唐 芃，劉 鐵，劉德龍*

（1.河北師范大學(xué) 化學(xué)與材料科學(xué)學(xué)院，河北 石家莊 050024；2.西北師范大學(xué) 化學(xué)化工學(xué)院，甘肅 蘭州 730070）

由于蛋白質(zhì)基質(zhì)的干擾，對(duì)復(fù)雜生物樣品中的中藥進(jìn)行檢測較為困難［1-2］，導(dǎo)致對(duì)此類樣品中中藥的微量活性成分進(jìn)行定量存在挑戰(zhàn)。為了從復(fù)雜樣品中得到滿足檢測要求的目標(biāo)分析物，研究人員開發(fā)了多種預(yù)處理方法，其中固液萃?。?］、液液萃取［4-5］和固相萃?。⊿PE）是目前最常用的樣品預(yù)處理方法。分散固相萃?。╠SPE）是一種操作更簡單的固相萃取方法，該方法通過將吸附劑直接分散在含有分析物的液體樣品中，待吸附劑從樣品溶液中分離出來后，再選擇合適的溶劑將目標(biāo)分析物從吸附劑中洗脫出來［6］。與其他預(yù)處理方法相比，分散固相萃取法使用的溶劑更少，萃取效率高，吸附劑種類選擇廣泛［7］。

共價(jià)有機(jī)框架（COFs）是一類新型晶態(tài)有機(jī)多孔聚合物，由有機(jī)構(gòu)筑單元通過輕元素（C、O、N、H 等）的強(qiáng)共價(jià)鍵構(gòu)建并通過縮聚反應(yīng)合成［8］。其多孔結(jié)構(gòu)可以提供高孔隙率和較大的表面積，且其豐富的活性位點(diǎn)［9］使之可與目標(biāo)分析物充分作用，提高識(shí)別靈敏度，同時(shí)COFs熱穩(wěn)定性良好［10］，是一種理想的dSPE 吸附劑［11］。近年來，利用COFs 作為吸附劑分離和富集物質(zhì)的研究顯著增加［12-14］，因此，COFs有望成為中藥活性成分的有效吸附劑。

α-細(xì)辛醚是一種存在于多種植物中的天然苯丙烯，具有廣泛的藥理活性，已被用于食品調(diào)味和包括癲癇［16］、高血脂［17］和呼吸系統(tǒng)疾病［18］等在內(nèi)的疾病治療［15］。一些涉及藥代動(dòng)力學(xué)、藥效學(xué)和藥毒理學(xué)的研究需要對(duì)血漿、尿液和其他生物體液中的微量藥物進(jìn)行分析［19-20］，由于α-細(xì)辛醚在實(shí)際樣品中的含量較低，且易受雜質(zhì)干擾，因此在樣品預(yù)處理后選擇合適的檢測方法進(jìn)行定量分析十分必要。目前利用COFs 富集后再進(jìn)行檢測的方法主要有色譜法［21-23］、質(zhì)譜法［24］和色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法［25-28］。色譜法的樣品前處理繁瑣耗時(shí)，而光譜技術(shù)因靈敏度高、穩(wěn)定性好和響應(yīng)速度快受到廣泛關(guān)注，且光譜法能減少有害化學(xué)溶劑的使用，更為環(huán)保［29-30］。熒光檢測法作為一種更快、更高效的方法，可用于中藥有效成分的定量研究，因此本文選用熒光法對(duì)α-細(xì)辛醚進(jìn)行檢測和分析。

首先基于1，3，5-三甲酰基間苯三酚和3，3′-二甲基聯(lián)苯胺的席夫堿反應(yīng)合成了共價(jià)有機(jī)框架TpBD-Me2（COF-TpBD-Me2），以其作為吸附劑選擇性吸附人體血漿中的α-細(xì)辛醚，并優(yōu)化了吸附條件，通過吸附等溫線和吸附動(dòng)力學(xué)研究闡明了吸附機(jī)理。最后，利用熒光光譜對(duì)人體血漿中的α-細(xì)辛醚進(jìn)行定量分析。該方法有望應(yīng)用于生物樣品中小分子藥物的富集和定量分析。實(shí)驗(yàn)過程如圖1所示。

圖1 COF-TpBD-Me2從人體血漿中提取α-細(xì)辛醚并熒光檢測的步驟Fig.1 Steps of COF-TpBD-Me2 for extracting and fluorescence detection of α-asarone from human plasma

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與設(shè)備

S-4800 型掃描電子顯微鏡（SEM）、H-7650 型透射電子顯微鏡（TEM）（日本Hitachi 有限公司）；Thermo SCIENTIFIC 型傅里葉紅外光譜分析儀（FT-IR，美國Thermo 有限公司）；SmartLab X 射線衍射儀（XRD，日本Rigaku 有限公司）；Autosorb IQ-MP 全自動(dòng)比表面和孔徑分布分析儀（美國安東帕公司）；STA449F3 同步熱分析儀（德國Netzsch 有限公司）；AUY220 電子分析天平（日本島津有限公司）；TGL-18-B型高速離心機(jī)（湖南星科科學(xué)儀器有限公司）；SHZ-82型搖床（中國江蘇金壇正榮實(shí)驗(yàn)儀器廠）。

FS5 分子熒光光譜儀（英國愛丁堡儀器公司），激發(fā)波長為265 nm，發(fā)射波長為365 nm，發(fā)射光譜在305～400 nm范圍內(nèi)以1 nm間隔測量，激發(fā)狹縫和發(fā)射狹縫均設(shè)置為1 nm。

1.2 材料與試劑

α-細(xì)辛醚標(biāo)準(zhǔn)品（純度≥98%）購自阿拉丁化學(xué)有限公司；1，3，5-三甲?；g苯三酚（Tp）、3，3′-二甲基聯(lián)苯胺（BD-Me2）、對(duì)甲基苯磺酸（PTSA）均購自泰坦科技有限公司；N，N-二甲基乙酰胺（DMAC）購自致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司；丙酮和乙腈均購自大茂化學(xué)試劑廠。所有試劑均為分析純，所有水溶液均由蒸餾水配制。無藥人體血漿由河北省醫(yī)院提供。

1.3 COF-TpBD-Me2的合成

COF-TpBD-Me2根據(jù)已有方法合成［31］。首先，將PTSA（2.5 mmol，475.5 mg）和BD-Me2（0.45 mmol，95.5 mg）加入到Tp（0.3 mmol，63 mg）和100 μL 水中，將混合物研磨5 min。隨后轉(zhuǎn)移至玻璃瓶中，于170 ℃烘箱中加熱60 s，依次用水、DMAC 和丙酮清洗數(shù)次以除去PTSA 和殘留的分子雜質(zhì)，真空干燥得到深紅色粉末。合成路線如圖2所示。

圖2 COF-TpBD-Me2合成路線Fig.2 Synthesis route of COF-TpBD-Me2

1.4 樣品溶液的配制

準(zhǔn)確稱取α-細(xì)辛醚標(biāo)準(zhǔn)品溶解于10 mL甲醇中，配制成2 mg/mL的儲(chǔ)備液并于4 ℃下保存。將儲(chǔ)備液加入磷酸鹽緩沖溶液（pH 7.4）中，配制α-細(xì)辛醚質(zhì)量濃度為1、5、15、25 μg/mL的樣品溶液。

1.5 分散固相萃取實(shí)驗(yàn)

稱取2 mg COF-TpBD-Me2置于5 mL 離心管中，加入2 mL 樣品溶液超聲5 min 混合均勻，在搖床上以180 r/min吸附30 min后以10 000 r/min離心5 min，棄去上清液，于室溫干燥，并用2 mL乙腈洗脫60 min，洗脫液經(jīng)離心分離后用于熒光檢測。

2 結(jié)果與討論

2.1 COF-TpBD-Me2的表征

合成的COF-TpBD-Me2表面粗糙，其SEM 圖像如圖3A 所示。TEM 圖像（圖3B）顯示，COF-TpBDMe2呈絲狀。COF-TpBD-Me2紅外光譜曲線中Tp 的C=O 鍵（1 644 cm-1）和BD-Me2的N—H 伸縮帶（3 300～3 500 cm-1）消失（圖4A），表明原始材料已完全消耗。1 240 cm-1（C—N）和1 580 cm-1（C=C）處強(qiáng)烈的吸收峰表明β-酮烯胺連接框架結(jié)構(gòu)形成。圖4B為合成的COF-TpBD-Me2的XRD結(jié)果，在～3.64°處的強(qiáng)峰屬于（100）面，～6.42°，～9.16°，～26.12°處的衍射信號(hào)分別對(duì)應(yīng)（200）、（210）和（001）晶面。合成的共價(jià)有機(jī)框架與已有報(bào)道結(jié)果吻合良好［10］。

圖3 COF-TpBD-Me2的掃描電鏡圖（A）和透射電鏡圖（B）Fig.3 SEM image（A） and TEM image（B） of COF-TpBD-Me2

圖4 Tp，BD-Me2和COF-TpBD-Me2的紅外光譜圖（A）以及 COF-TpBD-Me2的X射線衍射圖（B）、N2吸附-解吸等溫線（C）、熱重分析曲線（D）Fig.4 FT-IR spectra of Tp，BD-Me2 and COF-TpBD-Me2（A），XRD pattern（B），N2 adsorption-desorption isotherm（C），and TGA curve of COF-TpBD-Me2（D）

N2吸附-解吸等溫線（圖4C）顯示，活化后的COF-TpBD-Me2呈可逆的Ⅰ型吸附等溫線，比表面積（BET）為172.19 m2/g。COF-TpBD-Me2的熱重分析（TGA）曲線如圖4D 所示，500 ℃以上由于框架分解，COF-TpBD-Me2的重量減少40%。

2.2 dSPE的條件優(yōu)化

2.2.1 吸附劑質(zhì)量濃度所有吸附優(yōu)化實(shí)驗(yàn)均在α-細(xì)辛醚質(zhì)量濃度為25 μg/mL 的樣品溶液中進(jìn)行，每個(gè)實(shí)驗(yàn)平行測定3次。如圖5A所示，當(dāng)吸附劑質(zhì)量濃度從0.3 mg/mL增加到0.9 mg/mL時(shí)，α-細(xì)辛醚的吸附率逐漸增加；隨著吸附劑質(zhì)量濃度的繼續(xù)增加，在0.9 ～1.1 mg/mL 范圍內(nèi)，α-細(xì)辛醚的吸附率變化不明顯。因此，后續(xù)實(shí)驗(yàn)采用吸附劑質(zhì)量濃度為0.9 mg/mL。

圖5 吸附劑質(zhì)量濃度（A）、吸附時(shí)間（B）、pH值（C）、解吸試劑（D）、解吸時(shí)間（E）的優(yōu)化Fig.5 Optimization of mass concentration of adsorbent（A），adsorption time（B），pH value（C），desorption solvent（D） and desorption time（E）

2.2.2 吸附時(shí)間吸附效率與吸附時(shí)間有關(guān)［32］，因此考察了吸附時(shí)間（10～180 min）對(duì)吸附效率的影響。如圖5B 所示，在10～30 min 內(nèi)，α-細(xì)辛醚的吸附率逐漸增加，30～180 min 時(shí)吸附效率趨于穩(wěn)定。因此選擇30 min為最佳吸附時(shí)間。

2.2.3 pH值考察了樣品pH值（3.0～11.0）對(duì)α-細(xì)辛醚吸附率的影響。從圖5C可以看出，pH值對(duì)α-細(xì)辛醚的吸附影響不大，pH 3.0～11.0 條件下的吸附效率均在90%以上。因此，在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中不調(diào)整樣品溶液的pH 值。α-細(xì)辛醚的吸附效率不受pH 值影響，可能是因?yàn)槠湓趬A性條件下發(fā)生了去質(zhì)子化反應(yīng)［33］，目標(biāo)分析物與COF-TpBD-Me2之間產(chǎn)生了靜電相互作用。

2.2.4 解吸試劑分別考察了甲醇、乙醇、乙腈、丙酮和四氫呋喃5 種有機(jī)溶劑作為解吸試劑的效果。如圖5D 所示，在相同的吸附和解吸條件下，乙腈的解吸效率最高。因此，使用乙腈作為解吸試劑。

2.2.5 解吸時(shí)間在10～120 min 內(nèi)進(jìn)行解吸實(shí)驗(yàn)，如圖5E 所示，60 min 時(shí)解吸效率達(dá)95%。為節(jié)省時(shí)間和提高效率，選擇后續(xù)實(shí)驗(yàn)的解吸時(shí)間為60 min。

2.3 COF-TpBD-Me2中α-細(xì)辛醚的吸附等溫線

為考察COF-TpBD-Me2對(duì)α-細(xì)辛醚的最大吸附能力，對(duì)不同質(zhì)量濃度（25～300 μg/mL）的α-細(xì)辛醚進(jìn)行吸附等溫實(shí)驗(yàn)。如圖6 所示，隨著α-細(xì)辛醚質(zhì)量濃度的增加吸附量逐漸增加，在質(zhì)量濃度250 μg/mL 時(shí)基本達(dá)到吸附平衡。根據(jù)公式（1）計(jì)算得COF-TpBD-Me2對(duì)α-細(xì)辛醚的最大吸附容量為214.77 mg/g。高吸附容量可歸因于吸附劑的高比表面積，豐富的結(jié)合位點(diǎn)以及氫鍵、范德華力和π-π 鍵等相互作用。平衡吸附量（Qe，mg/g）計(jì)算公式如下：

圖6 α-細(xì)辛酮在COF-TpBD-Me2上的吸附等溫線Fig.6 Adsorption isotherm of α-asarone on COFTpBD-Me2

式中，C0為初始濃度，Ce為平衡濃度，m為吸附劑質(zhì)量，V為溶液體積。

此外，為了確定可準(zhǔn)確描述COF-TpBD-Me2吸附過程的合適模型，使用Langmuir（公式（2））和Freundlich（公式（3））模型對(duì)等溫線數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合。

式中，Qe為平衡吸附量，Qm為最大吸附量，Ce為平衡溶液中α-細(xì)辛醚的濃度；KL和KF分別為朗繆爾常數(shù)和弗倫德里希常數(shù)，n為吸附劑的吸附親和力。

表1 為根據(jù)兩種模型計(jì)算所得到的參數(shù)，圖7 為兩種模型對(duì)吸附等溫線的擬合圖。結(jié)果表明，Langmuir 模型的相關(guān)系數(shù)（r2）大于Freundlich 模型。Langmuir 模型被廣泛用于模擬單層吸附過程，而Freundlich 模型主要用于描述多層吸附過程。該結(jié)果表明α-細(xì)辛醚在COF-TpBD-Me2上為單層吸附過程，且吸附的α-細(xì)辛醚具有均勻的結(jié)合位點(diǎn)，吸附能相等，吸附物質(zhì)之間沒有相互作用［34］。

表1 COF-TpBD-Me2對(duì)α-細(xì)辛醚的吸附等溫線參數(shù)Table 1 Adsorption isotherm parameters of α-asarone on COF-TpBD-Me2

圖7 Langmuir（A） 和 Freundlich（B） 模型擬合吸附等溫線Fig.7 The fitting adsorption isotherms by Langmuir （A） and Freundlich （B） models

2.4 吸附動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)

對(duì)α-細(xì)辛醚在COF-TpBD-Me2上的吸附動(dòng)力學(xué)進(jìn)行分析，確定吸附平衡時(shí)間。如圖8 所示，吸附容量在最初的30 min內(nèi)迅速增加，之后吸附容量無明顯變化，說明吸附達(dá)到平衡。快速的吸附速率可歸因于COF-TpBD-Me2較大的比表面積和孔隙率。采用擬一級(jí)和擬二級(jí)動(dòng)力學(xué)模型對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合，以考察α-細(xì)辛醚在COF-TpBD-Me2上的吸附行為。兩種模型公式如公式（4）和公式（5）所示：

圖8 α-細(xì)辛醚在COF-TpBD-Me2上的吸附動(dòng)力學(xué)曲線Fig.8 Adsorption kinetic curve of α-asarone on COF-TpBD-Me2

式中，Qe為平衡吸附量，Qt為α-細(xì)辛醚在t時(shí)刻的吸附量，t為吸附時(shí)間，K1為擬一級(jí)吸附速率常數(shù)，K2為擬二級(jí)吸附速率常數(shù)。

由擬一級(jí)（K1=0.011 min-1，r2=0.657）和擬二級(jí)（K2=0.009 g·mg-1·min-1，r2=0.999）動(dòng)力學(xué)模型擬合結(jié)果可知，擬二級(jí)動(dòng)力學(xué)模型的相關(guān)系數(shù)（r2）更大更適合描述α-細(xì)辛醚在COF-TpBD-Me2上的吸附過程。由于擬一級(jí)動(dòng)力學(xué)模型一般適用于速度較快的吸附過程，擬二級(jí)動(dòng)力學(xué)模型更適合復(fù)雜、多步的吸附過程［35-36］，因此α-細(xì)辛醚在COF-TpBD-Me2上的吸附是復(fù)雜多步過程。

2.5 方法驗(yàn)證

在最佳條件下，考察了熒光光譜法測定α-細(xì)辛醚的線性關(guān)系。結(jié)果顯示，α-細(xì)辛醚在0.1～10 μg/mL 范圍呈良好的線性關(guān)系，線性方程為y=2 849x+2 100（r2＞0.999），其中y為熒光強(qiáng)度，x為α-細(xì)辛醚的質(zhì)量濃度（μg/mL）。分別按照IUPAC標(biāo)準(zhǔn)計(jì)算檢出限（LOD，3σ）和定量下限（LOQ，10σ），得到α-細(xì)辛醚的LOD為0.002 5 μg/mL，LOQ為0.008 4 μg/mL。

通過在1 d 內(nèi)連續(xù)測定標(biāo)準(zhǔn)溶液6 次計(jì)算日內(nèi)相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD），通過在3 d 內(nèi)每天測定標(biāo)準(zhǔn)溶液3次計(jì)算日間RSD，得到日內(nèi)和日間RSD分別為2.0%和5.4%。

2.6 實(shí)際樣品測定

向“1.4”部分制備的α-細(xì)辛醚樣品溶液中加入人體血漿，并在最佳條件下進(jìn)行吸附實(shí)驗(yàn)，檢測洗脫液的熒光發(fā)射光譜。如圖9曲線a和曲線b所示，人體血漿的發(fā)射波長與α-細(xì)辛醚相近（λEM，α-細(xì)辛醚=365 nm，λEM，人體血漿=330 nm），導(dǎo)致在實(shí)際樣品中很難通過發(fā)射波長對(duì)兩者進(jìn)行區(qū)分，同時(shí)α-細(xì)辛醚的熒光強(qiáng)度也會(huì)受到人體血漿的影響（圖9 曲線c）。對(duì)人體血漿進(jìn)行吸附實(shí)驗(yàn)，結(jié)果在洗脫液中未檢出血漿的特征光譜（圖9 曲線e），結(jié)合圖9 曲線a 和曲線d 進(jìn)行分析可知，COF-TpBD-Me2能排除人體血漿干擾，選擇性富集和定量分析α-細(xì)辛醚。

圖9 α-細(xì)辛醚（a）、人體血漿（b）、人體血漿和α-細(xì)辛醚混合液（c）、混合液經(jīng)選擇性吸附后的洗脫液（d）、人體血漿洗脫液（e）的熒光發(fā)射光譜Fig.9 The fluorescence spectra of α-asarone（a），human plasma（b），the mixed solution of α-asarone and human plasma（c），eluate of the mixed solusion after selective adsorption（d），and eluate of human plasma after adsorption（e）

為了探究所建方法的實(shí)用性，進(jìn)行樣品加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)。分別將不同質(zhì)量濃度（1、5、15 μg/mL）的α-細(xì)辛醚加入人體血漿中，進(jìn)行吸附回收，每個(gè)濃度平行進(jìn)行3 次實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見表2。結(jié)果顯示，樣品的加標(biāo)回收率為92.2%～98.0%，RSD 小于4.0%。

表2 加標(biāo)人體血漿中α-細(xì)辛醚的回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（n=3）Table 2 Recoveries and RSDs of α-asarone in spiked human plasma（n=3）

為考察實(shí)際樣品中α-細(xì)辛醚的定量下限，在人體血漿中進(jìn)行0.1～0.5 μg/mLα-細(xì)辛醚加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)，得到α-細(xì)辛醚的回收率為80.7%～98.8%，RSD 為2.7%～5.3%。因此，α-細(xì)辛醚在人體血漿中的定量濃度可低至0.1 μg/mL。

2.7 吸附機(jī)理分析

通過計(jì)算得到α-細(xì)辛醚的分子大小為12.122 ? × 9.597 ? × 5.276 ?。人體血漿中含量最高的蛋白質(zhì)—人血清白蛋白（HSA）的分子大小為80 ? × 80 ? × 30 ?［37］，而COF-TpBD-Me2的孔徑為23 ?［9］。在吸附作用下，COF-TpBD-Me2的固有孔徑使得α-細(xì)辛醚分子可在其中進(jìn)行擴(kuò)散，但會(huì)阻止蛋白質(zhì)大分子的進(jìn)入［38］，以此實(shí)現(xiàn)對(duì)α-細(xì)辛醚分子的選擇性吸附。

3 結(jié) 論

本文建立了分散固相萃取/熒光檢測法對(duì)人體血漿中的α-細(xì)辛醚進(jìn)行定量檢測，以COF-TpBD-Me2為選擇性吸附劑富集人體血漿中微量α-細(xì)辛醚，可排除人體血漿對(duì)α-細(xì)辛醚的熒光干擾，實(shí)現(xiàn)α-細(xì)辛醚的定量分析。該方法在復(fù)雜生物樣品的預(yù)處理和定量分析方面具有廣闊的應(yīng)用前景。