質(zhì)譜信息見表1。

表1 27種氨基酸的質(zhì)譜信息Table 1 Mass parameters of 27 amino acids

1.4 磁性氧化石墨烯的制備

采用化學(xué)共沉淀法［13］制備磁性氧化石墨烯。200 mg氧化石墨烯溶于 50 mL水中，超聲分散1 h，使羧酸基團轉(zhuǎn)化成羧酸陰離子。稱取3.64 g（0.04 mol）FeCl3·6H2O 和1.80 g（0.02 mol） FeSO4·7H2O，溶于25 mL 水中。在室溫氮氣流（40 mL/min）和快速劇烈攪拌下，將鐵離子溶液加入氧化石墨烯溶液中，并超聲分散30 min。加入5 mL 25%的氨水溶液，在80 ℃下水浴振蕩2 h 后得到黑色沉淀。黑色沉淀物用去離子水和乙醇分別洗滌3次，真空干燥12 h，得到磁性氧化石墨烯（Fe3O4/GO）納米復(fù)合材料。

1.5 數(shù)據(jù)處理

采用全掃描方法對樣品進(jìn)行分析，得到27種化合物的質(zhì)譜圖、保留時間和精確質(zhì)量數(shù)等信息。導(dǎo)入相應(yīng)的二級碎片離子數(shù)據(jù)信息，并使用Trace Finder軟件建立目標(biāo)化合物的數(shù)據(jù)庫。通過色譜峰面積外標(biāo)法進(jìn)行定量分析，使用 Microsoft Excel 2016軟件繪制圖表。

2 結(jié)果與討論

2.1 檢測條件的優(yōu)化

甲醇和乙腈是實驗室常用的兩種優(yōu)良極性有機溶劑，相較于甲醇，乙腈的粘度較低，洗脫效率較高。因此，本文選擇乙腈作為有機流動相。為提高目標(biāo)物的峰形和電離效率，選擇在流動相中加入甲酸銨和甲酸［14］。實驗發(fā)現(xiàn)，L-丙氨酸與肌氨酸，L-亮氨酸與L-異亮氨酸等異構(gòu)體的分離是色譜優(yōu)化的關(guān)鍵。因此，采用0.1%甲酸水溶液（含5.0 mmol/L 甲酸銨）和0.1%甲酸乙腈（含5.0 mmol/L 甲酸銨）為流動相進(jìn)行梯度洗脫程序優(yōu)化，在“1.3.1”的最佳色譜條件下，實現(xiàn)了27種氨基酸的良好分離。

27種氨基酸結(jié)構(gòu)中同時存在的酸性基團和堿性基團可相互作用形成內(nèi)鹽，所以氨基酸通常以偶極離子形式存在，檢測發(fā)現(xiàn)目標(biāo)化合物在電噴霧正離子模式下的靈敏度最高。在Full MS/dd-MS2模式下進(jìn)行分析，以［M+H］+峰作為MS2掃描的前體離子，優(yōu)化碰撞能量，獲得二級碎片離子信息，各目標(biāo)化合物響應(yīng)較高的兩個子離子精確質(zhì)量數(shù)見表1 。由于軌道阱HRMS 的全質(zhì)量掃描分辨率可達(dá)到70 000，因此本研究直接選擇母離子作為定量離子，兩個碎片離子作為定性離子進(jìn)行確認(rèn)。其中L-丙氨酸與肌氨酸，L-亮氨酸與L-異亮氨酸為同分異構(gòu)體，具有相同的碎片離子，通過優(yōu)化流動相的梯度，根據(jù)保留時間可實現(xiàn)對上述同分異構(gòu)體的定性分析。

以本文采集27種氨基酸的一級質(zhì)譜母離子質(zhì)量數(shù)、目標(biāo)保留時間、二級質(zhì)譜碎片離子等信息建立目標(biāo)物數(shù)據(jù)庫，典型的提取離子流色譜圖如圖1所示。在樣品檢測過程中，可以通過對可疑樣品的多維度評判進(jìn)行定性確證。此外，在非靶向篩選氨基酸類物質(zhì)時，本研究使用高精度質(zhì)量分析器和特征產(chǎn)物離子有效減少了假陽性結(jié)果，從而有利于推測化合物的分子式或結(jié)構(gòu)，提高篩查效率。

圖1 27 種氨基酸混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的典型提取離子流色譜圖Fig.1 Typical extracted ion chromatograms of the mixed standard solution of 27 amino acids

2.2 提取溶劑的優(yōu)化

基于運動營養(yǎng)食品成分的特點，本研究首先將樣品溶解分散于5.0 mL水中。27種氨基酸的化學(xué)結(jié)構(gòu)中含有氨基和羧酸，可溶于甲醇、乙腈和水等極性溶劑。此外，27種氨基酸的極性較強［15］，而乙酸乙酯、甲醇和乙腈是最常用的極性范圍較寬的提取溶劑。以運動能量棒空白樣品為基質(zhì)，考察了分別加入10.0 mL 乙酸乙酯、甲醇和乙腈作為提取溶劑時的提取效果。結(jié)果表明，甲醇作為提取溶劑時，容易從樣品中共提取出許多雜質(zhì)，提取溶液非常粘稠，不利于后續(xù)凈化。乙酸乙酯作為提取溶劑時，樣品中的油脂會被同時萃取出，導(dǎo)致氨基酸的回收率很低（5%～30%）。乙腈具有極性范圍寬、小分子和組織穿透性較強的特點，對脂質(zhì)和蛋白質(zhì)化合物的沉淀效果較好［16］，以乙腈為提取溶劑時，27種氨基酸的提取效率較高。

由于27 種氨基酸具有不同取代基，化學(xué)性質(zhì)差異較大，根據(jù)相似相溶原理，部分目標(biāo)物易溶于水，部分目標(biāo)物易溶于有機溶劑。以運動能量棒為基質(zhì)樣品，進(jìn)一步考察了分別以不同體積分?jǐn)?shù)（90%、75%、50%和25%）乙腈水為提取溶劑的提取效果。結(jié)果表明，以90%、75%乙腈水為提取溶劑時的萃取液呈黃褐色，略帶粘稠，基質(zhì)抑制嚴(yán)重，部分目標(biāo)物的回收率低（小于50%）。以50%乙腈水作為提取溶劑時的沉淀效果較好，目標(biāo)物的回收率較好，且提取溶液較為澄清。這可能是由于油脂在乙腈中的溶解度較低，乙腈的極性較高，從而增強了氨基酸在混合溶液中的分散性。乙腈在水相中的擴散增加了有機相和水相之間的液-液界面，增強了萃取動力學(xué)，改善了分析物的傳質(zhì)。以25%乙腈水作為提取溶劑時的沉淀效果較差，萃取液渾濁。本研究最終采用50%乙腈水作為提取溶劑。

2.3 磁性氧化石墨烯的表征及凈化條件的優(yōu)化

分別對氧化石墨烯和磁性氧化石墨烯進(jìn)行掃描電子顯微鏡（SEM）表征，圖2 顯示，經(jīng)化學(xué)共沉淀處理后，氧化石墨烯的片層表面上有大小約為50 nm的球形顆粒。通過能譜儀（EDS）確認(rèn)了Fe3O4/GO納米復(fù)合材料中含有鐵元素（見圖3）。紅外光譜（FT-IR）顯示，磁性氧化石墨烯在557 cm-1處出現(xiàn)Fe-O的特征拉伸振動峰（見圖4）。上述結(jié)果表明，F(xiàn)e3O4納米離子被成功修飾在GO的表面上。

圖2 Fe3O4/GO納米復(fù)合材料（左）和氧化石墨烯（右）的SEM譜圖Fig.2 SEM spectra for the Fe3O4/GO（left） and GO nanocomposite（right）

圖3 Fe3O4/GO納米復(fù)合材料的EDS譜圖Fig.3 EDS spectrum for the Fe3O4/GO nanocomposites

圖4 氧化石墨烯（a）和Fe3O4/GO納米復(fù)合材料（b）的紅外光譜Fig.4 FT-IR spectra for the GO（a） and Fe3O4/GO nanocomposite（b）

本研究以磁性氧化石墨烯為凈化劑，采用磁性分散固相微萃取法對運動營養(yǎng)食品中的27種氨基酸進(jìn)行凈化。其中氧化石墨烯具有高比表面積、良好的水分散性和高反應(yīng)活性［17］，能有效去除提取液中的糖、酸和極性色素等雜質(zhì)；而沉積在氧化石墨烯表面的Fe3O4納米顆?？赏ㄟ^靜電作用、氫鍵或共價鍵吸附帶負(fù)電荷的物質(zhì)和羧基化合物，去除樣品中的有機酸、脂肪酸和色素［18］。

以運動能量棒空白樣品為基質(zhì)，考察了磁性氧化石墨烯用量與超聲時間對凈化效果的影響［19］。結(jié)果表明，當(dāng)磁性氧化石墨烯用量為5.0～20.0 mg 時，隨著用量的增加，目標(biāo)物的回收率先增加后逐漸降低，用量為10.0 mg時的回收率較高，因此選擇磁性氧化石墨烯用量為10.0 mg。此外，超聲時間為1～5 min 時，隨著超聲時間的增加，目標(biāo)物的回收率先增加后逐漸降低，超聲3 min 時目標(biāo)物的回收率較高，因此選擇超聲時間為3 min。在“1.2.2”凈化條件下，27種氨基酸的回收率均能達(dá)到70%以上。

2.4 線性范圍與定量下限

本研究采用高分辨質(zhì)譜的全掃描方法獲得目標(biāo)化合物的保留時間和精確質(zhì)量數(shù)等信息，并以母離子作為定量離子，采用色譜峰面積外標(biāo)法進(jìn)行定量分析。在空白基質(zhì)液中添加一系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，以各組分的質(zhì)量濃度（X，μg/L）為橫坐標(biāo)，對應(yīng)色譜峰面積（Y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性擬合。27種氨基酸在相應(yīng)的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)（r2）均大于0.99。以10 倍信噪比時待測組分的最小濃度為定量下限（LOQ），得到27種氨基酸的LOQ 為0.10～0.25 mg/kg（見表2）。結(jié)果表明，本方法準(zhǔn)確、靈敏，符合檢測要求。

表2 27 種氨基酸的線性關(guān)系與定量下限Table 2 Linear relations and limits of quantitation of the 27 amino acids

2.5 回收率與相對標(biāo)準(zhǔn)偏差

采用本方法對空白基質(zhì)樣品進(jìn)行加標(biāo)回收實驗（n=6），設(shè)置0.25、0.50、0.75 mg/kg 3 個加標(biāo)水平。采用中間添加水平（0.50 mg/kg）的樣品連續(xù)測定5 d，考察方法的日間相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）。如表3所示，27 種氨基酸的平均回收率為70.0%～93.0%，日內(nèi)RSD（n=6）為1.6%～10%，日間RSD 為1.4%～5.2%。結(jié)果表明，本方法具有較好的準(zhǔn)確度和精密度。

2.6 基質(zhì)效應(yīng)

考察了運動飲料、運動凝膠、運動能量棒、運動糖果、蛋白粉、蛋白質(zhì)棒以及液態(tài)食品的基質(zhì)效應(yīng)。采用本方法進(jìn)行樣品前處理，得到混合空白基質(zhì)溶液，配制上機質(zhì)量濃度為50 μg/L的基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液，將基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液的峰面積與相應(yīng)濃度甲醇配制的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液所得峰面積相比，得到比值K。當(dāng)K＜0.8 時表示存在基質(zhì)抑制，當(dāng)K＞1.2 時表示存在基質(zhì)增強。結(jié)果表明，上述基質(zhì)中27 種氨基酸的K值為0.78～1.24；大部分氨基酸的K值在0.8～1.2之間；運動糖果中L-亮氨酸（K=0.78）以及蛋白粉中L-脯氨酸（K=0.79）呈基質(zhì)抑制；運動飲料和液態(tài)食品中的L-胱氨酸呈基質(zhì)增強，K分別為1.24和1.22。本實驗采用混合基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線定量。

2.7 實際樣品測定

隨機購買不同超市中運動飲料、運動凝膠、運動能量棒、運動糖果、蛋白粉、蛋白質(zhì)棒、液態(tài)食品7款運動營養(yǎng)食品，采用本方法進(jìn)行分析（見表4）。結(jié)果顯示，除了運動能量棒外，其他6種樣品均檢出氨基酸。其中液態(tài)食品中氨基酸的含量最高，主要是為了快速修復(fù)機體組織［20］，滿足運動人群營養(yǎng)需求。

表4 7款運動營養(yǎng)食品中27種氨基酸的檢測結(jié)果（g/100g）Table 4 Determination results of 27 amino acids in 7 sports nutrition foods（g/100g）

3 結(jié) 論

本研究以合成的磁性氧化石墨烯納米復(fù)合材料為磁性分散固相萃取劑，建立了磁性分散固相微萃取凈化結(jié)合超高效液相色譜-四極桿-靜電場軌道阱高分辨質(zhì)譜測定運動營養(yǎng)食品中27 種氨基酸的方法。本方法具有操作快速簡單、成本低、有機溶劑用量少、靈敏度好、準(zhǔn)確度高等優(yōu)點，可為食品安全實施監(jiān)督管理提供科學(xué)依據(jù)，相關(guān)實驗數(shù)據(jù)對政府部門監(jiān)管運動營養(yǎng)食品中功效成分濫用及其食品質(zhì)量安全具有重要意義。